陸興潔，王 迪，王澤東，張 力，姬宏衛(wèi)，魏 峰，劉 全

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命工程與科學(xué)學(xué)院，廣東 佛山 528000)

蜱傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis viruses,TBEV)是一種可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性病癥的人獸共患蜱傳黃病毒屬病毒[1]。主要包括遠(yuǎn)東、西伯利亞和歐洲等3個(gè)亞型，我國(guó)流行株為遠(yuǎn)東型。TBEV可使患者出現(xiàn)高熱、意識(shí)模糊、肌肉癱瘓、腦膜刺激癥等病癥，還可使牛、馬、羊等家畜出現(xiàn)體溫升高、精神萎靡、肢體麻痹等癥狀[2]。給人類公共衛(wèi)生安全及畜牧業(yè)養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重危害。

TBEV實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法有病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。病原學(xué)檢測(cè)主要通過(guò)細(xì)胞分離或接種乳鼠進(jìn)行檢測(cè)，但所需時(shí)間長(zhǎng)和敏感性低限制了其臨床應(yīng)用[3]。血清學(xué)方法可檢測(cè)出病毒在人或動(dòng)物體內(nèi)的抗體或抗原，但是由于黃病毒屬病毒間存在廣泛的交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性而導(dǎo)致檢測(cè)特異性不高[3]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要有巢式PCR和熒光定量PCR(包括探針法和染料法)，巢式PCR適合于大量樣品的高通量檢測(cè)，但只能簡(jiǎn)單的對(duì)核酸進(jìn)行定性，不能實(shí)時(shí)監(jiān)控核酸擴(kuò)增量，且兩輪PCR增加了敏感性的同時(shí)也延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間[4]。探針法(TaqMan)熒光定量PCR具有很好的特異性和敏感性，但探針合成價(jià)格較貴，設(shè)計(jì)較好的探針引物較難[5]。SYBR Green核酸染料法PCR不需要設(shè)計(jì)探針，除去了探針合成費(fèi)用，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，且敏感性和特異性與探針法差異不大，目前已有報(bào)道將核酸染料法PCR應(yīng)用于多種病毒檢測(cè)[6-7]。目前已有學(xué)者將巢氏PCR及探針法熒光定量PCR應(yīng)用到TBEV的臨床檢測(cè)，但是未見有SYBR Green核酸染料法熒光定量PCR應(yīng)用于TBEV的報(bào)道[8-9]。本試驗(yàn)選用SYBR GreenⅡ核酸染料建立一種針對(duì)TBEV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，旨在建立一種快速、高效、廉價(jià)的TBEV檢測(cè)方法，為TBEV的診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株遠(yuǎn)東型TBEV、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTSV)均由本實(shí)驗(yàn)室保種[10-11]。

1.2 主要試劑與儀器PCR 儀(Applied Biosystems 2720)；電泳儀(國(guó)產(chǎn)三恒電泳儀10型)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIOTek Ettan Dige Imager)；Axygen瓊脂糖凝膠回收試劑盒；超微量分光光度計(jì)(美國(guó)QuaWellQ5000型)；全溫型多振幅高速軌道搖床(上海智城ZHWY-200D)；熒光定量PCR儀(Gene Company Limited基因有限公司，德國(guó)P06213型)；微孔板離心機(jī)(杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司MPC2800型)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成在GenBank下載TBEV核苷酸序列并尋找NS5片段保守區(qū)，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物，上游引物TBEV-NS5-F1：5′-AATGACTGGATTCTGGAA-3′，下游引物TBEV-NS5-R1：5′-GGATTTCACTTTCGCTAT-3′，擴(kuò)增片段大小為84 bp，由長(zhǎng)春庫(kù)美基因科技有限公司合成。

1.4 TBEV標(biāo)準(zhǔn)品的制備以TBEV的cDNA為模板，上游引物TBEV-F：5′-CAGCAGCGAGTGTTCAARGA-3′；下游引物TBEV-R：5′-GGTCCTCATTCAAAAAGCCA-3′進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增片段大小為435 bp。反應(yīng)體系 ：Ex-Taq Master Mix 0.2 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA sample 1 μL，ddH2O 17.3 μL，總體系 25 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，共35個(gè)循環(huán)，20℃保溫。以PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐青霉素的培養(yǎng)板37℃培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落，搖菌14 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，設(shè)空白對(duì)照，觀察結(jié)果，并將菌液PCR產(chǎn)物送往基因公司測(cè)序。提取質(zhì)粒，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定D值，按照拷貝數(shù)計(jì)算公式計(jì)算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)，質(zhì)?？截悢?shù)=質(zhì)量濃度(mg/ L)×6.023×1014/(堿基數(shù)×660)。

1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按(108～101)拷貝/μL梯度稀釋進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系20 μL，以TBEV-NS5-F1/ TBEV-NS5-R1作為引物分別為0.8 μL、 SYBR GreenⅡ熒光定量PCR反應(yīng)液10 μL、質(zhì)粒DNA 1 μL、去離子水補(bǔ)足至20 μL，在此基礎(chǔ)上設(shè)陰性對(duì)照。因?yàn)橥嘶鸬臏囟群蜁r(shí)間對(duì)PCR反應(yīng)的影響較大，所以本試驗(yàn)通過(guò)調(diào)節(jié)退火溫度和時(shí)間來(lái)優(yōu)化反應(yīng)條件，反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60～ 65℃ 20～30 s；95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s，共40～50個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后標(biāo)準(zhǔn)曲線由熒光定量PCR儀自動(dòng)生成，其中X軸代表每個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，Y軸代表每個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)。

1.6 敏感性檢測(cè)在獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線后，以標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，按(108～ 101拷貝/μL)梯度稀釋，每個(gè)梯度重復(fù)做3次，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)利用半巢式PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，2種檢測(cè)方法的擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，設(shè)空白對(duì)照。統(tǒng)計(jì)檢出質(zhì)粒DNA的最小拷貝數(shù)，比較2種檢測(cè)方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性檢測(cè)利用建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法，以108～105拷貝/μL稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為重復(fù)性檢測(cè)的對(duì)象，每個(gè)梯度重復(fù)3次。根據(jù)計(jì)算公式以Cq值的大小算出這4個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的變異系數(shù)，分析該方法的重復(fù)性。計(jì)算公式：C×V=(標(biāo)準(zhǔn)偏差s/平均值)×100%

1.8 特異性檢測(cè)將淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)和TBEV毒株作為特異性檢測(cè)的對(duì)象。利用建立的熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，分析該方法的特異性。

1.9 牛血清樣品檢測(cè)利用半巢式PCR和建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)2017年5-7月在內(nèi)蒙古地區(qū)采集的155份牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較分析兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果，并將陽(yáng)性樣品送往長(zhǎng)春庫(kù)美基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 TBEV標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，目的片段為435 bp，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，TBEV目的基因克隆至pMD18-T載體，成功構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，質(zhì)粒質(zhì)量濃度為197.14 mg/L。根據(jù)公式計(jì)算分子拷貝數(shù)為5.36×1010拷貝/μL，將其稀釋536倍至108拷貝/μL。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物各0.8 μL、SYBR GreenⅡ熒光定量PCR反應(yīng)液10 μL、模板cDNA 1 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL，在此基礎(chǔ)上設(shè)陰性對(duì)照。反應(yīng)條件：95℃ 30 s 、95℃ 5 s 、60℃ 30 s 、95℃ 15 s 、60℃ 30 s 、95℃ 15 s，共40 個(gè)循環(huán)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定 1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照；M.D2000 DNA Marker

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立結(jié)果將標(biāo)準(zhǔn)品按10倍倍比稀釋，以8個(gè)稀釋梯度(108～ 101拷貝/μL)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2,3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.3 logX+38.71，擴(kuò)增效率97%。在83.1℃處出現(xiàn)單一的特異性峰，Tm值均一，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

2.4 敏感性檢測(cè)結(jié)果熒光定量PCR檢測(cè)下限為101拷貝/μL，半巢式PCR檢測(cè)下限為102拷貝/μL，熒光定量PCR靈敏度比半巢式PCR高10倍，具有更好的敏感性(圖4)。

2.5 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)重復(fù)檢測(cè)，建立方法變異系數(shù)低于2%，陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增。表明建立的熒光定量PCR方法具有良好的穩(wěn)定性(表1)。

2.6 特異性檢測(cè)結(jié)果用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)LCMV、SFTSV和TBEV等蜱傳病毒，發(fā)現(xiàn)TBEV能夠產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，而LCMV和SFTSV均未擴(kuò)增(圖5)。表明建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.7 牛血清樣品檢測(cè)結(jié)果對(duì)155份牛血清樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，熒光定量PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣品22份，陽(yáng)性率為14.2%，半巢式PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣品14份，陽(yáng)性率為9.0%，兩者一致率為63.6%(表2)。

3 討論

蜱傳腦炎病毒(TBEV)是黃病毒科黃病毒屬的一種經(jīng)蜱傳播的帶囊膜的單股正鏈RNA病毒?？蓪?dǎo)致患者高熱、頭痛、意識(shí)障礙、腦膜刺激征等癥狀，重者可導(dǎo)致死亡或留下嚴(yán)重后遺癥，同時(shí)可導(dǎo)致牛羊等家畜出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、肢體麻痹等病癥，給疫區(qū)人民的生產(chǎn)生活帶來(lái)嚴(yán)重危害[2]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法通常具有敏感性高特異性好的優(yōu)點(diǎn)，目前已有研究應(yīng)用巢式PCR和熒光定量探針法對(duì)TBEV進(jìn)行檢測(cè)，考慮到巢氏PCR耗時(shí)較長(zhǎng)，探針法熒光定量PCR探針合成成本高的缺點(diǎn)，本試驗(yàn)建立了基于SYBR GreenⅡ核酸染料的熒光定量PCR方法[8-9]。該方法不但穩(wěn)定性好(組內(nèi)變異系數(shù)<2%)，而且具有較高的敏感性(檢測(cè)下限：101拷貝/μL)和特異性(對(duì)LCMV和SFTSV不產(chǎn)生特異性擴(kuò)增)。

圖2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 熒光定量PCR溶解曲線

圖4 熒光定量PCR敏感性分析 A.熒光定量PCR;B(上).常規(guī) PCR；B(下).半巢式PCR;1～8.108～101 copies/μL;9.對(duì)照；M.Marker

牛羊在蜱傳腦炎傳播循環(huán)中起著重要作用，在流行地區(qū)牛羊等家畜均存在森林腦炎病毒抗體，而且目前已有報(bào)道在牛奶和羊奶中檢出TBEV，說(shuō)明病毒可能會(huì)通過(guò)未煮熟的奶制品傳播給人[12]。因此對(duì)牛、羊等放牧動(dòng)物體內(nèi)TBEV的檢測(cè)對(duì)于病毒防控及食品安全具有重要意義。本試驗(yàn)利用建立的熒光定量PCR方法對(duì)155份牛血清進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，TBEV陽(yáng)性率為14.2%，高于半巢式PCR陽(yáng)性率9.0%，2種方法檢測(cè)一致率為63.6%，熒光定量PCR檢測(cè)效果優(yōu)于半巢氏PCR。

本試驗(yàn)存在2個(gè)缺陷。首先，限于病毒模板問題，本試驗(yàn)在特異性檢測(cè)驗(yàn)證上只檢測(cè)了本實(shí)驗(yàn)室保種的淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒和發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒[10-11]，至于該方法對(duì)其他黃病毒或蜱傳病毒是否有非特異性擴(kuò)增并未得到驗(yàn)證，但是從引物序列比對(duì)上看，本試驗(yàn)所用引物僅能特異擴(kuò)增TBEV；其次本試驗(yàn)只針對(duì)牛臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)，該法在人及其他動(dòng)物樣品檢測(cè)上是否具有好的檢測(cè)效果有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 熒光定量PCR重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

圖5 熒光定量PCR特異性分析

表2 熒光定量PCR臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

綜上所述，本試驗(yàn)成功建立了一種基于SYBR GreenⅡ的熒光定量PCR的TBEV檢測(cè)方法，該法敏感性高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)耗時(shí)短、成本低，為TBEV的診斷及防控提供了技術(shù)支持，為TBEV的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ)。