李澤宇，張 志，邱天藝，劉振偉，張哲棟，高思禹，徐利劍

黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080

極端環(huán)境微生物是新穎天然產(chǎn)物的重要來源[1,2]，近年來對低溫環(huán)境真菌的研究也越來越多[3,4]。低溫環(huán)境真菌可以分為嗜冷真菌與耐冷真菌。嗜冷真菌是指0 ℃以下可以生長，最適生長溫度低于15 ℃、但20 ℃不能生長的真菌；耐冷真菌是在低溫下可以生長繁殖，最適生長溫度高于20 ℃的菌株[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)，這兩類來自低溫環(huán)境的真菌可以產(chǎn)生獨特的天然產(chǎn)物。例如，Dalsgaard等[7]從低溫地區(qū)分離得到的一株青霉屬耐冷真菌，可以產(chǎn)生獨特的代謝產(chǎn)物并對P338細胞表現(xiàn)出中度抑制活性。Lu等[8]從南極嗜冷真菌Chrysosporiumsp.C3438中首次分離得到化合物高鐵色素(ferrichrome)；Li等[9]從南極洲地區(qū)分離得到耐冷真菌Geomycessp.[10]，并成功分離得到8個曲地酸(asterric acid)衍生物，其中有5個是新化合物。Ren等[11]從南極企鵝島海洋沉積物中分離得到木霉屬真菌Trichodermaasperellum，成功分離得到6個新的peptaibols類化合物。Zhang等[12]報道了低溫型真菌抗腫瘤活性次級代謝產(chǎn)物研究進展，許多真菌的次級代謝物具有成藥潛力。由此可見，低溫環(huán)境真菌是一類重要的天然產(chǎn)物來源。

本研究嘗試研究大興安嶺多年凍土中的可培養(yǎng)真菌。多年凍土又稱永久凍土，指那些持續(xù)兩年或者兩年以上的凍結(jié)不融化的土層[13]，是研究低溫環(huán)境真菌的相對穩(wěn)定的材料，我國的多年凍土主要分布于青藏高原與大興安嶺[14]。因為多年凍土區(qū)采樣不方便，真菌分離困難，目前對我國多年凍土中可培養(yǎng)真菌的研究較少，主要集中在青藏高原多年凍土區(qū)[15]；尚未發(fā)現(xiàn)對大興安嶺多年凍土真菌的相關(guān)報道。本研究以大興安嶺多年凍土為研究材料，嘗試分離其中可培養(yǎng)的真菌，測試它們產(chǎn)生的天然產(chǎn)物的活性，篩選到具有開發(fā)潛力的可培養(yǎng)真菌，為進一步利用凍土真菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在大興安嶺多年凍土區(qū)進行采樣，一共分為8個地點(見表1)，采樣深度為2 m，每10 cm為一個樣品，凍土取出后立即放入滅菌采樣盒中，待采樣結(jié)束后將樣品帶回實驗室，保藏于-80 ℃冰箱中。

表1 大興安嶺采樣地點

1.2 儀器和試劑

儀器：超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司、SW-CJ-ID)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海東亞壓力容器制造有限公司、YXQ-LS-100A)、恒溫全培養(yǎng)搖床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司、QYC-2102)、PCR儀(Applied Biosystems、Veriti96)、生化培養(yǎng)箱(上海博訊有限公司、BIC-250)、紫外分析儀(上海文錦儀器有限公司、ZF-105)、冷卻水循環(huán)裝置(上海愛朗科技有限公司、CA-1115A)、真空水式循環(huán)泵(鄭州博科儀器有限公司、SHZ-D)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮儀器公司、RE-52AA)、高效薄層板(Merck公司)。

試劑：硫酸鏈霉素、鹽酸金霉素、兩性霉素B、煙酰胺、二甲基亞砜、乙酸乙酯、甲醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、剛果紅(抗生素均為USP級、化學(xué)試劑為分析純)。

1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水定容至1 L，(分離真菌時加入200 mg硫酸鏈霉素)。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、加水定容至1 L。LB瓊脂培養(yǎng)基(luria bertani agar，LB)：氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、瓊脂15 g，加水定容至1 L。小麥固體培養(yǎng)基：甘油2 g、酵母浸粉2 g、酒石酸鈉10 g、磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂1 g、七水硫酸亞鐵0.05 g。酵母浸提物蔗糖培養(yǎng)基(yeast extract sucrose medium，YES)：酵母浸粉20 g、七水硫酸鎂0.5 g、蔗糖150 g、七水硫酸鋅0.01 g、五水硫酸銅0.005 g；水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂30 g，加水定容至1 L。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC-Na)：羧甲基纖維素鈉15 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂0.2 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、瓊脂20 g，定容至1 L。

1.4 真菌的分離與純化

分離方法采用改良的顆粒涂布平板法[16]：在室溫下將凍土融化，稱取10 g凍土，粉碎后過篩，稱取1 g凍土顆粒加入到10 mL離心管中，加入滅菌水，定容至10 mL。用移液槍分別吸取25至600 μL不同量的凍土懸浮液，加入到稀釋4倍的PDA分離平板上，將顆粒用三角棒均勻涂抹在分離培養(yǎng)基上。室溫下培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后挑出，轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基下純化，得到純化菌株后，用打孔器打菌餅，放入盛有20%甘油溶液的凍存管中，分別保存于-20 ℃和-80 ℃冰箱中。

1.5 真菌的分子鑒定

采用CTAB法[16]提取真菌的總DNA，保存于-20 ℃。真菌的分子鑒定選用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)[17]。擴增引物分別是ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，擴增體系和擴增條件[18]見表2、表3。

表2 PCR擴增體系

表3 PCR擴增條件

將所得的真菌ITS序列的PCR原液進行測序，測序選用ITS1與ITS4兩個引物。比對兩個引物的測序結(jié)果并進行修正，刪除不可信序列，得到可信的序列，然后利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)與GenBank中的序列進行比對。

1.6 提取物的制備

將待發(fā)酵的菌株用滅菌打孔器打3個菌餅放入20 mL種子發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25 ℃下，轉(zhuǎn)速180 rpm，培養(yǎng)3天。固體發(fā)酵：將1 mL的種子發(fā)酵液，加入至含有100 mL固體培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中，室溫下培養(yǎng)14天。液體發(fā)酵：將0.5 mL的種子發(fā)酵液加入至含有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，轉(zhuǎn)移至搖床中培養(yǎng)，設(shè)置搖床條件為25 ℃、180 rpm，培養(yǎng)周期14天。發(fā)酵培養(yǎng)基分別為PDB培養(yǎng)基、PDB煙酰胺(100 mg/L)培養(yǎng)基、小麥固體培養(yǎng)基、YES培養(yǎng)基四種。發(fā)酵結(jié)束后分別加入2倍體積乙酸乙酯并充分搖勻，靜置1天后，減壓濃縮得到提取物。加入2 mL的DMSO，制備成提取物溶液，放置于4 ℃冰箱備用。

1.7 生長速率測定

將8株相似性≤97%的菌株活化，分別取6 mm菌餅接入PDA培養(yǎng)基中，分別在4、15、25 ℃條件下培養(yǎng)觀察(每個溫度下3次重復(fù))，利用十字交叉法測量菌落直徑并記錄，周期14天。

1.8 活性測定

1.8.1 抗菌活性測定

針對細菌和酵母類真菌采用雙層平板打孔藥劑擴散法，針對絲狀真菌采用單層平板打孔藥劑擴散法[19]。雙層平板打孔藥劑擴散法操作步驟為：在無菌培養(yǎng)皿中倒入30 g/L的水瓊脂25 mL，待下層培養(yǎng)基凝固后，倒入含有病原菌的培養(yǎng)基25 mL，待上層培養(yǎng)基凝固后，用無菌打孔器在上層平板均勻打5個孔，分別加入對照和真菌100 mg/L提取物溶液。按照數(shù)字順序依次加入相對應(yīng)的粗取物，并在培養(yǎng)皿上標明病原菌名稱和時間，放入25 ℃培養(yǎng)箱中觀察，測量抑菌圈大小并做好數(shù)據(jù)記錄。單層平板打孔藥劑擴散法操作步驟為：在PDA培養(yǎng)基上均勻打6孔，標記方法同上，依次加入真菌100 mg/L提取物溶液，然后將病原菌菌餅接入到培養(yǎng)皿正中心，放入25 ℃培養(yǎng)箱中觀察，測量真菌的生長情況并記錄。

1.8.2 抗氧化活性測定

參照Han等[20]方法采用DPPH-TLC法活性測定對真菌的提取物抗氧化活性進行了初步測定，具體操作如下：稱取0.1 g的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，溶解于50 mL的甲醇中，配置成DPPH甲醇溶液，同時用甲醇溶液配制5 mg/mL的真菌提取物溶液，裁剪合適的薄層鋁板，用鉛筆輕輕劃出1 cm×1 cm網(wǎng)格線，用移液槍吸取5 μL發(fā)酵液點樣，待薄層板干燥后在254和365 nm的紫外燈下觀察，隨后噴灑DPPH進行抗氧化活性測定，顯色后立即拍照并記錄。

1.8.3 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

參照Zhang等[21]對產(chǎn)纖維素酶低溫真菌的方法， 用打孔器將活化后的菌株打孔成5 mm菌餅，接種于CMC-Na平板中央，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)四天后，用1 mg/mL剛果紅染液鋪滿整個培養(yǎng)皿染色1小時，棄去剛果紅染液，用無菌水清洗至無色，再加入1 mol/L NaCl溶液脫色1小時。觀察菌落附近是否有脫色圈，記錄脫色圈直徑以及菌株的菌落直徑。將脫色圈直徑記為D，菌株直徑記為d，用D/d數(shù)值表明該菌株的降解效果。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

菌落直徑、抑菌圈大小、脫色圈大小來自三次試驗重復(fù)。應(yīng)用Excel 2019進行平均值與標準差計算，利用SPSS 25.0計算單因素方差分析及利用Duncan檢驗法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍土真菌鑒定結(jié)果

在凍土樣品中分離到66株真菌，對它們的ITS序列進行分析(表4)。這66株真菌隸屬于3個門(Ascomycota、Basidiomycota、Mucoromycota)、29個科(Aspergillaceae、Bionectriaceae、Cladosporiaceae、Clavicipitaceae、Cordycipitaceae、Cucurbitariaceae、Debaryomycetaceae、Dermateaceae、Didymosphaeriaceae、Exobasidiaceae、Gjaerumiaceae、Gloeotinia、Hyaloscyphaceae、Lasiosphaeriaceae、Lipomycetaceae、Mycosphaerellaceae、Myxotrichaceae、Nectriaceae、Ophiocordycipitaceae、Phaeosphaeriaceae、Plectosphaerellaceae、Polyporaceae、Pseudeurotiaceae、Sarocladiaceae、Schizophyllaceae、Stachybotryaceae、Trichocomaceae、Umbelopsidaceae、Ustilaginaceae)，其中優(yōu)勢科Cordycipitaceae和Nectriaceae 占15.2%。這66株真菌隸屬于55個分類單元。菌株ITS相似性在99%及以上的有56株，菌株相似性在98%的有2株；另外有8株相似性≤97%，分別是菌株FSF006、FSF015、FSF021、FSF025、FSF028、FSF029、FSF042與FSF065；它們ITS序列的GenBank登錄號分別是MK192899、MK192902、MN491895、MK192903、MN491896、MN491897、MN491898與MN491899；它們的菌落圖片見圖1。Cai[10]研究了中國寒冷高原地帶的土壤樣品中的真菌，發(fā)現(xiàn)主要優(yōu)勢菌株是Geomyces和Pseudogymnoascus這兩個屬真菌。本次研究也分離得到了Pseudogymnoascus屬真菌，證明不同地區(qū)的凍土真菌類群存在著一定的相似性。本研究中，大興安嶺多年凍土中分離得到多株真菌，研究中發(fā)現(xiàn)的8株真菌的菌絲都不發(fā)達，可是能適應(yīng)低溫環(huán)境的一種表現(xiàn)。

2.2 抗菌活性測定結(jié)果

以8株相似性≤97%菌株的四種不同培養(yǎng)基提取物為研究對象，進行了抗菌活性測定。供試細菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)、青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)，供試真菌為隱球菌(Cryptococcussp.)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)，立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)。測定結(jié)果見表5a和5b。

圖1 大興安嶺多年凍土篩選到的真菌菌落照片F(xiàn)ig.1 Colonies of fungal strains from permafrost in Greater Khingan Mountains注：A～H分別代表菌株FSF006、FSF015、FSF021、FSF025、FSF028、FSF029、FSF042、FSF065菌落正反面照片。Note:A-H mean front and reverse fungal colonies of FSF006,FSF015,FSF021,FSF025,FSF028,FSF029,FSF042 and FSF065,respectively.

表4 多年凍土真菌ITS序列相似性分析

續(xù)表4(Continued Tab.4)

編號No.菌株號Strain no.最相近菌種Closest strain登錄號*Accession*覆蓋度*Cover*(%)相似性*Similarity*(%)39FSF039Beauveria bassianaMG55428610010040FSF040Simplicillium lanosoniveumKT87833410010041FSF041Phoma herbarumMH85835910010042FSF042Podospora glutinansKT2248601009643FSF043Plectosphaerella cucumerinaJX4318881009944FSF044Talaromyces amestolkiaeMH85820210010045FSF045Phaeosphaeria oryzaeMG8132291009946FSF046Cladosporium cladosporioidesMK01241610010047FSF047Fusarium avenaceumMK20457710010048FSF048Neosetophoma guiyangensisMH01813410010049FSF049Talaromyces amestolkiaeMH85639510010050FSF050Acremonium fusidioidesMF07722010010051FSF051Schizophyllum commune MG91699910010052FSF052Meyerozyma guilliermondiiMK26775610010053FSF053Aspergillus versicolorMG30969510010054FSF054Tolypocladium cylindrosporumMG22838110010055FSF055Gloeotinia sp.MK26776710010056FSF056Cadophora malorumMF782737939957FSF057Nectria sp.MK4610331009958FSF058Verticillium sp.KY47166910010059FSF059Simplicillium cylindrosporumMK36772810010060FSF060Cistella albidoluteaJN0334291009861FSF061Cadophora orchidicolaKX44015610010062FSF062Talaromyces verruculosusMK36775310010063FSF063Cosmospora stegonsporii NR_1598681009964FSF064Tolypocladium inflatumMH86443910010065FSF065Ophiopogon sp.MK2052941009066FSF066Cordyceps farinoseMH864784100100

注：*最相近菌株的GenBank的登錄號。

Note：*means the closest fungal strain’s GenBank accession numbers.

表5a 凍土真菌發(fā)酵提取物的抗菌活性

續(xù)表5a(Continued Tab.5a)

菌株號Strain no.抑菌圈直徑Inhibition zone diameter(cm)金黃色葡萄球菌S.aureus水稻黃單胞菌X.oryzae青枯勞爾氏菌R.solanacearum隱球菌Cryptococcus sp.PNIWYPNIWYPNIWYPNIWYFSF025----------------FSF0282.63±0.03e2.63±0.03e-2.07±0.03g3.43±0.03b3.53±0.03a-3.07±0.03c3.03±0.03c3.06±0.03c-2.50±0.00f----FSF029----------------FSF042----------------FSF065----------------

注：“-”：無活性；P：PDB發(fā)酵；NI：PDB中加入煙酰胺發(fā)酵；W：小麥固體發(fā)酵；Y：YES發(fā)酵；數(shù)據(jù)為抑菌圈平均值(平均值±標準差，P<0.05)，不同字母表示差異顯著，下同。

Note：“-” :inactivity;P:PDB medium;NI:PDB medium with nicotinamide;W:wheat solid medium;Y:YES medium;the data are the average diameters of inhibition zones (Mean±SD,P<0.05),different letters mean significant difference,the same below.

表5b 凍土真菌發(fā)酵提取物的抗菌活性

以上8株真菌中，菌株FSF025和FSF042對供試病原菌未見明顯抑菌活性。其它6株真菌(FSF006、FSF015、FSF021、FSF028、FSF029和FSF065)表現(xiàn)了不同的抗菌活性，并針對每一種病原菌都至少有一株具有抗菌活性的真菌。菌株FSF028對除隱球菌外的其他6株病原菌都出現(xiàn)了肉眼可見抑菌圈(0.43～3.53 cm)。而且對金黃色葡萄球菌、青枯勞爾氏菌、水稻黃單胞菌和立枯絲核菌的活性較強(圖2-4)。

2.3 抗氧化活性測定結(jié)果

選用清除DPPH自由基法測定了8株相似性≤97%菌株的四種培養(yǎng)基發(fā)酵提取物的活性。在紫外254和365 nm的顯色效果如圖3a和3b，菌株FSF042的4種培養(yǎng)基發(fā)酵物都具有一定的DPPH自由基清除能力，各菌株對自由基的清除能力強弱如圖3c，詳細結(jié)果見表6。

實驗結(jié)果顯示8株真菌的小麥固體培養(yǎng)基提取物都有活性，但活性強弱表現(xiàn)了一定差異。發(fā)現(xiàn)該對照提取物(不加真菌的小麥固體培養(yǎng)基)具有較弱的抗氧化活性，不排除是所用小麥有農(nóng)藥或抗氧化劑的殘留。其它三種培養(yǎng)基對照提取物沒有表現(xiàn)抗氧化活性，根據(jù)這三種培養(yǎng)基發(fā)酵的結(jié)果，確定具有抗氧化活性的菌株是FSF006、FSF015、FSF021、FSF029、FSF042、FSF065，其中菌株FSF042(最相近菌為Podosporaglutinans)有較強的抗氧化活性。FSF006菌株的抗氧化活性的發(fā)現(xiàn)，首次揭示Seltsamia屬真菌具有抗氧化活性的能力。Seltsamia菌屬是在2017年建立的新屬[22]，Seltsamiasp.FSF006菌株的發(fā)現(xiàn)，對Seltsamia屬進一步深入研究提供了備選菌株。

2.4 生長速率測定結(jié)果

通過在4、15、25 ℃三種溫度下[10]，利用十字交叉法測量8株真菌菌落的生長情況，篩選到5株耐冷真菌(4 ℃可以生長)，分別是FSF006、FSF015、FSF025、FSF029、FSF042。它們在三種溫度下的生長速度見表7。這5株真菌在25 ℃生長速率最快，15 ℃生長速率次之，4 ℃生長速率最慢。這5株耐冷真菌的最相近菌屬中，有3個屬是首次在凍土中分離得到，分別是Seltsamia(ITS相似性97%)、Paraphaeosphaeria(95%)、Podospora(96%)。研究發(fā)現(xiàn)這5株耐冷真菌在抗菌、抗氧化及降解纖維素方面分別表現(xiàn)出了活性。

圖3 凍土真菌提取物的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activities of fungal extracts from permafrost注：a：紫外254 nm；b：紫外365 nm；c：DPPH顯色結(jié)果。Note:a:UV 254 nm;b:UV 365 nm;c:DPPH results.

表6 凍土真菌發(fā)酵提取物的抗氧化活性

注：“+”的個數(shù)代表抗氧化活性的強弱，“+++”代表全部褪色、“++”代表部分褪色、“+”代表微弱可見褪色、“-”代表無活性。

Note：The number of “+” represents fading situation,“+++” represents complete fading,“++” represents partial fading,“+” represents weak and visible fading,“-” represents inactivity.

表7 不同溫度下耐冷真菌的生長

注：數(shù)據(jù)為菌落生長速率平均值(平均值±標準差，P<0.05)，同列不同字母表示差異顯著，下同。

Note：The data are the average growth rates of fungi (mean±SD,P<0.05)，the different letters in the same column mean significant difference,the same below.

2.5 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩結(jié)果

利用剛果紅染色法對8株相似性≤97%的菌株進行了降解纖維素的分析，篩選到4株具有降解纖維素能力的菌株(圖3)，分別是FSF006、FSF015、FSF025、FSF029，菌株脫色圈和菌落直徑大小如表8，其中菌株FSF029降解纖維素的能力較強。這4株菌的菌落形態(tài)特點如下：菌株FSF006菌落正面成輪紋狀，顏色從內(nèi)到外由灰色變?yōu)榘咨?，菌落背面也成輪紋狀，顏色從內(nèi)到外由黑色變?yōu)榘咨痪闒SF015正面褐色有褶皺，菌絲不發(fā)達，背面黑色；菌株FSF025菌落正面成輪紋狀，內(nèi)圈粉色外圈白色，最中心有明顯的褶皺，菌絲較發(fā)達，背面從內(nèi)到外依次是褐色、黃色和白色；菌株FSF029正面背面都是

雪白色，中心有輕微的褶皺，菌絲較發(fā)達。

本次研究發(fā)現(xiàn)的4株具有降解纖維素能力的真菌，都屬于耐冷真菌，其中三株在15 ℃下的生長速率都超過1.2 mm/d。它們的最相近菌屬分別為鐮刀屬(Fusarium)、Seltsamia屬、Trimmatostroma屬與Paraphaeosphaeria屬。其中鐮刀屬、Trimmatostroma屬與Paraphaeosphaeria屬真菌曾經(jīng)被報道過具有纖維素降解活性[23-25]，而尚未發(fā)現(xiàn)Seltsamia屬真菌具有纖維素降解能力。目前降解纖維素酶的最適溫度是45～65 ℃，而低溫降解纖維素酶的最適溫度是15～25 ℃[26]；因此發(fā)現(xiàn)具有纖維素降解能力的低溫真菌，可能具有一定的應(yīng)用前景。

圖4 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選Fig.4 Screening of cellulase producing fungal strains

表8 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

注：脫色圈、菌落直徑及直徑比(平均值±標準差，P<0.05)。

Note：D,d and D/d (mean±SD,P<0.05).

3 討論與結(jié)論

外擔子菌FSF028號菌株代謝物具有較好的抗菌活性，在外擔子菌屬(Exobasidium)真菌中曾被分離到2個抗菌化合物cryptosporin和2-hydroxy-3-phenylpropanoic acid[27,28]，但FSF028菌的最相近菌E.japonicum尚未見有關(guān)抗菌化合物的報道。

柄孢殼菌FSF042號菌株代謝物具有較好的抗氧化活性，目前在柄孢殼菌屬(Podospora)真菌中已經(jīng)分離了34個天然產(chǎn)物，其中不乏抗菌化合物[29-31]，例如decipinin A、curvicollides A、appenolide B等。尚未見該屬單體化合物的清除自由活性的報道。但Dong等[32]分離培養(yǎng)的柄孢殼菌S29、S32與S66(Podosporasp.S29，Podosporasp.S32與Podosporasp.S66)的提取物具有DPPH自由基清除的能力，證明柄孢殼菌屬真菌具有抗氧化活性。

鐮刀菌FSF029號菌株具有較好的纖維素降解活性,目前在鐮刀菌屬真菌中分離到600多個化合物；降解纖維素方面，尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄鐮刀菌(F.solani)、厚垣鐮刀菌(F.chlamydosporum)與串珠鐮刀菌(F.moniliforme)曾經(jīng)被報道過具有降解纖維素活性[33-36]，且發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌對植物的致病性可能與其纖維素降解酶有關(guān)[37]。FSF029的最相近菌為F.domesticum，尚未見有關(guān)F.domesticum降解纖維素的報道。

本研究首次對大興安嶺多年凍土中的可培養(yǎng)真菌進行了天然產(chǎn)物活性的研究，分離得到66株可培養(yǎng)真菌，其中含有8株相似性≤97%的菌株，其中FSF028號菌株、FSF042號菌株與FSF029號菌株分別表現(xiàn)了較強的生物活性。此外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)了Seltsamia屬真菌具有纖維素降解活性，其代謝物具有抗氧化活性。綜上所述，本研究為進一步開發(fā)利用多年凍土的真菌資源打下了基礎(chǔ)。