亞慢性煙霧暴露對大鼠肺臟蛋白組學(xué)的影響

尹晶晶，蘇加坤，李梅，徐達(dá)，秦秀軍，蔡繼寶

1 中國輻射防護(hù)研究院，藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中核放射毒理與放射性藥物臨床前評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原學(xué)府街102號 030006；2 江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江西南昌京東大道201號 330096

大量的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，吸煙有害健康。吸煙與人體多種呼吸道及心肺疾病具有相關(guān)性，如氣管炎、慢性阻塞性肺病、肺氣腫、冠心病及心肌梗塞等。因此，吸煙對人體健康的影響一直受到人們的關(guān)注[1-3]。吸煙對呼吸系統(tǒng)的損傷是一個(gè)長期的過程，因此，需要關(guān)注煙氣慢性暴露對呼吸系統(tǒng)損傷的機(jī)理研究。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，高效液相色譜、質(zhì)譜的技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。蛋白組學(xué)研究成為近年來的研究熱點(diǎn)，通過檢測蛋白的表達(dá)水平，建立蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)了在蛋白水平對作用機(jī)制的深入研究[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)也是疾病診斷和治療的有效方法之一。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展煙霧暴露損傷效應(yīng)研究的成果不斷發(fā)表。Ma等利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究了大鼠煙氣暴露4周后肺臟蛋白表達(dá)變化情況[5]。Phillips等利用蛋白組學(xué)技術(shù)證明了雌性小鼠停止暴露于煙氣中后肺部炎癥減少[6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tag，TMT）標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù)研究煙霧全身暴露90天對雄性大鼠肺臟損傷的影響，從分子機(jī)制方面探討長期吸煙或長期暴露于煙氣中對肺臟的損傷，為煙草減害機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

普通卷煙，煙氣煙堿量1.0 mg/支，煙氣焦油量10.0 mg/支，一氧化碳10.0 mg/支，由江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器和試劑

HRH-WBE3986型動(dòng)物全身動(dòng)態(tài)暴露系統(tǒng)（北京慧榮和科技有限公司）；酶標(biāo)儀（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gelelectrophoresis, PAGE）電泳儀（北京市六一儀器廠）；ImageScanner掃描儀（美國GE Healthcare公司）；Q Exactive plus質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher公司）；Easy-nLC 1200液相色譜儀（美國ThermoFisher公司）。

SDS裂解液（上海碧云天公司）；PMSF（美國Amresco公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國ThermoScientific公司）；tandem mass tag（TMT）標(biāo)記試劑盒（美國ThermoFisher公司）；質(zhì)譜級乙腈（美國ThermoScientific公司）；羥胺（美國Sigma公司）；水（美國ThermoScientific公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠，9～10周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK-（京）2016-0006，質(zhì)量合格證號：11400700300671。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國輻射防護(hù)研究院藥物安全性評價(jià)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)，使用許可證號：SYXK（晉）2013-0002。

1.4 煙霧暴露染毒

雄性SD大鼠96只按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組（空白對照組，不暴露于煙氣中）和染毒組，染毒組動(dòng)物放置于動(dòng)物全身動(dòng)態(tài)暴露系統(tǒng)染毒腔體內(nèi)，腔內(nèi)O2濃度為19%～21 %，CO2濃度小于0.5%，煙霧濃度（1100±110）% mg/m3，暴露時(shí)間60 min，每天染毒1次，連續(xù)染毒90天。染毒90天后存活率100%，健康狀況良好，對照組和染毒組各取3只大鼠肺臟進(jìn)行蛋白組學(xué)檢測。

1.5 蛋白組學(xué)檢測及分析

1.5.1 蛋白提取

煙霧暴露90天后，取對照組和染毒組大鼠肺臟組織加入裂解液提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳法檢測提取蛋白的質(zhì)量。

1.5.2 TMT標(biāo)記及蛋白組學(xué)檢測

提取出的總蛋白用胰蛋白酶酶解后，用TMT試劑盒進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)反相色譜分離，真空冷凍干燥后，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Proteome DiscovererTM 2.2（美國Thermo公司）軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。使用數(shù)據(jù)庫為UniProt大鼠數(shù)據(jù)庫。以差異倍數(shù)FC > 1.2，且差異顯著性P-value < 0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白。

1.5.4 生物信息學(xué)分析

通過OmicsBean分析平臺對篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）功能注釋分析、KEGG信號通路分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果

2.1 煙霧暴露誘導(dǎo)的大鼠肺臟差異蛋白鑒定結(jié)果

雄性SD大鼠經(jīng)全身暴露煙霧染毒90天，取肺臟組織提取蛋白質(zhì)，經(jīng)胰蛋白酶消化和TMT標(biāo)記，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析，分析后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，篩選出可信蛋白3452個(gè)。

以差異倍數(shù)大于1.2倍，P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，染毒組與對照組相比篩選出差異表達(dá)蛋白133個(gè)，其中99個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)，34個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)。

2.2 差異表達(dá)蛋白GO富集分析

通過GO富集分析對篩選出的133個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物過程（Biological Process）、細(xì)胞成分（Cellular Component） 和 分子功能（Molecular Function）三方面的分析，研究差異表達(dá)蛋白在功能上的分布。通過GO分析結(jié)果顯示133個(gè)差異表達(dá)蛋白富集于2283種生物過程，364種細(xì)胞成分和489類分子功能，其中差異顯著（P<0.05）的生物過程602種，細(xì)胞成分131種，分子功能158類。

圖1顯示了生物過程、細(xì)胞成分和分子功能三類富集分析差異顯著性前十的條目。生物過程分析表明，差異表達(dá)蛋白主要涉及氧化還原過程、肌肉系統(tǒng)過程、肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育、肌肉器官發(fā)育、橫紋肌組織發(fā)育、肌肉收縮、肌肉組織發(fā)育、橫紋肌收縮、心室心肌組織發(fā)育及肌肉細(xì)胞發(fā)育（表1）。

圖1 染毒組大鼠肺臟組織差異蛋白GO富集分析結(jié)果Fig.1 Enrichment analysis results of GO in lung tissues of rats in treatment group

細(xì)胞成分分析表明，差異表達(dá)蛋白主要涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、肌節(jié)、線粒體、收縮纖維、肌原纖維、胞外區(qū)、線粒體內(nèi)膜蛋白復(fù)合物、收縮纖維及線粒體呼吸鏈（表2）。分子功能分析表明，差異表達(dá)蛋白主要涉及肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、氧化還原酶活性、長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性、蛋白復(fù)合物結(jié)合、肌肉大分子組分、肌肉結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性及肌鈣蛋白C結(jié)合（表3）。

表1 差異表達(dá)蛋白的主要生物過程分析Tab.1 Biological process analysis of differentially expressed proteins

表2 差異表達(dá)蛋白的主要細(xì)胞成分分析Tab.2 Cellular component analysis of differentially expressed proteins

表3 差異表達(dá)蛋白的主要分子功能分析Tab.3 Molecular function analysis of differentially expressed proteins

2.3 差異表達(dá)蛋白KEGG富集分析

KEGG通路分析結(jié)果顯示，本研究篩選出的133個(gè)差異表達(dá)蛋白涉及87條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中差異顯著（P<0.05）的通路有21條。差異顯著性排前10位的通路，主要包括心肌收縮、氧化磷酸化、帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、非酒精性脂肪肝病、代謝途徑、肥厚性心肌病、擴(kuò)張性心肌病及心肌細(xì)胞中的腎上腺素信號通路（表4）。

2.4 差異表達(dá)蛋白相互作用分析

將篩選出的差異表達(dá)蛋白及KEGG通路之間進(jìn)行蛋白互作分析，圖2顯示為KEGG顯著性前十的通路及與之互作的蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)圖。

圖2 染毒組大鼠肺臟組織差異蛋白互作分析結(jié)果Fig.2 Interaction analysis results of differentially expressed proteins in lung tissues of rats in treatment group

表4 差異表達(dá)蛋白的通路分析Tab.4 KEGG pathway analysis of differentially expressed proteins

3 討論

吸煙對人體健康的危害不言而喻。煙草煙霧中含有多種有害物質(zhì)，如尼古丁、多環(huán)芳烴、一氧化碳、氮氧化合物及醛類等，其中多種為致癌物，容易誘發(fā)人體癌癥、呼吸系統(tǒng)、心血管、免疫等多種疾病。人體呼吸道系統(tǒng)對煙霧暴露最為直接和敏感，煙草煙霧中含有的有害成分可通過肺臟進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而影響更多的組織器官。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病的早期診斷、靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物篩選方面發(fā)揮巨大作用。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白組學(xué)技術(shù)研究雄性SD大鼠全身暴露于煙霧中染毒90天肺臟組織蛋白表達(dá)的變化情況，選出差異表達(dá)1.2倍以上的蛋白133個(gè)。

煙霧暴露90天，通過對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白主要參與602種生物學(xué)過程、131種細(xì)胞成分及158類分子功能。有文獻(xiàn)報(bào)道利用定量蛋白組學(xué)在肺成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白參與了應(yīng)激反應(yīng)、線粒體活動(dòng)和衰老過程[7]。細(xì)胞成分分析顯示煙霧暴露90天后，差異蛋白在線粒體中顯著富集，并且富集的生物學(xué)過程中差異最顯著的是氧化還原過程。有29種差異蛋白參與了氧化還原過程，包括順烏頭酸酶2（ACO2）、煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（NNT）、?；o酶A脫氫酶（ACADL）等。ACO2是細(xì)胞中重要的鐵硫蛋白酶，定位于線粒體中，是三羧酸循環(huán)中一種重要的酶，具有很強(qiáng)的催化活性，能催化檸檬酸氧化形成異檸檬酸。ACO2活性不僅反映線粒體氧化磷酸化水平，還反映了線粒體中活性氧的水平[8]。NNT是一種參與NADPH形成的線粒體酶，可調(diào)控線粒體內(nèi)超氧化物的清除，以及調(diào)控三磷酸腺苷合成功能的維持[9,10]。ACADL在線粒體中特異性分解?；o酶A，是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[11]。這三種蛋白主要分布在線粒體中，而線粒體是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生能量的細(xì)胞器。是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場所，還參與了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控。與細(xì)胞成分分析結(jié)果蛋白定位富集于線粒體是一致的。利用本實(shí)驗(yàn)篩選得到的結(jié)果提示肺臟組織的線粒體功能研究將是長期吸煙致肺損傷的機(jī)制研究的一個(gè)方向。

吸煙能通過破壞骨骼肌代謝，增加炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，引起肌肉損傷[12,13]。Elamin等在C57BL/6小鼠中發(fā)現(xiàn)煙霧暴露對肺部激動(dòng)蛋白骨架有影響[14]。本研究中，GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集在肌肉組織，研究結(jié)果提示亞慢性煙霧暴露可能對雄性大鼠肺臟肌肉組織有影響。

吸煙可通過增加冠狀血管收縮，減少冠狀動(dòng)脈血流量，增加心肌需氧量，增加氧自由基的產(chǎn)生和增強(qiáng)血栓形成，加劇心肌缺血。有研究報(bào)道二手煙暴露3周后，幼鼠心肌梗死面積增加，吸煙增加了心臟病死亡風(fēng)險(xiǎn)[15]。長期吸煙可引起慢性阻塞性肺病，患慢性阻塞性肺病肺部臨床癥狀表現(xiàn)為肺部炎癥，還發(fā)現(xiàn)肌肉萎縮和功能障礙等臨床癥狀，并且慢性阻塞性肺病進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致肺原性心臟病[16]。本研究中，KEGG通路分析顯示心肌收縮、肥厚性心肌病、擴(kuò)張性心肌病、及心肌細(xì)胞中的腎上腺素信號通路等發(fā)生差異表達(dá)，提示亞慢性煙霧暴露可誘導(dǎo)心肺疾病的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究以雄性SD大鼠肺臟組織為實(shí)驗(yàn)材料，研究了全身暴露90天后肺部組織的蛋白組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)煙霧暴露90天后，對肺部組織的氧化還原過程和肌肉組織有影響，調(diào)控心肺疾病的信號通路。這些結(jié)果為初步探討長期吸煙或長期暴露于煙氣中對肺部損傷的分子作用機(jī)制提供依據(jù)，為煙草減害機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。