文蛤和菲律賓蛤仔血細胞的圖像流式分類分析

任星潮 李榮 張寧

摘要 [目的]探討新型圖像流式細胞儀在貝類血細胞分類中的應(yīng)用。[方法]建立了一種基于血細胞側(cè)向散射強度和面積測量的自動化方法，并與顯微觀察對比其在文蛤和菲律賓蛤仔血細胞分類中的效果。[結(jié)果]參考顯微鏡下可辨識的胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)，2種貝類的血細胞均可分為無顆粒、小顆粒及大顆粒3類，但基于人工辨識的統(tǒng)計結(jié)果缺乏量化標準，因此波動較大。圖像流式細胞儀通過定量分析可以獲得更精細、準確的測量結(jié)果。根據(jù)側(cè)向散射強度和面積差異，將文蛤和菲律賓蛤仔的血細胞分成無顆粒、小顆粒、中顆粒及大顆粒4類，占比分別為（6.59±1.11）%和（30.03±1.87）%、（34.85±2.95）%和（58.50±5.73）%、（21.95±0.75）%和（6.03±1.44）%、（36.75±4.75）% 和（5.36±2.38）%。2種貝類血細胞都呈現(xiàn)出由無顆粒細胞到大顆粒細胞逐漸增大的趨勢。[結(jié)論] 2種方法的分析結(jié)果既有聯(lián)系又不完全一致。相較于顯微觀察，圖像流式細胞儀利用精確的量化標準可辨識出更多的細胞類群，提示綜合利用不同的特征差異還可以獲得更精細的分類結(jié)果。此外，自動化的定量測量準確性好、通量高，是今后貝類血細胞分析的重要方法。

關(guān)鍵詞 文蛤;菲律賓蛤仔;血細胞;分類;流式細胞儀

Abstract [Objective] To discuss the application of a new kind of imaging flow cytometer in the classificatioin of shellfish hemocyte. [Method] An automated method based on the measurement of blood cell lateral scattering intensity and area was established，and its effect on hemocyte classification of Meretrix meretrix and Ruditapes philippinarum was compared with microscopic observation. [Result] Both of the hemocytes from the above shellfishes could be divided into 3 hemocyte populations of nongranular， smallgranular and largegranular hemocyte by microscopic observation according to the differences of distinguishable intracellular particles， but the proportions fluctuated due to lacking of quantitative criteria. More accurate results could be acquired by using a quantitative measurement of imaging flow cytometer. According to the difference of the side scattering intensity and area， the hemocytes of M. meretrix and R. philippinarum were divided into four types： nongranular， smallgranular， intermediategranular and largegranular hemocytes， and their populations in M. meretrix and R. philippinarum were （6.59±1.11）% and （30.03±1.87）%， （34.85±2.95）% and （58.50±5.73）%， （21.95±0.75）% and （6.03±1.44）%， （36.75±4.75）% and （5.36±2.38）% respectively. The cell size increased gradually from R1 to R4 for each shellfish.[Conclusion] Although there are differences between the consistencies between two methods still could be found. Compared with microscopic observation， the image flow cytometer can identify more cell groups by using precise quantification standards， suggesting that more refined classification results could be? obtained by using comprehensive use of different feature differences. In addition， automated quantitative measurement had good accuracy and high throughput，it is an important analysis method for? blood cells of shellfish in the future.

Key words Meretrix meretrix;Ruditapes philippinarum;Hemocyte;Classification;Flow cytometer

文蛤（Meretrix meretrix）和菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）同屬軟體動物門雙殼綱簾蛤目簾蛤科，是我國重要的經(jīng)濟貝種[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖環(huán)境跟不上發(fā)展的矛盾越來越突出，病害也日趨嚴重，給貝類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。文蛤、菲律賓蛤仔以及其他貝類都具有開放式循環(huán)系統(tǒng)，免疫防御基于血細胞為基礎(chǔ)的細胞和體液系統(tǒng)。一方面，血細胞通過吞噬各種有機和無機等顆粒和異物，清除異物、病原以及自身損傷或死亡細胞;另一方面，血細胞還可以持續(xù)或應(yīng)激產(chǎn)生各種必要的體液因子來調(diào)節(jié)免疫水平，調(diào)動防御系統(tǒng)參與宿主的免疫應(yīng)答過程[2-4]，因此血細胞是免疫系統(tǒng)研究的核心，既參與了細胞免疫又是體液免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)。分類是功能研究的基礎(chǔ)，長期以來關(guān)于貝類血細胞的分類一直存在不同的看法，長期缺乏統(tǒng)一的命名及量化標準[5-6]。有人將其分為無顆粒細胞、小顆粒細胞及大顆粒細胞3類，也有人認為還應(yīng)劃分出漿細胞作為第4類血細胞。人工辨識和常規(guī)流式細胞儀通常可以將貝類血細胞劃分為2～3種。為了更準確地開展貝類血細胞功能解析，筆者嘗試采用新型圖像流式細胞儀開展貝類血細胞分析，以期清晰地區(qū)分出各個血細胞類群。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1

試驗材料。試驗用文蛤和菲律賓蛤仔購自天津市王頂?shù)趟a(chǎn)批發(fā)市場。文蛤殼長（48.6±5.4）mm，菲律賓蛤仔殼長（35.2±4.6）mm，置于實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)，鹽度為（20±1）‰，水溫為（20±1）℃。暫養(yǎng)5 d后，選擇活力旺盛、體表無明顯傷殘的個體用于試驗。

1.1.2 試劑。

多聚甲醛購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞懸液的制備。

用一次性注射器，按抗凝劑與血淋巴體積1∶1從文蛤或菲律賓蛤仔后閉殼肌處分別抽取血淋巴，迅速混勻后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入等體積的4%甲醛溶液分散重懸，冰浴固定5 min，經(jīng)PBS洗滌后用吸頭小心吹散，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 顯微鏡觀察。

將上述2種貝類血細胞細胞懸液分別制備滴片，用Leica DM5000型顯微鏡觀察、照相，根據(jù)胞內(nèi)可辨顆粒的大小和含量差異對細胞歸類，并進行相關(guān)的統(tǒng)計和分析。

1.2.3 圖像流式細胞儀測量。

試驗所用的圖像流式細胞儀為Merck Millipore公司的FlowSight型，具有全新設(shè)計的管路系統(tǒng)，適宜各種混合樣品的快速分析，不易堵柱，同時可以采集每個樣品在明場及暗場各通道的實時圖像，便于比對印證，省去了回收檢測的操作。將前述固定、洗滌處理的細胞懸液經(jīng)70 μm細胞篩過濾，去除黏連細胞團，上機檢測，每個樣品采集30 000個樣點的測量數(shù)據(jù)和圖像，使用IDEAS Application軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 文蛤和菲律賓蛤仔血細胞的顯微觀察和分類

文蛤和菲律賓蛤仔血細胞的形態(tài)在顯微鏡下很相似，主要為橢圓形或近圓形，大小也較接近，部分細胞內(nèi)可見明顯的顆粒結(jié)構(gòu)，可以根據(jù)顆粒大小和數(shù)量將2種貝類血細胞分為無顆粒細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞3種。無顆粒細胞以胞內(nèi)沒有明顯可辨的顆粒為特征，細胞核清晰易辨。小顆粒細胞內(nèi)含有數(shù)量不等的細小的顆粒，粒徑約占細胞直徑的5%～10%，顆粒數(shù)量范圍變化較大，部分細胞核被顆粒遮擋。大顆粒細胞內(nèi)則多充滿大型顆粒，粒徑通常較均勻，約為細胞直徑的10%左右，細胞核多被顆粒完全遮擋（圖1）。分類統(tǒng)計結(jié)果顯示，2種貝類的無顆粒細胞占比統(tǒng)計較為接近，含有顆粒的血細胞在2種貝類血液中的占比均較大，其中文蛤的大顆粒細胞及菲律賓蛤仔的小顆粒細胞含量在各自全部血細胞中的占比均超過50%（表1）。

2.2 文蛤和菲律賓蛤仔血細胞的圖像流式測量和分類

采用圖像流式細胞儀測量文蛤和菲律賓蛤仔的血細胞及顆粒特征，所反映的是貝類血細胞內(nèi)全部顆粒及其結(jié)構(gòu)的綜合差異。通過對比各項測量參數(shù)和分析策略，確定優(yōu)化方案如下：以側(cè)向散射強度和面積為橫坐標、縱坐標繪圖，根據(jù)單細胞樣點聚集情況劃定各類群設(shè)門邊界，并結(jié)合同步采集的圖像進行比較分析。2種貝類血細胞類群分布具有明顯的一致性，均可聚集為4個類群，且邊界清晰。綜合量化分析獲得的顆粒特征及輔助圖像，將2種貝類的血細胞劃定為無顆粒細胞、小顆粒細胞、中顆粒細胞和大顆粒細胞4種，分別用R1、R2、R3和R4表示（圖2）。R1類群位于散點圖底部，散射面積極小，說明幾乎不含顆粒結(jié)構(gòu)，屬于無顆粒細胞。同步采集的圖像顯示胞內(nèi)缺乏折光物質(zhì)。R2類群的側(cè)向散射面積較大，但強度相對略低，表明其中含有較多顆粒，但顆粒結(jié)構(gòu)總體不夠復雜，屬于小顆粒細胞;輔助圖像表明胞內(nèi)具有較明顯的折光組分。R3類群側(cè)向散射面積不大，但具有較大的側(cè)散強度表明其胞內(nèi)的顆粒占比不大，但結(jié)構(gòu)較為復雜，歸為中顆粒細胞;同步獲得的圖像提示其中可見顆粒不顯著，但折光性很強，與側(cè)向散射的測量提示吻合。R4類群位于散點圖右上方，表明胞內(nèi)富含顆粒且顆粒結(jié)構(gòu)最復雜，屬于大顆粒細胞，其側(cè)向散射通道的圖像也可見胞內(nèi)充滿高折光物質(zhì)。以無顆粒細胞的平均大小為基準，分別測量、對比各類細胞發(fā)現(xiàn)，2種貝類中的4種血細胞都呈現(xiàn)出從R1到R4類型逐漸增大的趨勢。另外，文蛤和菲律賓蛤仔的各類群細胞比例存在較大差異，前者無顆粒細胞占比很小，其他3類細胞比例較為接近，后者血淋巴中以無顆粒和小顆粒細胞占比較大（表2）。

3 結(jié)論與討論

由于分析方法差異，貝類的血細胞分類一直存在不同的觀點，同一種貝類的細胞種類和比例在不同研究中也有差異，其中一個主要原因就是缺乏一致認同的量化標準。對于以功能研究為目標的血細胞分類分析來說，基于細胞表面抗原特征的檢測方法是較為通用的，但無脊椎動物血液研究方面缺乏特定的分類抗體，因此嚴重制約了其細分功能的深入分析。

流式測量是目前較為有效的定量方法，但常規(guī)流式受限于其測量參數(shù)和測量范圍，對無脊椎動物血細胞分析尚在摸索階段。該研究比較了常規(guī)顯微觀察與新型流式細胞儀對文蛤及菲律賓蛤仔血細胞的分類情況。2種方法都能夠根據(jù)細胞內(nèi)顆粒狀況將血細胞分為不同的類群，但分類結(jié)果不盡相同。顯微觀察是最為常用的分類手段，通過對血細胞內(nèi)可見顆粒的大小及含量的人工辨識來區(qū)分細胞類別，2種貝類的血細胞都可據(jù)此分為無顆粒細胞，小顆粒細胞及大顆粒細胞3種，其中含有顆粒的細胞總數(shù)占比很大，與Chang等[7]和劉東武等[8]對文蛤和菲律賓蛤仔的觀察結(jié)果相近，但Zhang等[9]和王文琪等[10]對上述2種貝類血細胞的觀察均顯示不含顆粒的細胞占比較大。產(chǎn)生這種差異的原因與目前尚缺乏統(tǒng)一的顯微觀察判定標準有關(guān)，因此此次檢測的結(jié)果受主觀判斷波動的影響較大，這也提示需要用更準確的量化標準來分析血細胞類群。

與顯微觀察對比，該研究首次將一種新型圖像流式細胞儀用于貝類血細胞的測量和分析。針對顆粒特征，該儀器除了能分析前向散射及側(cè)向散射的高、寬、面積外，還能測量強度等重要參數(shù)，因此與常規(guī)流式細胞儀相比更適合開展探究性工作。通過綜合比較各種分析策略，確定了依據(jù)側(cè)向散射強度及面積的綜合差異區(qū)分細胞類型的優(yōu)化方案，能夠?qū)⒑蓄w粒的細胞更清晰地分為小顆粒細胞、中顆粒細胞及大顆粒細胞3種。精確測量也進一步印證了顯微觀察結(jié)果，即2種貝類的血淋巴中含有顆粒的細胞占比較大。大量研究[11-14]表明，甲殼動物細胞內(nèi)也具有類似的顆粒，有些還有膜結(jié)構(gòu)包裹，因此其側(cè)向散射信號應(yīng)該來源于這些顆粒中所包含的物質(zhì)。由于側(cè)向散射是對胞內(nèi)全部折光結(jié)構(gòu)的測量，既包括前述可見顆粒中的，又包括胞質(zhì)內(nèi)難以辨識的細小結(jié)構(gòu)，所以能更客觀地反映細胞內(nèi)的顆粒的總體差異。晉偉等[15]提出應(yīng)將新型檢測手段用于水生動物血細胞自動化“驗血”分析。常規(guī)流式細胞儀可用于多種貝類的血細胞分析[16-22]，但受限于測量模塊，大多僅能將血細胞分為2～3類，占比各不相同，類群邊界也不夠清晰;胡錦麗等[23-24]利用圖像流式細胞儀首次以精確的定量標準將甲殼動物血細胞清晰分為4類，各類細胞的體積呈現(xiàn)出與該研究一致的由R1類型向R4類型逐漸增大的變化趨勢。微球吞噬試驗結(jié)果顯示，各類細胞均具有吞噬功能，而以無顆粒及小顆粒細胞為主要吞噬類群。該研究首次將新型流式細胞儀引入貝類血細胞分析，用側(cè)向散射強度和面積差異區(qū)分出了4種血細胞，邊界清晰。對比甲殼動物的血細胞圖像流式分析可見，基于血藍蛋白攜氧的多種無脊椎動物的血細胞都能夠以側(cè)向散射強度和面積差異分為4個類群，而且散點圖的設(shè)門模式十分接近，提示不同進化階段的物種之間在血細胞功能方面也應(yīng)具有一定的相似性。此外，就某一動物而言，其血細胞的4個類群之間普遍缺乏過渡樣點，也進一步提示細胞類群之沒有相互轉(zhuǎn)化，至少在外周血中彼此獨立，每種細胞具有明確的功能。例如，無顆粒細胞以其較為疏松的胞質(zhì)空間承載吞噬的異物，而各種顆粒細胞則生成特定的功能分子，儲存于顆粒結(jié)構(gòu)中，或以量化的方式分泌到循環(huán)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)各類血細胞和機體的功能。

目前，針對多種貝類的血細胞分類的研究結(jié)果存在一些差異，一方面是各種血細胞的比例在不同貝類中不同;另一方面是因為針對同一種貝類的血細胞類群組成，采用不同分析方法所獲得的結(jié)果也不盡相同。前者體現(xiàn)了物種差異及動物與所在環(huán)境的適應(yīng)關(guān)系等，而后者則提示各種方法依據(jù)不同的特征差異都可對血細胞進行區(qū)分，但以更精準的量化標準作為分類依據(jù)才能讓各項研究具有可比性，從而挖掘出更準確的規(guī)律。這一點在醫(yī)學血液學分類研究中最為明顯，從早期僅能簡單區(qū)分紅細胞與白細胞，到現(xiàn)今依靠各種細胞分化抗原辨識更為精細的細胞類群，經(jīng)歷了長時間的發(fā)展完善，并推動了免疫細胞功能研究的持續(xù)深入，為疾病的檢測、預防和治療提供了基礎(chǔ)性的支撐。因此，隨著新技術(shù)與新方法的不斷完善，貝類血細胞會有更多類群被鑒定出來，該研究在自動化定量分類方面提供了一種新的策略，有助于推動該目標的實現(xiàn)。

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