原江鋒，胡金婉，王大紅,2，龔明貴，李佩艷

1河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471023；2東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥理科，南京 210002

連翹葉和連翹花為木犀科植物連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)的干燥葉和花，落葉灌木[1]。從入藥部位來看，最早記載是使用連翹的地上部分及根；自唐代后以連翹果實入藥；至今《中藥志》、《中國藥典》皆以木犀科連翹果實為連翹正品[2]。在中藥典籍中記載的連翹葉與連翹果實藥效極為相似，且現(xiàn)代化學(xué)角度發(fā)現(xiàn)連翹葉與果實在化學(xué)組成上也有較大的相似性[3]；有研究表明，就抗菌效果而言連翹葉優(yōu)于連翹的青翹和老翹[4]。連翹在生長期需要疏花，以增加后期果實坐果率和品質(zhì)，疏花導(dǎo)致連翹花被大量舍棄，造成了資源的浪費[5]，富含活性成分的連翹花[6]有待于進一步深入研究。

連翹資源分布廣泛，主產(chǎn)于河南、山西和陜西等地[7]。連翹葉花由于沒有進入《中國藥典》和《新資源食品管理辦法》，不是傳統(tǒng)中藥，所以對連翹葉花的研究并不完善。在河南、陜西等地有將連翹葉嫩芽[8]和連翹花[9]制成茶飲用的習(xí)慣，富含活性成分的連翹葉和連翹花只能作為一種農(nóng)產(chǎn)品在旅游景點和連翹主產(chǎn)區(qū)的部分市場上進行銷售。本實驗室已經(jīng)將連翹葉中主要活性成分的提取、分離和純化進行工藝優(yōu)化[10,11]，并分析了作為連翹主產(chǎn)區(qū)的河南和山西兩地的連翹葉中主要活性成分的差異[12,13]；報道了河南地區(qū)連翹花中主要的活性成分和穩(wěn)定性[14]，為連翹葉和連翹花更深入的研究提供了一定的研究基礎(chǔ)。

本實驗收集了5省的16批連翹葉和12批連翹花樣品，采用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)確定樣品中蘆丁、金絲桃苷、連翹酯苷A、連翹苷、齊墩果酸和熊果酸化合物，并測定這6種主要活性成分的含量，對測定結(jié)果進行主成分分析，探討不同產(chǎn)地連翹葉花主要活性成分的綜合差異，確定連翹葉花的質(zhì)量優(yōu)劣，旨在為連翹葉花資源的質(zhì)量評價和綜合利用提供理論指導(dǎo)，為其開拓應(yīng)用市場提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；HZK2064B鼓風(fēng)干燥箱(重慶漢瞻儀器有限公司)；BS-124S型萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DL-5-B粉碎機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 材料

甲醇、乙腈(均為色譜純)(美國Fisher化學(xué)試劑公司)；蘆丁(批號100080-201408)、金絲桃苷(批號111521-201507)、連翹酯苷A(批號111810-201304)、連翹苷(批號110821-201615)、齊墩果酸(批號110709-201206)、熊果酸(批號110742-201220)(中國食品藥品檢定研究院)；其他試劑均為分析純。

連翹葉(S1～S16)和連翹花(S17～S28)樣品，2017年采自河南、山西、陜西、山東、湖北，連翹花采摘于3月份左右，連翹葉采摘于4月份左右，剪取連翹的花和葉，放置陰涼通風(fēng)處干燥后裝于樣品袋中，樣品經(jīng)河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院侯小改教授鑒定為木犀科植物連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl)的葉和花。樣品于40 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎機粉碎，過40目篩，得連翹花和葉粉末。S1、S2、S3、S4、S5為河南盧氏、信陽、欒川、洛陽龍門、洛陽西工連翹葉，S6、S7為山西臨汾、太原連翹葉，S8、S9、S10為陜西太白、洛南、西安連翹葉，S11、S12、S13、S14為山東岱岳、泰安、平邑、日照連翹葉，S15、S16為湖北武漢、恩施連翹葉；S17、S18、S19、S20為河南盧氏、信陽、洛陽龍門、欒川連翹花，S21、S22、S23、S24為山西太原、臨汾和陜西太白、洛南連翹花，S25、S26、S27、S28為山東岱岳、泰安、平邑、日照連翹花。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定條件

液相條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，蘆丁、金絲桃苷、連翹酯苷A和連翹苷流動相Ⅰ為乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～5 min，5%→15%A；5～10 min，15%→20%A；10～20 min，20%→22%A；20～35 min，22%→70%A；36～46 min，95%A。流速0.8 mL/min，檢測波長275 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL；齊墩果酸和熊果酸流動相Ⅱ為甲醇-質(zhì)量分數(shù)1%磷酸水溶液(85∶15，V/V)，流速0.6 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：采用大氣壓電噴霧離子源(ESI)，負離子模式掃描，掃描范圍m/z=50～1000；毛細管電壓3.5 KV；破裂電壓85 V；氮氣壓力1.38×105Pa;干燥氣流速6 L/min；干燥氣溫度350 ℃。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁、金絲桃苷、連翹酯苷A和連翹苷標準品分別為10.8、7.0、10.0和16.3 mg，用甲醇溶解后定容于25 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得蘆丁、金絲桃苷、連翹酯苷A和連翹苷質(zhì)量濃度分別為0.43、0.28、0.40、0.65 mg/mL的混合對照品溶液Ⅰ。精密稱取齊墩果酸對照品13.5 mg，熊果酸對照品14.3 mg，用甲醇溶解后定容于25 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到齊墩果酸和熊果酸質(zhì)量濃度分別為0.54 mg/mL、0.57 mg/mL的混合對照品溶液Ⅱ。

2.3 供試品溶液的制備

精密秤定連翹葉(S1～S16)和連翹花粉末(S17～S28)1.00 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，密塞，稱定重量，浸漬3 h，超聲處理(250 W，40 kHz)40 min，放冷，再稱量，用70%甲醇補足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得供試品溶液，樣品平行處理三次。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液Ⅰ 0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，精密吸取混合對照品溶液Ⅱ 0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、5.00 mL，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，按“2.1”項下的色譜條件檢測，以對照品的峰面積為縱坐標(Y)，進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，得到線性回歸方程表(見表1)。

表1 回歸方程及線性范圍

2.4.2 精密度試驗

取編號為S2和S18樣品粉末各1份，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算RSD值。經(jīng)計算6種活性成分峰面積的RSD均在1.47%～1.85%之間，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取編號為S2和S18樣品粉末各1份，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，分別在0、1、2、5、10、24、48 h進行檢測，連續(xù)進樣6次，記錄相應(yīng)峰面積，計算RSD值。結(jié)果6種活性成分峰面積的RSD在1.35%～2.06%之間，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗

取編號為S2和S18樣品粉末各6份，每份精密稱定1.00 g，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣，記錄峰面積，并計算RSD值。經(jīng)計算6種活性成分含量的RSD在1.23%～2.18%之間，表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率試驗

采用加樣回收率試驗方法，精密稱取已知含量的同一連翹葉和花樣品各1.00 g，平行6份，分別精密加入一定量的對照品溶液分別進行超聲提取，過濾，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率和RSD值。經(jīng)計算6種活性成分的回收率在97.2%～104.1%之間，RSD在1.15%～1.86%之間，說明該方法有較好的準確度。

2.5 LC-MS分析

稱取連翹葉(S1～S16)和連翹花(S17～S28)粉末，按照按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下LC-MS條件進樣分析，根據(jù)質(zhì)譜圖譜確定連翹葉和連翹花樣品中6個待測化合物(圖1)；根據(jù)紫外檢測器測定的峰面積，用外標法計算出蘆丁、金絲桃苷、連翹酯苷A、連翹苷、齊墩果酸和熊果酸的含量。

通過對連翹葉(S1～S16)和連翹花(S17～S28)的指紋圖譜(圖2和圖3)分析表明，不同產(chǎn)地的連翹葉花在化學(xué)組成上基本相似。連翹葉(S1～S16)活性成分含量測定結(jié)果(見表2)，顯示蘆丁含量在0.47～2.84 mg/g之間，金絲桃苷含量在0.42～15.43 mg/g之間，連翹酯苷A含量在0～53.22 mg/g之間，連翹苷含量在12.45～45.72 mg/g之間，齊墩果酸含量在1.26～6.28 mg/g之間，熊果酸含量在5.68～23.02 mg/g之間。連翹花(S17～S28)活性成分含量測定結(jié)果(見表3)顯示蘆丁含量在0～2.68 mg/g之間，金絲桃苷含量在0.92～21.38 mg/g之間，連翹酯苷A含量在0～20.61 mg/g之間，連翹苷含量在3.03～28.58 mg/g之間，齊墩果酸含量在1.56～4.29 mg/g之間，熊果酸含量在5.83～10.50 mg/g之間。綜上可知，不同產(chǎn)地的連翹葉花在化學(xué)組成上基本相似，但主要活性成分含量差異較大。

次生代謝產(chǎn)物是以初生代謝產(chǎn)物的中間產(chǎn)物作為底物的代謝物，是植物適應(yīng)生態(tài)環(huán)境、謀求生存的需要[15]。雖為同一品種，由于氣候條件的差異，連翹葉和連翹花的次生代謝產(chǎn)物的含量也不同。從28批樣品中發(fā)現(xiàn)：蘆丁、金絲桃苷、連翹酯苷A、連翹苷、齊墩果酸和熊果酸在連翹葉和連翹花中均有分布，但含量不同；除了山西臨汾和山東平邑的連翹花，其余26批連翹樣品中均檢測到黃酮化合物蘆丁，28批樣品中均檢測到金絲桃苷，并且不同產(chǎn)地的樣品中金絲桃苷含量變化范圍的高于蘆丁含量的變化范圍，說明金絲桃苷的地域差異性比蘆丁明顯?！吨袊幍洹芬赃B翹苷和連翹酯苷A的含量作為連翹質(zhì)量控制指標，規(guī)定連翹藥材中連翹酯苷A的含量不得低于2.50 mg/g，連翹苷含量不得低于1.50 mg/g[16]。本研究發(fā)現(xiàn)連翹葉和連翹花所有樣品中連翹苷的含量高于藥典中對連翹果實的限定標準；28批樣品中連翹酯苷A的含量具有明顯的地區(qū)差異性，并且陜西西安和山西臨汾的連翹葉、山東平邑的連翹花中連翹酯苷A的含量遠遠高于藥典中對連翹果實的限定標準，而洛陽龍門和山東泰安的連翹葉和連翹花中沒有檢出連翹酯苷A的存在；同一地區(qū)連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A的含量基本高于連翹花，也有相關(guān)文獻報道過連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A的含量高于連翹其他部位的有效成分的積累[17-19]，這與本實驗所測樣品的結(jié)果趨勢相同。28批連翹葉花樣品中均檢測到較高的熊果酸和齊墩果酸的含量，并且熊果酸含量均高于齊墩果酸含量，這與Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)連翹葉中熊果酸含量高于齊墩果酸研究結(jié)果一致。

藥用植物在環(huán)境脅迫條件下，生長速率下降，初生代謝產(chǎn)物降低，但是次生代謝產(chǎn)物含量提高。本實驗還發(fā)現(xiàn)山西臨汾連翹葉、陜西西安連翹葉和河南欒川連翹花中6種活性成分含量均較高，說明這三個地區(qū)在連翹初生長的階段氣候條件較差，連翹為了抵抗不良生態(tài)環(huán)境，因此有較多的次生代謝物的積累。山東地區(qū)連翹花中黃酮化合物金絲桃苷的含量普遍較高；山西臨汾連翹花中蘆丁、金絲桃苷、齊墩果酸含量均為最低，但是山西臨汾連翹葉蘆丁、金絲桃苷、齊墩果酸的含量是連翹葉樣品中含量最高的，這可能與先花后葉的連翹生長過程中次生代謝產(chǎn)物在不同部位的累積量有關(guān)[21]。

圖1 6個待測化合物質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of 6 components to be determined

圖2 連翹葉HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of F.suspensa leaves注：A：M1.混合對照品Ⅰ色譜圖；S1～S16.連翹葉樣品色譜圖；1.蘆丁；2.金絲桃苷；3.連翹酯苷A；4.連翹苷。B：M2.混合對照品Ⅱ色譜圖；S1～S16.連翹葉樣品色譜圖；1.齊墩果酸；2.熊果酸。Note:A:M1.Chromatogram of mixed standards Ⅰ;S1～S16.Chromatogram of the leaves of F.suspensa;1.Rutin;2.Hyperoside;3.Forsythiaside A;4.Forsythin.B:M2.Chromatogram of mixed standards Ⅱ;S1～S16.Chromatogram of the leaves of F.suspensa;1.Oleanolic acid;2 Ursolic acid.

圖3 連翹花HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of F.suspensa flowers注：A：M1.混合對照品Ⅰ色譜圖；S17～S28.連翹花樣品色譜圖；1.蘆??；2.金絲桃苷；3.連翹酯苷A；4.連翹苷。B：M2.混合對照品Ⅱ色譜圖；S17～S28.連翹花樣品色譜圖；1.齊墩果酸；2.熊果酸。Note:A:M1.Chromatogram of mixed standards Ⅰ;S17～S28.Chromatogram of the flowers of F.suspensa;1.Rutin;2.Hyperoside;3.Forsythiaside A;4.Forsythin.B:M2.Chromatogram of mixed standards Ⅱ;S17～S28.Chromatogram of the flowers of F.suspensa;1.Oleanolic acid;2.Ursolic acid.

2.6 主成分分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件對連翹葉(S1～S16)和連翹花(S17～S28)中6種活性成分的HPLC含量測定結(jié)果進行主成分分析，以初始特征值大于1為提取標準[22]。連翹葉(S1～S16)結(jié)果顯示主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的累積貢獻率達到78.45%，表明前兩個主成分代表了樣品組分的大部分信息，可用這2個主成分對連翹葉進行綜合評價，同時成分矩陣結(jié)果顯示(見表4)，對PC1貢獻較大的是蘆丁、金絲桃苷、連翹酯苷A、齊墩果酸和熊果酸，對PC2貢獻較大的是連翹苷。根據(jù)2個主成分(PC1和PC2)得分，以各主成分的方差貢獻率作為權(quán)重，進行線性加權(quán)，構(gòu)建連翹葉質(zhì)量評價函數(shù)H=0.609 76×PC1+0.174 75×PC2，得出各產(chǎn)地連翹葉的綜合評分值H(見表5)，分值越高表示該品種相對越好[23]。結(jié)果顯示S6山西臨汾、S10陜西西安和S2河南信陽連翹葉綜合評價較好，S12山東泰安和S16湖北恩施連翹葉綜合評價較差。

表2 連翹葉中6種活性成分含量

表3 連翹花中6種活性成分含量

連翹花(S17～S28)結(jié)果顯示主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的累積貢獻率達到75.87%，可用這2個主成分對連翹花進行綜合評價，成分矩陣結(jié)果顯示(見表6)，對PC1貢獻較大的是蘆丁、連翹苷、齊墩果酸和熊果酸，對PC2貢獻較大的是連翹酯苷A和金絲桃苷。根據(jù)2個主成分(PC1和PC2)得分，進行線性加權(quán)，構(gòu)建連翹花質(zhì)量評價函數(shù)H=0.462 56×PC1+0.296 10×PC2，得出各產(chǎn)地連翹花的綜合評分值H(見表7)。結(jié)果顯示S20河南欒川、S27山東平邑和S28山東日照連翹花綜合評價較好；S22山西臨汾、S24陜西洛南連翹花綜合評價較差。

3 結(jié)論

3.1 色譜條件方法學(xué)考察

在色譜條件下測定結(jié)果顯示6種活性成分的線性關(guān)系良好；精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD均小于3%；加樣回收率為97.2%～104.1%，RSD在1.15%～1.86%。

3.2 不同產(chǎn)地連翹葉花的差異性

本實驗采用LC-MS技術(shù)結(jié)合主成分分析，分析不同產(chǎn)地連翹葉花中6種主要活性成分含量的差異性。不同產(chǎn)地的連翹葉花化學(xué)組成基本相似，但主要活性成分含量差異較大。

表4 連翹葉的成分矩陣

表5 不同產(chǎn)地連翹葉綜合得分值

表6 連翹花的成分矩陣

表7 不同產(chǎn)地連翹花綜合得分值

連翹葉花的主成分分析的結(jié)果顯示，山西臨汾、陜西西安和河南信陽的連翹葉綜合評價較好；河南欒川、山東平邑和山東日照連翹花綜合評價較好，差異性是否與連翹的生長環(huán)境和土壤條件等因素有關(guān)，有待于進一步考察。

3.3 連翹葉花中主要活性成分的研究意義

本研究為完善連翹葉花的綜合開發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)和參考。對于富含連翹苷、連翹酯苷A的連翹葉，能否代替連翹果實或者與果實合并用藥提供實驗依據(jù)，并且連翹葉可作為黃酮類、三萜酸類和木脂素類化合物提取的原材料。連翹花中連翹苷和連翹酯苷A的含量略低于連翹葉，但是連翹花中富含蘆丁、金絲桃苷等黃酮類化合物和齊墩果酸、熊果酸等三萜酸類化合物，也具有較大的開發(fā)價值。本研究對于具有良好開發(fā)前景的天然抗氧化劑、保健食品及生物藥品基料的連翹葉和連翹花的資源利用具有一定的指導(dǎo)意義。