王 涵，岳巧嫻，許利軍，周榮艷*，陳 燁，陳 輝，張振紅

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071001；2.保定市畜牧工作站，河北 保定 071001)

蛋雞在產(chǎn)蛋期存在獨特的骨代謝過程，骨吸收時髓質(zhì)骨被破骨細胞黏附并分解釋放蛋殼形成所需要的鈣[1]；骨形成時髓質(zhì)骨吸收多余的鈣，被成骨細胞重建[2]。骨代謝過程中，成骨細胞是主要功能細胞，負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，參與骨的形成和重建[3]；骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)為髓質(zhì)骨的主要組成成分，促進成骨細胞的分化和礦化，誘導成骨細胞和破骨細胞對髓質(zhì)骨的黏附，在骨代謝中起重要作用[4-7]。當外源鈣長期供應不足時，骨代謝平衡被打破，髓質(zhì)骨被過度吸收，引發(fā)蛋雞骨質(zhì)疏松癥，造成骨折和癱瘓，降低產(chǎn)蛋性能和經(jīng)濟效益。

褪黑素是由脊椎動物腦部松果體合成分泌的一類吲哚類激素，在機體的代謝方面發(fā)揮著重要的生理學效應[8]。研究發(fā)現(xiàn),蛋雞產(chǎn)蛋率與血液中褪黑素水平呈正相關[9]，在飼料中補充褪黑素可增加蛋重并提高蛋雞脛骨和股骨斷裂強度[10]，提升蛋雞生產(chǎn)經(jīng)濟效益，但褪黑素提高蛋雞骨骼質(zhì)量的具體機制尚不明確，推測可能與成骨細胞分化、增殖和BSP表達水平相關。本試驗通過體外分離培養(yǎng)原代雞成骨細胞，研究褪黑素對雞成骨細胞增殖和分化的影響，為褪黑素調(diào)節(jié)蛋雞骨代謝和產(chǎn)蛋性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物15胚齡雞胚(種蛋)10只，不計大小，不分雌雄。試驗過程符合中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑0.25% Trypsin-EDTA(Gibco,US)、青鏈霉素(Gibco,US)、胎牛血清(Gibco,US)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco,US)、PBS緩沖液(Gibco,US)、褪黑素(Sigma,US)、Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁，日本)、瑞氏-姬姆薩復合染液(索萊寶，北京)、茜素紅染色液(索萊寶，北京)、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天，上海)、堿性磷酸酶檢測試劑盒(碧云天，上海)。

1.3 成骨細胞的分離、培養(yǎng)與純化用酒精浸泡消毒15胚齡雞胚，再用PBS緩沖液清洗以去除殘留酒精；剪開頭部皮膚，取出顱骨，刮去骨膜及骨縫間結締組織，剪成約1 mm×1 mm大小的骨片，并用PBS緩沖液清洗；加入2 mL 0.25% Trypsin-EDTA(1×)進行消化處理(37℃，10 min)后，加入2 mL培養(yǎng)液(10%胎牛血清，1%青鏈霉素)終止消化；將碎骨片均勻鋪于6孔板中，每孔6～7塊，翻轉(zhuǎn)置于培養(yǎng)箱中(37℃，5% CO2，飽和濕度)，使骨片貼壁；3 h后轉(zhuǎn)正6孔板，加入2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)；每3天更換培養(yǎng)液1次，待細胞長滿(約21 d)后傳代培養(yǎng)，采用差速貼壁法純化細胞。

1.4 成骨細胞的鑒定

1.4.1成骨細胞形態(tài)學觀察 用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)成骨細胞形態(tài)，以了解其生長狀況。

1.4.2成骨細胞染色鑒定 將純化后的F2代細胞以6×104個/孔接種到6孔板中，每3 d更換1次培養(yǎng)液，待細胞均勻分布、融合度為80%～90%時染色。用4%多聚甲醛固定細胞，0.5% Triton X-100通透處理。

姬姆薩染色：加入瑞氏-姬姆薩復合染液染色2 h；棄染色液，PBS洗3次，在倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

甲苯胺藍染色：加入0.5%甲苯胺藍溶液染色30 min；棄染色液，PBS洗1次；加入0.5%冰乙酸分化1 min；棄分化液，PBS洗3次，在普通相機和倒置相差顯微鏡下拍照并觀察。

堿性磷酸酶(ALP)染色：使用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(進行ALP染色。按照商家提供的說明書配制BCIP/NBT染色工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，加入BCIP/NBT染色工作液室溫避光孵育2 h；棄染色液，PBS洗3次，在普通相機和倒置相差顯微鏡下拍照并觀察。

茜素紅染色：加入0.2%茜素紅染色液染色2 h；棄染色液，PBS洗3次，在倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.5 褪黑素對成骨細胞分化和增殖的影響

1.5.1褪黑素對成骨細胞增殖的影響 將純化后的F3代細胞以3 000個/孔接種于96孔板，并添加0，10，50，100 μmol/L褪黑素進行培養(yǎng)。用CCK-8試劑盒，從第1天開始，每2天更換培養(yǎng)液并進行檢測，連續(xù)測7次，每次每個梯度設置3個重復。在酶標儀上檢測450 nm波長處測定D值，取平均值±標準差，以時間為橫軸，D值為縱軸，繪制細胞生長曲線。

1.5.2褪黑素對成骨細胞分化的影響 將純化后的F4代細胞以1.5×104個/孔接種到24孔板中，24 h 后更換添加10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 mg/L 維生素C的細胞培養(yǎng)液，再過24 h后添加0,10,50,100 μmol/L褪黑素進行培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，每天每個梯度設置3個重復，分別培養(yǎng)1,3,7,14 d后，裂解細胞，使用堿性磷酸酶檢測試劑盒進行ALP活性檢測。

1.5.3褪黑素對成骨細胞BSP基因表達的影響 將純化后的F4代細胞以6×104個/孔接種到6孔板中，24 h后更換添加10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 mg/L維生素C的細胞培養(yǎng)液，再過24 h后添加0，10，50，100 μmol/L褪黑素進行培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，每個梯度設置3個重復，培養(yǎng)14 d后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。

以NCBI基因組數(shù)據(jù)庫雞的BSPmRNA序列(登錄號：NM_205162.1)作為參考序列，用在線軟件Primer3設計熒光定量PCR引物，引物設計和合成由寶生物工程有限公司完成。正向引物序列為：5′-GGGCGATGAGGACAGTGAT-3′；反向引物序列為：5′-ATGGGGTGTGTGTGCTGTG-3′。選取18S 基因作為內(nèi)參基因，其正向引物序列為：5′-CGAAAGCATTTGCCAAGAAT-3′；反向引物序列為：5′-GGCATCGTTTATGGTCGG-3′。

熒光定量PCR體系總體積為25 μL：12.5 μL Evagreen?qPCR Master Mix,1 μL正向引物(10 μmol/L),1 μL反向引物(10 μmol/L),2 μL cDNA，3.75 μL ROX，加入RNase-Free water補足至25 μL。反應條件：95℃預變性2 min；95℃變性5 s，60℃變性30 s，40個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析通過SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結果以“平均值±標準誤”表示，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時，采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan法；數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時，采用非參數(shù)檢驗。折線圖、柱狀圖由GraphPad Prism5軟件繪制。

2 結果

2.1 成骨細胞形態(tài)學特征顱骨骨片貼壁后2～21 d(圖1A,B,C)，細胞爬出的數(shù)量逐漸增加，直至鋪滿底部。第2天和第10天的細胞大多呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，第21天的細胞因過于密集，看不出細胞形態(tài)。純化后的子代細胞(圖1D,E)也呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，與MC3T3-E1細胞形態(tài)(圖1F)相似，有成骨細胞的典型特征。

圖1 原代和子代成骨細胞(標尺為2 μm) A.顱骨骨片貼壁后第2天，已有少數(shù)細胞爬出;B.顱骨骨片貼壁后第10天，爬出細胞數(shù)增多;C.顱骨骨片貼壁后第21天，爬出細胞鋪滿底部，細胞數(shù)過多，以至于看不出細胞形態(tài);D.純化后F1代細胞第3天;E.純化后F2代細胞第3天;F.MC3T3-E1細胞第3天

2.2 姬姆薩染色F2代細胞姬姆薩染色后，細胞質(zhì)染成淺紫紅色，細胞核染成紫紅色(圖2)。細胞形態(tài)更清晰，呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，具有成骨細胞特征(圖2)。細胞核呈現(xiàn)不明顯，可能是由細胞核和細胞質(zhì)的染色接近造成。

2.3 甲苯胺藍染色F2代細胞甲苯胺藍染色結果(圖3A，C)與MC3T3-E1(圖3B，D)一致。6孔板有藍色沉淀(圖3C)，細胞質(zhì)染成淺藍色，細胞核染成深藍色，區(qū)分明顯(圖3A)。細胞呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形(圖3A)，具有成骨細胞特征。

2.4 堿性磷酸酶(ALP)染色F2代細胞的6孔板中有紫黑色沉淀(圖4C)；倒置相差顯微鏡下，F(xiàn)2代細胞中存在黑色沉淀(圖4A)，這與MC3T3-E1(圖4B，D)一致。

圖2 姬姆薩染色的F2代細胞形態(tài)特征圖

圖3 F2代細胞、MC3T3-E1甲苯胺藍染色(標尺為1 μm) A,C.F2代細胞甲苯胺藍染色;B,D.MC3T3-E1甲苯胺藍染色

圖4 F2代細胞、MC3T3-E1 ALP染色(標尺為2 μm) A,C.F2代細胞ALP染色;B,D.MC3T3-E1ALP染色

2.5 茜素紅染色F2代細胞(圖5A)存在礦化結節(jié)(箭頭所指)，被染成深紅色，與MC3T3-E1(圖5B)一致。

圖5 F2代細胞、MC3T3-E1茜素紅染色(標尺為2 μm) A,F2代細胞茜素紅染色;B.MC3T3-E1茜素紅染色

2.6 褪黑素對成骨細胞增殖的影響在圖6中，0 μmol/L 褪黑素處理組的曲線即為成骨細胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)F3代成骨細胞在第1～5天生長緩慢，第5天生長加快，進入對數(shù)生長期；第11天進入平臺期；隨著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度褪黑素處理(0,10,50,100 μmol/L)的細胞均在在第11天進入增殖平臺期，不同濃度褪黑素處理間細胞的增殖差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同濃度褪黑素對成骨細胞增殖的影響

2.7 褪黑素對成骨細胞分化的影響由圖7可知，ALP活性在第3天有所降低，但隨著培養(yǎng)時間的增加，ALP的活性逐漸升高。由圖8可知，第1天，10 μmol/L 組和50 μmol/L組ALP活性顯著(P<0.05)高于0 μmol/L組和100 μmol/L 組的ALP活性極顯著(P<0.01)高于0 μmol/L組；第3天，10 μmol/L 組的ALP活性顯著(P<0.05)高于0 μmol/L 組；第7天，10 μmol/L組的ALP活性顯著(P<0.05)高于100 μmol/L組；第14天，100 μmol/L 組的ALP活性極顯著(P<0.01)高于0 μmol/L組。

圖7 雞成骨細胞ALP活性變化圖

2.8 褪黑素對成骨細胞BSP基因表達的影響數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，采用獨立樣本非參數(shù)檢驗，漸進顯著性水平P=0.09。結果見圖9，隨著褪黑素濃度的增加，BSP基因的相對表達量升高；100 μmol/L組的BSP基因相對表達量最高，0 μmol/L組的相對表達量最低。

3 討論

成骨細胞主要由骨髓基質(zhì)中的間充質(zhì)干細胞分化而來，是骨代謝過程中重要的功能細胞，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建過程，其體外培養(yǎng)是研究骨代謝的重要部分。目前，研究鼠和兔成骨細胞分離培養(yǎng)及鑒定的文章較多[11-12]，僅江莎等[13]對酶消化法、組織塊貼壁法和誘導骨髓間充質(zhì)干細胞法3種雞成骨細胞培養(yǎng)方法進行了比較，成功從15胚齡雞胚顱骨、18胚齡雞胚脛骨和1月齡青年雞脛骨中分離培養(yǎng)得到雞成骨細胞。本試驗采用組織塊貼壁法，成功從15胚齡雞胚顱骨中分離得到成骨細胞。

圖8 不同培養(yǎng)時間、不同褪黑素濃度處理的成骨細胞ALP活性變化

圖9 不同褪黑素濃度處理14 d成骨細胞BSP基因表達變化

成骨細胞一般通過觀察細胞形態(tài)特征和甲苯胺藍、堿性磷酸酶和茜素紅等染色鑒定。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)，參與骨骼鈣化，常被作為成骨細胞活性的生物標志物，其染色強陽性是成骨細胞的重要特征之一[14-16]。礦化能力是成骨細胞的一項重要生物學特征，主要通過茜素紅染色檢測。通過相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細胞和純化后的子代細胞均呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，具有成骨細胞的典型特征。姬姆薩染色使細胞形態(tài)更加清晰，明確了雞成骨細胞的細胞特征。堿性磷酸酶和茜素紅染色表明分離所得的細胞能生成堿性磷酸酶，且有良好的礦化功能，證實了該細胞具有典型的成骨細胞功能。甲苯胺藍使細胞質(zhì)染成淺藍色，細胞核染成深藍色，并且產(chǎn)生藍色沉淀，與MC3T3-E1染色結果一致，證實了分離所得細胞為成骨細胞。

本試驗通過對雞成骨細胞生長曲線的繪制發(fā)現(xiàn)，雞成骨細胞的生長分為3個階段，第1～5天為緩慢生長期，生長緩慢；第5天生長加快，進入對數(shù)生長期；第11天進入平臺期。這表明分離所得雞成骨細胞具有良好的生殖能力。大鼠和兔分離的成骨細胞第7天進入生長平臺期[17-18]，小鼠分離的成骨細胞增殖第6天達到高峰[19]，這與我們分離的雞成骨細胞存在差異，可能是由于物種差異造成的。

使用不同濃度的褪黑素處理成骨細胞，發(fā)現(xiàn)0,10,50,100 μmol/L褪黑素處理間細胞的增殖差異不顯著(P>0.05)，表明褪黑素對成骨細胞的增殖沒有影響。ALP活性的高低與成骨細胞的分化程度呈正相關，常作為成骨細胞早期分化的標志物[20]。本試驗中，所有褪黑素處理組的ALP活性均先下降，隨后隨著培養(yǎng)時間的增加而升高，表明成骨細胞的ALP活性存在時間依賴性，成骨細胞的分化隨著時間的增加而增強。在添加褪黑素的第1天和第14天，隨著褪黑素濃度的增加，ALP活性升高，表明褪黑素促進成骨細胞分化，且具有濃度依賴性，當褪黑素濃度升高至100 μmol/L時，促進成骨細胞分化作用差異達到極顯著水平(P<0.01)。而在第3天和第7天添加褪黑素后，促進成骨細胞分化的作用減弱，可能是因為成骨細胞正處在增殖階段，增殖的細胞越來越多，分化的細胞較少。而第1天增殖的細胞較少，第14天成骨細胞已經(jīng)處在增殖平臺期以后，此時成骨細胞可能大多數(shù)都進行分化，因而褪黑素促進其分化的效果顯著。

使用0，10，50，100 μmol/L褪黑素處理培養(yǎng)成骨細胞14 d，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，BSP基因的相對表達量升高，表明褪黑素的添加促進了成骨細胞BSP基因的表達，且具有濃度依賴性。BSP是成骨細胞分化的生物標志物之一[7]，因而上述結果也表明了褪黑素的添加促進了成骨細胞的分化，且分化效果隨褪黑素濃度的增加而增強。

本試驗通過組織塊貼壁法從15胚齡雞胚的顱骨中成功分離得到成骨細胞。成骨細胞ALP活性先降低，后升高，具有時間依賴性。褪黑素對成骨細胞的增殖無影響，但提高了成骨細胞ALP活性，促進了成骨細胞BSP基因表達和成骨細胞分化，且隨濃度增加而作用增強。