中藥防風(fēng)抗流感病毒活性及不同極性部位的譜效相關(guān)性分析

姜曉琳，張繼秋，徐瑞蕊，蔣明浩，亢倩麗，楊 勇，鞏麗麗*

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，濟(jì)南 250355

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)未抽花莖的干燥根。味辛、甘，微溫，歸膀胱、肝、脾經(jīng)，有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效[1,2]。防風(fēng)的化學(xué)成分主要包括色原酮類、香豆素類、有機(jī)酸、多糖類等[3,4]。Yao等[5]通過(guò)研究白芷、防風(fēng)、紫蘇葉單味藥材及配伍體外對(duì)呼吸道核胞病毒的影響，結(jié)果證明防風(fēng)具有抗呼吸道核胞病毒的活性，且與紫蘇配伍后效果顯著，但是關(guān)于其單一味藥抗病毒活性的藥效成分及作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)欲采用CPE法證實(shí)防風(fēng)單味藥的抗流感病毒活性及其抗流感病毒活性成分。近年來(lái)指紋圖譜技術(shù)用于中藥研究非常廣泛，能夠?qū)χ兴帍?fù)雜的化學(xué)成分進(jìn)行表征，但是無(wú)法體現(xiàn)與藥效的關(guān)聯(lián)性。中藥譜效關(guān)系學(xué)是將指紋圖譜與其藥效作用結(jié)合起來(lái)，不僅可以使指紋圖譜中化學(xué)成分體現(xiàn)出相應(yīng)的藥效，而且還能闡明指紋圖譜特征與藥效的相互關(guān)系，確定相應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從而使構(gòu)建的藥效指紋圖譜更有針對(duì)性的控制中藥質(zhì)量[6]。高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)采用高效液相色譜對(duì)復(fù)雜混合物進(jìn)行快速分離，結(jié)合高性能四級(jí)桿的母離子選擇性與高分辨的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)Orbitrap檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的定性和定量分析，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)效率高等特點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)建立防風(fēng)不同極性部位LC-MS指紋圖譜，比較不同極性部位的抗流感病毒活性，采用Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析及最小偏二乘回歸分析三種方法分析防風(fēng)不同極性部位與抗流感病毒活性的譜效關(guān)系，根據(jù)秩相關(guān)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度及VIP值共同推斷出主要藥效成分，為防風(fēng)抗流感病毒藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì)社)；XMTD-204恒溫水浴鍋(天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠)；1/10萬(wàn)電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Centrifuge 5418離心機(jī)(Eppendorf公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo公司)；UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS(美國(guó)Thermo公司)；SD-CJ-ID生物安全柜(蘇州凈化設(shè)備廠)；HF90 CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；CKX-31倒置顯微鏡(olympus公司)；TC20細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Bio-Rad公司)；移液槍(Eppendorf公司)。

1.2 材料

防風(fēng)(批號(hào)2019.03.22)，經(jīng)由山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室徐凌川教授鑒定為傘形科防風(fēng)屬植物防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)的干燥根。環(huán)己烷(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；二氯甲烷(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；乙酸乙酯(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；正丁醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；甲醇(G，R，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；利巴韋林注射液(Rebavinrin injection，山東魯抗辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)1612246411，濃度50 mg/mL)；酪氨酸(批號(hào)140609-200610，純度：99.57%)、咖啡酸(批號(hào)110885-201703，純度99.65%)、7-羥基香豆素(批號(hào)111739-200501，純度99.48%)，均購(gòu)于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；娃哈哈純凈水、蒸餾水；DMSO溶液(1427C108)；DMEM培養(yǎng)基(Gibio公司)；PBS緩沖溶液(Gibio公司)；胰酶(Gibio公司)；新生牛血清(ABW)；青霉素和鏈霉素(Hyclone)；MDCK細(xì)胞(由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所微生物室提供，本科室保存)；H1N1病毒(2000年10月引自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 防風(fēng)不同極性部位的制備

稱取200 g防風(fēng)藥材，粉碎，過(guò)2和4號(hào)篩，得粗粉。加十倍量甲醇，超聲提取30 min，重復(fù)兩次，合并濾液，抽濾，得到濾液。減壓回收溶劑，得到浸膏。加入適量的蒸餾水，制成混懸液，然后依次用等量的環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水各萃取兩次，得到各部位的萃取液。減壓回收各部位溶劑，得到各極性部位浸膏和粉末。

2.2 防風(fēng)不同極性部位的抗病毒活性

2.2.1 防風(fēng)不同極性部位供試品溶液的制備

稱取防風(fēng)各極性部位浸膏適量，用DMEM培養(yǎng)基溶解，配成50 mg/mL的溶液。

2.2.2 病毒毒力的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種至96孔板，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)長(zhǎng)至單層，棄掉培養(yǎng)液。依次加入10倍系列稀釋的H1N1病毒液100 μL，每個(gè)濃度重復(fù)四孔，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照。在37 ℃，5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，各孔分別加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h，吸棄染液，加入DMSO溶液100 μL，室溫下脫色10 min，震蕩6 min，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm下的OD值，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒的半數(shù)感染濃度TCID50。

細(xì)胞存活率=各組OD值/正常細(xì)胞OD值×

100%

細(xì)胞比距=(高于50%病變率-50%)/

(高于50%病變率-低于50%病率)×100%

TCID50= Antilg(Ig高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距×稀釋因子對(duì)數(shù))

2.2.3 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用

按照2.2.1中方法將防風(fēng)各極性部位藥物用DMEM培養(yǎng)基按2倍比稀釋10個(gè)濃度梯度，依次接種于MDCK細(xì)胞已經(jīng)長(zhǎng)成單層的96孔板中，每個(gè)濃度重復(fù)3孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組，37 ℃，5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變程度，用MTT染色，用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)定OD值，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算細(xì)胞半數(shù)中毒濃度TC50，找到最大無(wú)毒濃度TC0。

2.2.4 藥物體外抗病毒實(shí)驗(yàn)方法

將1×104個(gè)/mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞接種于96孔板上，每孔100 μL，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸棄培養(yǎng)液，將藥物從最大無(wú)毒濃度開(kāi)始，按二倍比系列稀釋共12個(gè)濃度，設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照、利巴韋林為陽(yáng)性對(duì)照(10 mg/mL),每個(gè)濃度重復(fù)3孔，除細(xì)胞對(duì)照外，各孔加入50 μL含100個(gè)TCID50的病毒液，混合均勻。37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察病毒對(duì)照組病變情況，待細(xì)胞出現(xiàn)90%及以上病變時(shí)采用CPE法記錄各組藥物抑毒情況，用MTT法測(cè)量OD值，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算防風(fēng)各極性部位的半數(shù)有效濃度(EC50)及治療指數(shù)(TI)，C為供試品初始濃度。

EC50= [Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距)]×C

治療指數(shù)(TI)= 半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)有效濃度(EC50)

2.3 防風(fēng)不同極性部位LC-MS指紋圖譜的建立

2.3.1 防風(fēng)不同極性部位供試品溶液的制備

稱取防風(fēng)甲醇總提物及相當(dāng)于生藥量1 g的環(huán)己烷部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和萃取后水部位浸膏，用70%甲醇溶解，配成濃度分別為11.52、3.75、0.63、5.97、150.75 mg/mL的供試品溶液。

2.3.2 LC-MS液質(zhì)條件

Halo-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，流動(dòng)相0.05%甲酸水溶液(A)-0.05%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～4 min，5% B；4～8 min，5%→15% B；8～23 min，15%→75% B；23～28 min，75%→100% B；28～30 min，100% B)，柱溫30℃，進(jìn)樣量3 μL，體積流量0.3 mL/min。源內(nèi)溫度320 ℃，輔助氣溫度350 ℃，S-lenS RF水平55%，分辨率70 000，質(zhì)譜掃描范圍m/z80～1 200。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

取防風(fēng)甲醇總提物樣品制備供試品溶液1份，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以7號(hào)峰為參照物峰，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取防風(fēng)甲醇總提物樣品制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以7號(hào)峰為參照物峰，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD值均小于3%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取防風(fēng)甲醇總提物樣品制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以7號(hào)峰為參照物峰，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析及偏最小二乘回歸分析采用Excel 2016、Simca-p 19.0軟件處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 抗流感病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)[8]，一般認(rèn)為TI值≥2.00，證明藥物有抗病毒活性，TI值≥4.00，其抗病毒成分有研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，防風(fēng)不同極性部位藥物對(duì)H1N1流感病毒均有不同程度的抑制作用，其中水部位藥物抗H1N1流感病毒活性最高，其TI值為54.32，甲醇總提物部位藥物抗H1N1流感病毒活性次之，其TI值為48.76，其他部位的抗H1N1流感病毒活性相對(duì)較弱，見(jiàn)表1

3.2 數(shù)理統(tǒng)計(jì)與顯著性檢驗(yàn)

本文表格中TC50、EC50由CPE觀察得到。采用SPSS 19.0軟件分析上述數(shù)據(jù)。選擇單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P= 0.05為顯著性水準(zhǔn)，分析結(jié)果見(jiàn)圖1。與陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林(EC50為7.843 6 μg/mL，TI為36.25)比較，甲醇總提物與萃取水部位差異顯著(P< 0.05)，抗流感病毒活性較強(qiáng)。

3.3 樣品中成分的鑒定

取“2.3.1”的供試品溶液，按照“2.3.2”的色譜條件進(jìn)行分析，得到防風(fēng)不同極性部位指紋圖譜，見(jiàn)圖2。使用Xcalibur 3.0軟件(Thermo公司，美國(guó))對(duì)高分辨質(zhì)譜信息進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及對(duì)照品的比對(duì)進(jìn)行峰的指認(rèn)，最終確定了28個(gè)色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 防風(fēng)不同極性部位抗H1N1病毒活性的檢測(cè)結(jié)果

圖1 防風(fēng)不同極性部位抗流感病毒TI值比較(t檢驗(yàn))Fig.1 Comparison of TI anti-influenza virus values in different polar parts of S.divaricata (t test)注：與S7比較：*P < 0.05。Note:Compared with S7,*P < 0.05.

3.4 防風(fēng)不同極性部位抗流感病毒活性的譜效相關(guān)性分析

3.4.1 防風(fēng)不同極性部位總離子流圖分析

參考文獻(xiàn)及對(duì)照品，對(duì)照甲醇總提物色譜峰，環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位分別鑒定出16、21、15、15、13個(gè)化合物，如表3。

3.4.2 Spearman分析

Spearman分析不僅能發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系，也能發(fā)現(xiàn)單調(diào)的非線性關(guān)系；對(duì)分析的變量數(shù)據(jù)不需要正態(tài)性假設(shè)，還可以適用于等級(jí)數(shù)據(jù)(無(wú)法定量的順序數(shù)據(jù))；對(duì)異常數(shù)值敏感度低，因此，Spearman相關(guān)方法適用性更廣[17]。

圖2 防風(fēng)不同極性部位在正離子模式下的UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS提取總離子流圖Fig.2 The extract ion chromatogram of in positive ion mode from S.divaricata different polar parts using UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS注：A：甲醇提取總部位；B：環(huán)己烷部位；C：二氯甲烷部位；D：乙酸乙酯部位；E：正丁醇部位；F：萃取后水部位。Note:A:Total part of methanol extraction;B:Cyclohexane part;C:Dichloromethane part;D.Ethyl acetate part;E:n-Butanol part;F:Water part after extraction.

表2 防風(fēng)不同極性部位的LC-MS數(shù)據(jù)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

No.tR(min)分子式Formula準(zhǔn)分子離子[M+H]+(m/z)測(cè)量值Calculated value質(zhì)譜數(shù)據(jù)Mass data(m/z)化學(xué)成分Compound2420.50C12H8O5233.044 4233.043 7174.045 5、218.021 7、235.063 45-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素[9]2520.51C19H20O5329.138 4329.138 283.049 7、229.084 8、247.095 3紫花前胡素[9]2620.54C17H16O5301.107 1301.107 169.071 0、218.021 2、233.044 6珊瑚菜素[9]2721.44C19H22O6347.148 9347.147 8217.048 0、259.094 03'-O-2-丁酰亥茅酚[10-13]2822.38C20H22O6359.148 9359.148 7200.236 5、279.158 73'-O-當(dāng)歸酰亥茅酚[10-13]

注：*根據(jù)對(duì)照品確定的物質(zhì)。

Note：*Substance identified by reference.

表3 防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度

注：相應(yīng)保留時(shí)間下未檢測(cè)到的峰強(qiáng)度為“1”。

Note：The peak intensity not detected at the corresponding retention time is "1".

本實(shí)驗(yàn)將防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度與抗流感病毒活性進(jìn)行相關(guān)性分析(P<0.05)，參考文獻(xiàn)[18]，計(jì)算Spearman秩相關(guān)系數(shù)(rs)，如表4，|rs|≥0.8表示高度相關(guān)，0.5≤|rs|<0.8表示中度相關(guān)，0.3≤|rs|<0.5表示低度相關(guān)，|rs|<0.3表示不相關(guān)，rs為正表示正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)按照以上參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，確定1、5、6、7、10、11、12、13、20、24號(hào)峰與藥效作用相關(guān)。

表4 Spearman秩相關(guān)系數(shù)(rs)

3.4.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析[19]

本實(shí)驗(yàn)研究防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度對(duì)流感病毒的抑制作用，將治療指數(shù)(TI)作為母序列，記為X0(k)；不同極性部位化合物峰強(qiáng)度作為子序列，記為X1(k)，X2(k)，…，X28(k)，n=1,2,…,6。采用歸一化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理，Xi(k)=Xi(k)/Xi[SUM(1～k)]，i=0,1,2,…,28。

(1)關(guān)聯(lián)度系數(shù)計(jì)算

ξi(k)=(△min+ρ*△max)/(△i(k)+ρ*max)；△i(k)=∣Xi(k)-X0(k)∣

△min=min∣X0(1)～Xi(k)∣，△max=max∣X0(1)～Xi(k)∣

ρ為分辨系數(shù)，0 ≤ρ≤ 1，通常取ρ=0.5

將防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度與抗流感病毒活性進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，參考文獻(xiàn)[19]，以γ≥0.75表示子序列對(duì)母序列有影響，計(jì)算關(guān)聯(lián)度γ，如表5。確定1、3、5、7、8、9、11、12、13、20、22、23、24、25、26、28號(hào)峰對(duì)抗流感病毒活性有影響。

表5 灰色關(guān)聯(lián)度(γ)

3.4.4 偏最小二乘回歸(PLSR)法分析

偏最小二乘回歸(PLSR)分析法是從應(yīng)用領(lǐng)域中提出的一種新型多元數(shù)據(jù)分析方法。近十幾年來(lái)，它在理論和應(yīng)用方面都已得到迅速的發(fā)展。偏最小二乘回歸分析主要適用于多因變量對(duì)多自變量的線性回歸建模，并可以有效地解決許多用普通多元性回歸無(wú)法解決的問(wèn)題[20]。本實(shí)驗(yàn)以防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度為自變量，抗流感病毒活性為因變量，進(jìn)行譜效相關(guān)性分析。

本實(shí)驗(yàn)利用SIMCA-P 19.0軟件，采用PLSR分析法進(jìn)行譜效相關(guān)性分析，計(jì)算得到28個(gè)特征峰與抗流感病毒活性的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)(圖2-A)和VIP值(圖2-B)。VIP>1時(shí)，自變量在解釋因變量時(shí)具有重要意義[21]。由圖3可知，峰1、3、5、7、8、9、11、13、20、22、24、28的VIP值均大于1，且其回歸系數(shù)均為正相關(guān)，故說(shuō)明這12個(gè)峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)對(duì)于細(xì)胞抗流感病毒作用有重要影響。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以防風(fēng)為研究對(duì)象，采用CPE法對(duì)防風(fēng)總提取物及不同極性部位進(jìn)行了體外抗流感病毒活性研究。根據(jù)測(cè)定的TI值,抗流感病毒活性順序?yàn)椋核课?甲醇總提物>正丁醇部位>環(huán)己烷部位>二氯甲烷部位>乙酸乙酯部位。為探究防風(fēng)中具體的抗流感病毒活性成分，本實(shí)驗(yàn)將防風(fēng)抗流感病毒TI值與不同極性部位的共有峰峰強(qiáng)度進(jìn)行譜效相關(guān)分析。采用Spearman簡(jiǎn)單相關(guān)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步分析，而后運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析，但灰色關(guān)聯(lián)度分析對(duì)數(shù)據(jù)的要求較低，無(wú)法建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型。偏最小二乘回歸分析法集多元線性回歸、典型相關(guān)分析和主成分分析的基本功能于一體，可操作性高，建立的數(shù)學(xué)模型較為準(zhǔn)確，確保模型較好的精度所需包含的成分?jǐn)?shù)量，保證了模型的推廣性[22]。綜合上述分析方法的利弊，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)用Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、偏最小二乘回歸分析三種方法，可以更全面地分析防風(fēng)不同極性部位與抗流感病毒活性的譜效關(guān)系，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)建立了防風(fēng)不同極性部位的LC-MS指紋圖譜，確定了28種化合物，將28種化合物對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度與抗流感病毒活性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)計(jì)算。由Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、偏最小二乘回歸分析方法共同得出1、5、7、11、13、20、24號(hào)峰對(duì)抗流感病毒活性有影響，即焦谷氨酸、divaricatacid、升麻苷、亥茅酚苷、補(bǔ)骨脂素、異嗪皮啶、5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。其中升麻苷、補(bǔ)骨脂素及5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素與文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)的升麻苷、補(bǔ)骨脂素類化合物[23,24]具有一定的抗流感病毒能力相一致，進(jìn)一步論證了本實(shí)驗(yàn)的可靠性，由此可推測(cè)，秩相關(guān)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度、VIP值均高于升麻苷、補(bǔ)骨脂素的焦谷氨酸、divaricatacid、亥茅酚苷、異嗪皮啶同樣具有抗流感病毒活性，后期可利用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法對(duì)焦谷氨酸、divaricatacid、亥茅酚苷、異嗪皮啶四個(gè)單體成分的抗流感病毒活性進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步確證其抗流感病毒活性。本實(shí)驗(yàn)為探究防風(fēng)的抗流感病毒作用機(jī)制提供參考依據(jù)，為下一步深入研究防風(fēng)抗流感病毒活性物質(zhì)基礎(chǔ)及化學(xué)結(jié)構(gòu)提供初步方向。

圖3 防風(fēng)PLSR標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖(A)和對(duì)藥效的VIP貢獻(xiàn)圖(B)Fig.3 PLSR normalized regression coefficient graph (A) and contribution of characteristic peaks of S.divaricata to VIP (B)