李 娜，梅馨月，李 琦，祖艷群

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南昆明 650201)

三七(Panax notoginseng)為五加科人參屬多年生草本植物［1］。三七以根部作為藥用部分，具有活血化瘀、消腫定痛的效果［2］，對心腦血管病也有療效。目前，云南省三七種植面積和產(chǎn)量分別占全國三七種植面積和總產(chǎn)量的98% 以上［3］。三七的主要產(chǎn)地位于云南省文山市，文山礦產(chǎn)資源豐富，豐富的礦業(yè)活動導(dǎo)致部分三七種植區(qū)域重金屬污染嚴(yán)重［4-5］。由于三七種植區(qū)域?qū)儆诟汇U鋅礦地區(qū)，鎘的土壤背景含量較高［6-10］，加上三七屬于多年蔭生植物，易富集重金屬［11-13］，所以部分地區(qū)的三七鎘含量較高，不僅嚴(yán)重制約著文山三七產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對中藥材安全和國際貿(mào)易也產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。施用石灰可以改良土壤，降低土壤的有效鎘含量，緩解鎘對植物的毒害作用［14］。在施加石灰時，施加量與土壤pH值之間有很大的關(guān)系。土壤pH值處于5.0～5.5之間、石灰施入量為3 000～6 000 kg·hm-2時植物的增產(chǎn)率最大，顯著高于用量低于750 kg·hm-2的石灰處理［15］。

三七的主要藥效成分為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷類物質(zhì)，其中Rg1、Rb1為人參皂苷，R1為三七皂苷，Rb1是人參二醇人參皂苷，Rg1是原人參三醇型人參皂苷，在合成過程中需要一些重要的酶催化作用才能進(jìn)行。其中，達(dá)瑪烯二醇合成酶(Dammarenediol-Ⅱsynthase，DS)催化 2，3-氧化鯊烯生成達(dá)瑪烯二醇(Dammarenediol)，再通過細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYPs)和糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase，GT)的催化，生成多樣的達(dá)瑪烷四環(huán)三萜類皂苷。在此過程中，鯊烯合酶(squalene synthase，SS)、鯊烯環(huán)氧酶(SE)、達(dá)瑪稀二醇合成酶(Dammarenediol-Ⅱsynthase，DS)、GT 和細(xì)胞色素P450是合成達(dá)瑪烷四環(huán)三萜類皂苷的關(guān)鍵酶［16-19］。目前，多數(shù)研究集中在外源添加石灰可以有效緩解Cd對三七生長、生理、根部形態(tài)和根系分泌物的影響，Cd脅迫下三七的藥效成分以及Cd污染下三七的健康風(fēng)險(xiǎn)上［20-22］，鮮見關(guān)于石灰緩解Cd對三七主要藥效成分以及關(guān)鍵酶影響的研究。因此，筆者研究外源添加石灰緩解Cd對三七藥效成分及合成中關(guān)鍵酶活性的影響，以期進(jìn)一步揭示外源添加石灰對Cd脅迫下三七藥效成分的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

田間試驗(yàn)于文山市丘北縣濫泥寨村(24°11"05″N，104°03"45″E)進(jìn)行。采取大田試驗(yàn)方法，供試品種為文山當(dāng)?shù)厝?，選擇一年生籽苗。土壤基本理化性質(zhì):pH值為5.3，w(有機(jī)質(zhì))為32.16 g·kg-1，w(全氮)為0.56 g·kg-1，w(全磷)為 1.69 g·kg-1，w(全鉀)為 15.95 g·kg-1，w(堿解氮)為 91.25 mg·kg-1，w(速效磷)為 18.83 mg·kg-1，w(速效鉀)為 99.51 mg·kg-1，w(Cd)為 0.30 mg·kg-1，按照GB 15618—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》，達(dá)到風(fēng)險(xiǎn)篩選值，應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測。

一年生籽苗移栽前土壤進(jìn)行鎘和石灰的處理:試驗(yàn)設(shè)置w(Cd2+)為6.0 mg·kg-1，采各個小區(qū)土樣，自然風(fēng)干，磨碎過篩后，稱量各個小區(qū)1 kg表層土，精確稱量3 m2所需 CdCl2·2.5H2O，與1 kg土壤均勻混合;設(shè)置4個石灰施用梯度:0、750、2 250、3 750 kg·hm-2，每個處理 3個重復(fù)。與 CdCl2·2.5H2O混合均勻的土和石灰分別與對應(yīng)小區(qū)0～15 cm土壤充分混勻后，再鋪回該小區(qū)表面，土壤平衡老化14 d后再移栽一年生三七籽苗。小區(qū)面積為3 m2，三七株行距為15 cm×15 cm，每個小區(qū)移栽120株三七籽苗。遮蔭棚內(nèi)光照為自然光照強(qiáng)度的18%左右，進(jìn)行常規(guī)栽培管理。

三七成熟期(10月20日)每小區(qū)采集10株三七進(jìn)行生物量、Cd含量、皂苷含量測定，同時采用抖土法采集相應(yīng)根際土壤樣品。植株充分清洗后，在105℃下殺青0.5 h，80℃下烘干至恒重，稱重后用研缽磨碎過1 mm孔徑篩后保存。土壤樣品風(fēng)干后過2 mm孔徑篩，測定土壤有效態(tài)鎘含量和pH值。同時，在田間采集5株三七后立刻放入液氮灌速凍，移入-80℃冰箱保存，測定酶活性。

1.2 指標(biāo)測定方法

1.2.1 土壤有效態(tài)Cd含量與pH值

參考GB/T 23739—2009《土壤質(zhì)量有效態(tài)鉛和鎘的測定原子吸收法》，稱取過2 mm孔徑篩的風(fēng)干土壤樣品5.00 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25.00 mL DTPA提取劑〔0.005 mol·L-1DTPA、0.1 mol· L-1三乙酰胺 (TEA)、0.01 mol·L-1CaCl2〕，在室溫(25℃左右)下放入振蕩器(JBZL-08智能氣浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司)振蕩(280 r·min-1)2 h后取下，過濾后的濾液用火焰原子吸收分光光度計(jì)(Thermo ICETM 3300 AAS)測定土壤有效態(tài)Cd含量。

取過2 mm孔徑篩的土樣，水土質(zhì)量比為2.5∶1，用pH計(jì)(ST3100-H，奧豪斯儀器有限公司)測定土壤pH值。

1.2.2 植物Cd含量的測定

準(zhǔn)確稱取0.2 g植物樣品于三角瓶中，放入數(shù)粒玻璃珠，加10 mL混合酸〔V(硝酸)∶V(高氯酸)=4∶1〕，加蓋浸泡過夜，然后加一小漏斗于電爐上進(jìn)行消解，若變?yōu)樽睾谏偌踊旌纤?，直至冒白煙，消化液呈無色透明或略帶黃色。放冷后用滴管將試樣消化液濾入10 mL容量瓶中并定容至刻度，混勻備用，同時做試劑空白。用火焰原子吸收分光光度計(jì)(Thermo ICETM 3300 AAS，美國)測定植物Cd含量。

1.2.3 皂苷含量的測定

采用高效液相色譜法測定皂苷含量，參考《中華人民共和國藥典(2015版)》。

(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，以水為流動相B進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長203 nm。理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(A相0～12 min為19%，12～60 min為19%～36%;B相0～12 min為81%，12～60 min為81%～64%)。

(2)對照品溶液的制備:精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品及三七皂苷R1對照品適量，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1 0.4 mg、人參皂苷Rb1 0.4 mg、三七皂苷 R1 0.1 mg的混合溶液。

(3)供試品溶液的制備:取樣品粉末0.6 g，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量后放置過夜，80℃水浴保持微沸2 h，放冷再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取濾液。

(4)測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀(Thermo HPLC-ultimate 3000，美國)，測定皂苷含量。

1.2.4 SE、DS、P450和 GT活性的測定

準(zhǔn)確稱量樣本鮮重，按照0.1 g鮮重加0.9 mL勻漿液進(jìn)行勻漿，4℃條件下靜置30 min，設(shè)定溫度為4℃，以3 000 r·min-1離心5 min(離心半徑為6 cm)，取上清液待用。分別用對應(yīng)的ELISA檢測試劑盒(OmniAb，美國)測定 SE、DS、P450和GT 活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用SPSS 19.0軟件相關(guān)性和差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 施加石灰對Cd脅迫下三七生物量的影響

Cd脅迫下，與未施加石灰相比，添加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰顯著增加了三七成熟期主根、剪口、須根和莖葉干重(P＜0.05)，其中三七的主根干重分別顯著提高13%、28%和31%;施加2 250和3 750 kg·hm-2三七剪口干重分別顯著增加50%和53%;施加3 750 kg·hm-2石灰三七莖葉和須根干重分別顯著增加17%和49%。三七不同部位生物量在石灰施加量為3 750 kg·hm-2時達(dá)到最大(圖1)。

2.2 施加石灰對Cd脅迫下土壤有效Cd含量和pH值的影響

從圖2可知，Cd脅迫下，與未施加石灰相比，施加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰土壤有效Cd含量分別顯著降低12.3%、27.1%和32.9%。施加2 250和3 750 kg·hm-2石灰土壤pH值顯著增加(P＜0.05)。

圖1 施加石灰對Cd脅迫下三七各部位生物量的影響Fig.1 Effect of lime on biomass of different parts of Panax notoginseng under Cd stress

圖2 施加石灰對Cd脅迫下土壤有效Cd含量和pH值的影響Fig.2 Effect of lime application on soil available cadmium content and pH under Cd stress

2.3 施加石灰對Cd脅迫下三七Cd含量的影響

三七不同部位Cd含量排序?yàn)轫毟炯艨冢厩o葉＞主根。與未施石灰相比，Cd脅迫下施加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰處理三七的莖葉Cd含量分別降低8%、37%和54%，須根分別降低11%、32%和50%，剪口分別降低14%、35%和49%，主根分別降低23%、34%和45%(圖3)。

2.4 施加石灰對Cd脅迫下三七皂苷含量及相關(guān)酶活性的影響

Cd脅迫下，施加2 250和3 750 kg·hm-2石灰處理成熟期三七主根Rg1、Rb1和R1含量與未施加石灰處理差異顯著(P＜0.05)。與未施石灰相比，施加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰處理Rg1分別增加9%和14%，Rb1分別增加29%～55%，R1分別增加10%～31%(圖4)。

從表1可知，隨著石灰施加量上升，R1/(Rg1+Rb1)比值上升，Rg1/Rb1比值下降，與未施加石灰相比均存在顯著差異(P＜0.05)。

6 mg·kg-1Cd脅迫下，施加750、2 250和3 750 kg·hm-2石灰與未施加石灰相比，三七主根鯊烯環(huán)氧酶(SE)活性分別顯著提高18%、42%和61%，達(dá)瑪烯二醇合成酶(DS)活性分別顯著提高7%、28%和54%，三七主根細(xì)胞色素P450單加氧酶分別顯著降低11%、21%和28%，糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)活性分別顯著降低13%、33%和40%(P＜0.05)(圖5)。

圖3 施加石灰對Cd脅迫下三七各部位Cd含量的影響Fig.3 Effect of lime on cadmium content of different parts of Panax notoginseng under Cd stress

圖4 施加石灰對Cd脅迫下三七單體皂苷含量的影響Fig.4 Effect of lime on saponins content of Panax notoginseng under Cd stress

表1 施加石灰對Cd脅迫下三七不同皂苷比值的影響Table 1 Influence of lime application amount on saponinsration of Panax notoginseng under Cd stress

圖5 施加石灰對Cd脅迫下三七皂苷合成相關(guān)酶活性的影響Fig.5 Effect of lime on three kinds of saponins content of Panax notoginseng under Cd stress

Rg1、Rb1和R1與P450還原酶和糖基轉(zhuǎn)移酶呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01，n=12)，Rg1、Rb1和 R1與DS和SE呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01，n=12)。

3 討論

Cd脅迫不利于三七生長和生物量的積累，會使三七葉片發(fā)黃，植株矮小，主根生物量減少。有研究表明施石灰可降低水稻［23］、小麥［24］、油麥菜［25］對Cd的吸收，促進(jìn)植物生長，提高植物生物量。Cd進(jìn)入植物通常不取決于Cd的總含量，而與其活性或有效態(tài)Cd含量有關(guān)［26］。土壤中交換態(tài)Cd含量的多少是植物有效態(tài)Cd含量的基礎(chǔ)，能被植物吸收的Cd形態(tài)受土壤等環(huán)境影響較大，土壤pH值是影響Cd遷移轉(zhuǎn)化的重要因素［27］。隨著施加石灰量的增加，土壤pH值顯著增加，土壤有效Cd含量顯著降低，這可能是隨著pH值上升，Cd的溶解度降低，從而減緩了Cd在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化［28］;也可能是石灰為堿性物質(zhì)，可調(diào)節(jié)土壤pH值，與土壤中各種物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。有研究表明，施加石灰可通過溶解作用釋放出OH-，與CO2反應(yīng)生成CO32-，碳酸根可與Cd離子生成難溶CdCO3［29-30］，隨pH值升高，難溶性CdCO3含量增加，降低了土壤中Cd的植物可利用性。這與筆者試驗(yàn)中施加石灰能夠降低三七中重金屬殘留量，提高Cd脅迫下三七生物量，降低三七中Cd含量的結(jié)論一致。

三七根中的次生代謝產(chǎn)物人參皂苷 Rg1、Rb1和三七皂苷R1是極其重要的3種藥用活性成分。Cd脅迫下，三七藥效成分的合成受到抑制［31］。張旭等［32］采用盆栽試驗(yàn)研究不同水平Cd污染土壤對板藍(lán)根主要藥用成分靛玉紅的影響，發(fā)現(xiàn)隨土壤中重金屬Cd含量的增大，靛玉紅含量降低。在該研究中，隨石灰施加量的上升，三七不同皂苷單體含量上升。達(dá)瑪烷型人參皂苷經(jīng)歷CYP450與GT多種氧化、羥基化、取代反應(yīng)和糖基化反應(yīng)生成原人參二醇人參皂苷Rb1和原人參三醇型人參皂苷Rg1和R1［33］。隨著石灰施加量上升，Rg1/Rb1比值上升，原人參二醇Rb1轉(zhuǎn)化為原人參三醇Rg1的速率增加，可能是因?yàn)槭┘邮沂沟猛寥纏H值有利于三七不同皂苷的合成，三七總皂苷含量顯著增加。三七皂苷R1是三七中特有的藥效成分，Rg1和Rb1為人參皂苷，在其他藥用植物中也存在。R1/(Rg1+Rb1)比值顯著上升，說明隨著施加石灰含量的上升，三七特有的皂苷種類三七皂苷R1含量增加。

Cd脅迫下，隨著石灰施加量的上升，SE活性和DS活性均顯著增加(P＜0.01，n=12)，但細(xì)胞色素P450活性和GT活性顯著降低，3種皂苷含量與細(xì)胞色素P450還原酶和GT呈極顯著負(fù)相關(guān)，與SE和DS呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。有研究表明，R1劑量依賴性抑制細(xì)胞色素P450活性，Rg1不抑制P450活性，Rb1 在濃度達(dá) 1 000 μmol·L-1時才輕微抑制細(xì)胞色素P450的活性［34］。R1對細(xì)胞色素P450的抑制作用呈濃度依賴性，隨著R1濃度增加，酶活性增加［35］。隨著R1含量的上升，P450活性降低，這可能是因?yàn)榧?xì)胞色素P450有解毒作用，所以隨著石灰施加量的上升，Cd脅迫對三七的毒害作用減小，細(xì)胞色素P450活性隨之降低。SE是一種單加氧酶，催化鯊烯合成2，3-氧化鯊烯，是三萜皂苷和植物甾醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。DS是氧化鯊烯環(huán)氧酶中的一種，催化2，3-氧化鯊烯環(huán)化為達(dá)瑪烯二醇。三七總皂苷(PNS)屬于達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷，而達(dá)瑪烯二醇是達(dá)瑪烷型皂苷的前體，所以DS在三萜皂苷合成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。隨著石灰施加量的上升，SE和DS活性上升，不同施加量處理之間存在顯著差異。施加石灰加速了三七總皂苷合成，參與三七總皂苷合成的酶活性也增強(qiáng)。施加3 750 kg·hm-2石灰最有利于三七的生長和三七藥效成分的合成，但還沒出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，后續(xù)試驗(yàn)可以繼續(xù)加大石灰施用量。

4 結(jié)論

(1)在云南地區(qū)土壤w(Cd)為6 mg·kg-1下，適當(dāng)施用石灰可增加或維持三七主根的生物量和皂苷產(chǎn)量，提高三七皂苷合成酶SE和DS活性。在筆者試驗(yàn)條件下，石灰施加量為3 750 kg·hm-2時三七的生物量和皂苷含量最大。

(2)Cd脅迫下，不同的石灰施加量間三七各部位Cd含量存在顯著差異。隨著石灰施加量的上升，三七不同部位Cd含量顯著下降，石灰施加量為3 750 kg·hm-2時效果最明顯。

(3)Cd脅迫下，隨著石灰施加量的上升，三七植株R1、Rb1、Rg1含量和 SE、DS活性顯著上升，P450和GT活性下降。