孫心如 王印庚 王凱

摘要 [目的]研究深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖系統(tǒng)許氏平鲉（Sebastes schlegeli）腸道與環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)的周年變化規(guī)律及其與疾病發(fā)生的相關(guān)性。[方法]采用高通量測序技術(shù)在2016—2017年一個年度內(nèi)對同一網(wǎng)箱中不同月份許氏平鲉的腸道（Int）、海水（W）、冰鮮餌料（F）及網(wǎng)衣附著物（N）中的細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)進行比較分析。[結(jié)果]不同月份深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖系統(tǒng)中菌群多樣性為W>N>F>Int。溫度和季節(jié)變化可影響?zhàn)B殖系統(tǒng)中前20種優(yōu)勢菌種豐度的排名次序，其中腸道與冰鮮餌料樣品中發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）在2016年7、11月出現(xiàn)較大比重，對應的OTU數(shù)量占該樣品全部OTU數(shù)量的28.07%、19.25%和8.99%、38.75%。同時，腸道與冰鮮餌料樣品中弧菌屬（Vibrio）在2016年8、9月，2017年6、8月樣品中相對豐度顯著上升，分別為5.72%、5.94%、8.40%和8.34%、6.08%、30.73%。PCoA圖表明，加權(quán)與未加權(quán)條件下水樣和網(wǎng)衣附著物樣品菌群相關(guān)性較低，而腸道樣品與冰鮮餌料菌樣品群相關(guān)性較高。[結(jié)論]許氏平鲉深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖系統(tǒng)周年內(nèi)在溫度較高的月份致病菌比例明顯增加，冰鮮餌料作為病原菌主要載體，是影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的主要因素，成為網(wǎng)箱養(yǎng)殖系統(tǒng)魚類發(fā)病的潛在隱患。

關(guān)鍵詞 許氏平鲉;細菌多樣性;群落結(jié)構(gòu);高通量測序

Abstract [Objective]To study the annual change of intestinal and environmental flora structure of Sebastes schlegeli in the deepsea cage culture system and its correlation with disease occurrence.[Method]The highthroughput sequencing technology was used to compare and analyze the bacterial diversity and community structure in the intestine （Int），culture water （W），chilled bait （F） and net attachment （N） of S.schlegeli in the same cage in different months from 2016 to 2017.[Result]The flora diversity in deepsea cage culture system in different months was W>N>F>Int.As the temperature and season changes，the order of the top 20 dominant species abundance in the survival system can be affected.Among the Int and F samples，the Photobacterium in the July and November 2016 samples had a large proportion.The corresponding number of OTUs accounted for 28.07%，19.25% and 8.99%，38.75% of the total OTU of the sample.At the same time，the relative abundance ratio of Vibrio in the Int and F samples in August，September，2016 and June，August 2017 were significantly increased，which was 5.72%，5.94%，8.40% and 8.34%，6.08%，30.73%，respectively.PCoA showed that under the weighted and unweighted conditions，the correlation between W and N was relatively small，while the correlation between Int and F was relatively large.[Conclusion]The percentage of pathogenic bacteria increased significantly in the month of higher temperature during the anniversary of S.schlegeli deepsea cage culture system.As a main carrier of pathogenic bacteria，chilled bait was the main factor affecting the structure of intestinal flora and became potential risk of fish disease in cage culture system.

Key words Sebastes schlegeli;Bacterial diversity;Community structure;Highthroughput sequencing

許氏平鲉（Sebastes schlegeli），隸屬于輻鰭亞綱（Actinopterygi）、鲉形目（Scorpaeniformes）、鲉科（Scorpaenidae）、平鲉屬（Sebastes），又稱“黑鲪”或“黑石鱸”[1]，主要分布于太平洋西北部，鄂霍次克海南部，日本北海道以南，朝鮮東西兩岸以及我國的渤海、黃海和東海沿岸水域等[2-3]。因其具有經(jīng)濟價值高，抗低溫能力較強[4]，能夠在我國北方海域自然越冬和度夏等優(yōu)良性狀，逐漸成為黃、渤海區(qū)域大型海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要魚類品種之一。近年來，隨著我國深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，許氏平鲉的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量也在逐年增加，但病害發(fā)生率也逐年上升。近年來，以皮膚潰瘍?yōu)榇淼募毦约膊5]，在我國黃渤海海域大型深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的許氏平鲉中普遍發(fā)生，給許氏平鲉養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失[6]。

疾病發(fā)生的三圈理論認為，養(yǎng)殖動物機體健康、環(huán)境和病原是疾病發(fā)生過程中的3個核心要素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，微生物群落則承擔著重要的微生態(tài)功能，菌群結(jié)構(gòu)的變化可以全面或者部分反映養(yǎng)殖環(huán)境的變化情況[7]，進而作為疾病可能發(fā)生的預判指標之一。如養(yǎng)殖環(huán)境條件惡化時，病原菌可以大量增殖，打破原有的微生態(tài)平衡，改變穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)，最終導致養(yǎng)殖生物感染發(fā)病[8-9]。相比于傳統(tǒng)的池塘或工廠化等養(yǎng)殖模式，深海網(wǎng)箱是一個開放的養(yǎng)殖系統(tǒng)，關(guān)于其微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究相對較少。

該研究在山東長島地區(qū)許氏平鲉深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖聚集區(qū)挑選其中的一口網(wǎng)箱作為研究對象，利用高通量測序技術(shù)，對養(yǎng)殖過程中的魚體腸道、海水、投喂的餌料和網(wǎng)箱網(wǎng)衣附著物的細菌群落進行一個周年的跟蹤監(jiān)測研究，并分析其結(jié)構(gòu)變化與養(yǎng)殖許氏平鲉皮膚潰瘍癥發(fā)生的相關(guān)性，以期進一步認識深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖系統(tǒng)菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類疾病發(fā)生的有效預警和科學防控提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

所有樣品均采集于山東省長島縣大欽島周邊的許氏平鲉深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)固定的一口網(wǎng)箱，采樣時間為2016年7月—2017年8月，共進行9次采樣。每次采集的樣品包括魚、冰鮮餌料、海水和網(wǎng)衣附著物。其中，魚樣品為隨機從網(wǎng)箱中釣取的許氏平鲉活魚3尾（體重100～200 g），采用打包充氧的方式活運至實驗室做進一步分析;餌料為投喂的冰鮮雜魚，隨機稱取50 g放入采樣袋中;用采水器采集2 L網(wǎng)箱中心點中層深度的海水樣品裝入無菌瓶中;采集一定量附著在網(wǎng)衣上生長的動植物樣本放入采樣袋中。上述所有現(xiàn)場采集的樣本，均放入加有冰袋的低溫采樣箱中，帶回實驗室進行后續(xù)處理，樣品明細及采集時間見表1。

1.2 樣品處理 將帶回實驗室的許氏平鲉活魚先放置于冰水中浸泡至休克狀態(tài)，然后置于解剖盤中用70%乙醇棉球擦拭體表并用無菌海水沖洗，解剖剪取3 cm左右長度的腸道中段，放置于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌后的鑷子輕輕擠出腸道內(nèi)容物，再用注射器從腸道一端緩慢注射1 mL無菌海水進行沖洗，之后從中段剪取1 cm長度的腸道樣品放入無菌試管中，勻漿后備用。餌料和網(wǎng)衣附著物樣品用無菌海水沖洗2次后，各稱取1 g，分別放入無菌試管中，勻漿后備用。采集的2 L海水水樣經(jīng)0.22 μm孔徑的無菌纖維素濾膜抽濾，將濾膜放入無菌試管中剪碎，并滴加2～3滴無菌海水使其保持濕潤備用。

1.3 細菌總DNA提取

經(jīng)“1.2”處理的備用樣品用美國OMEGA 公司的Soil DNA Kit試劑盒提取細菌總DNA，將提取后的DNA放入液氮罐中保存。其中魚腸道樣品分為3個平行樣，海水水樣、餌料樣品和網(wǎng)衣附著物樣品各設(shè)1個樣品。

1.4 高通量測序分析

待上述所有樣品的細菌總DNA全部提取完畢后，擴增16S rDNA序列的v3～v4可變區(qū)，引物序列為341F：CCTACGGGNGGCWGCAG;806R：GGACTACHVG GGTATCTAAT。PCR反應體系為15 mmol/L MgCl2的10×Buffer緩沖液 10.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，10 μmol/L引物各5 μL，5 U/μL Taq酶1.0 μL，DNA模板4.0 μL，滅菌去離子水73 μL，總體積100 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，連續(xù)30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。每個PCR樣本設(shè)置3個平行，所得產(chǎn)物混合后經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用Quanti FluorTM熒光定量系統(tǒng)進行定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合，送商業(yè)測序公司用Hiseq2500 PE250測序平臺進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過拼接、過濾獲得有效數(shù)據(jù)，用Mothur軟件結(jié)合Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。以97%相似性為標準劃分操作分類單元OTU （operational taxonomic unit）作為分類和計算的依據(jù)?；贠TU結(jié)果計算樣本的ACE指數(shù)，用Excel分析并繪制屬水平的相對豐度圖，使用R語言的gmodels制作主成分分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌群α多樣性分析

ACE指數(shù)是微生物多樣性分析中常用的α多樣性指數(shù)，以97%相似性水平為標準劃分可操作分類單元（OTU），主要體現(xiàn)物種的豐富度信息，ACE指數(shù)大說明養(yǎng)殖環(huán)境菌群的豐富度高[10-11]。將9個時間點的樣品數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，許氏平鲉腸道（Int）、海水（W）、餌料（F）及網(wǎng)衣附著物（N）的菌群ACE指數(shù)如圖1所示。在一年9個時期的樣品中，水樣的ACE指數(shù)平均為1 847，是同期樣品的最高值;其次是網(wǎng)衣附著物，ACE指數(shù)平均為1 395;而餌料與腸道的細菌種類豐富度較低，ACE指數(shù)平均為1 049和969。菌群多樣性順序為海水、網(wǎng)衣附著物、餌料腸道。菌落多樣性也存在顯著的季節(jié)性變化，海水樣品的ACE指數(shù)表現(xiàn)為3月最高，8月最低，最高值為2 374，最低值為990;腸道樣品的ACE指數(shù)隨季節(jié)變化較穩(wěn)定，在8月達到最高值1 195，11月為最低值757;餌料樣品在5、6月ACE指數(shù)較高，分別為1 303、1 357;網(wǎng)衣附著物樣品在9月ACE指數(shù)出現(xiàn)最高值1 735，11月最低818。

2.2 菌群結(jié)構(gòu)組成及豐度分析

不同月份的腸道、海水、餌料及網(wǎng)衣附著物屬水平細菌群落組成如圖2所示。Int樣品中檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）占有絕對優(yōu)勢，相對豐度為37.0%～49.8%;其次是不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。其中2016年7、11月樣品中出現(xiàn)較大比重發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），對應的OTU數(shù)量占該樣品全部OTU數(shù)量的28.07%和19.25%。同時，在2016年8、9月和2017年8月樣品中弧菌屬（Vibrio）相對豐度明顯增加，占比分別為5.72%、5.94%和8.40%。餌料樣品與腸道樣品的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)組成非常相似，檸檬酸桿菌屬仍為優(yōu)勢菌屬，相對豐度為9.86%～22.85%。發(fā)光桿菌屬和弧菌屬在多個月份中也具有一定的優(yōu)勢，2016年7、11月發(fā)光桿菌屬相對豐度分別為8.99%和38.75%，2016年8、9月和2017年6月弧菌屬相對豐度分別為8.34%、6.08%和30.73%。同腸道樣品和餌料樣品菌群結(jié)構(gòu)相比，海水水樣與網(wǎng)衣附著物樣品在屬水平上無明顯優(yōu)勢菌群，在分類上更加多樣化，包括檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬、弧菌屬、Actinomarina屬和浮霉菌屬（Planctomyces）。

2.3 不同樣品菌群相關(guān)性分析

Unifrac距離是用于比較生物群落的距離度量，其主要原理是利用各樣品序列間的進化信息來比較樣品在特定的進化譜系中是否有顯著的微生物群落差異[12]。Unifrac包括weighted Unifrac（加權(quán)，定量）和unweighted Unifrac（未加權(quán)，定性），weighted Unifrac考慮生物群落的存在和豐度，而unweighted Unifrac僅考慮群落的存在[13]。為進一步研究腸道、餌料、海水及網(wǎng)衣附著物各樣品之間的菌群相關(guān)性，在2種計算模式下對各樣品進行PCoA分析（圖3、4），圖中的每一個點代表一個樣本，兩點之間距離越近表明兩者的群落構(gòu)成差異越小，可以通過PCoA圖觀察到各樣本之間的相關(guān)性。圖3為未加權(quán)條件下的PCoA圖，表示在不考慮豐度的條件下餌料樣品與腸道樣品各樣本之間距離比較接近，而網(wǎng)衣附著物樣本與養(yǎng)殖水體樣本各自聚集。表明腸道樣品與餌料樣品相關(guān)性很高，而與網(wǎng)衣附著物和養(yǎng)殖水體相關(guān)性較低。此時，2個主成分PCo1和PCo2貢獻值分別為14.94%和7.30%。圖4為加權(quán)條件下主成分圖，在考慮微生物群落豐度的基礎(chǔ)上，仍然是腸道樣品與餌料樣品相聚在一起，且聚合度比在未加權(quán)條件下更高。此時，2個主坐標共同解釋了72.40%的群落差異。通過對腸道、餌料、海水及網(wǎng)衣附著物樣品的定量與定性分析，證明餌料與腸道樣品的相關(guān)性較高，與海水和網(wǎng)衣附著物相關(guān)性較小，餌料是影響腸道菌群的主要因素。

3 討論

網(wǎng)箱養(yǎng)殖是一個開放的系統(tǒng)，水體溫度、鹽度、溶解氧等環(huán)境因子的變化均牽動養(yǎng)殖環(huán)境菌群多樣性的組成[14-15]，相同條件下網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)海水的菌群豐富度顯著高于非養(yǎng)殖區(qū)，且同一養(yǎng)殖區(qū)在不同月份的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性也存在顯著差異[16]。該研究發(fā)現(xiàn)，長島地區(qū)網(wǎng)箱樣品菌群的ACE指數(shù)從大到小依次為海水、網(wǎng)衣附著物、餌料、腸道，研究結(jié)果與許燕等[17]對斑石鯛腸道、餌料與養(yǎng)殖環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)的多樣性研究結(jié)論相似。吳建平等[18]和涂志剛[16]對大亞灣和海南后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)的細菌豐度和微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，海水ACE指數(shù)高峰期分別在5、11月，與該研究結(jié)果海水細菌多樣性在3月最高（2 374）不同，這可能與溫度有關(guān)，該研究采樣地渤海海域的海水溫度呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性波動，而處于熱帶地區(qū)的海南海域的全年海水溫度總體上波動幅度不大，更適宜細菌的繁殖生長。

養(yǎng)殖區(qū)微生物群落的結(jié)構(gòu)變化與魚類病害的發(fā)生也有一定的相關(guān)性。金珊等[19]對浙江象山和奉化海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)域細菌動態(tài)進行了研究，發(fā)現(xiàn)溫度高峰期是魚病的頻繁發(fā)生期。王凱[20]研究的長島地區(qū)許氏平鲉的大規(guī)模死亡主要集中在6—11月，分離鑒定病原為輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）[21]和美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種（Photobacterium damselae subsp.Damselae）[5]。該研究發(fā)現(xiàn)，弧菌屬在

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8、9月海水、腸道及餌料樣品中含量較高，且相對豐度達5.39%～10.80%，發(fā)光桿菌屬在7、11月腸道和餌料樣品中的相對豐度達到最高值，為8.99%～38.75%，與疾病暴發(fā)期相吻合。同時研究結(jié)果顯示，在2016—2017年一個年度內(nèi)冰鮮餌料菌群結(jié)構(gòu)變化比較顯著，致病菌呈現(xiàn)夏、秋季高，而冬、春季低的特點，說明在夏、秋季節(jié)冰鮮餌料作為許氏平鲉食物來源，極有可能攜帶大量致病菌，是病原菌導入養(yǎng)殖魚體和養(yǎng)殖系統(tǒng)的主要來源渠道。腸道樣品的菌群變化比較顯著且與餌料相關(guān)性較高，作為魚體的消化器官，腸道是致病菌的首要入侵部位，菌群平衡一旦遭到破壞，宿主就會因腸道菌群紊亂而發(fā)生各種疾病，導致魚體死亡[22-23]。海水菌群結(jié)構(gòu)變化比較穩(wěn)定，僅在夏季出現(xiàn)較高的弧菌屬，說明開放性海域水體的菌群結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，海水的流動性和季節(jié)性的溫度變化很有可能對其中菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性造成了較大的影響。

水產(chǎn)動物腸道菌群結(jié)構(gòu)與日常投喂的餌料關(guān)聯(lián)緊密，餌料中攜帶的病原菌，添加益生菌、抗生素、微生態(tài)制劑[24-26]等都可以造成腸道菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。而腸道菌群對養(yǎng)殖動物的生長代謝、營養(yǎng)吸收、疾病發(fā)生[27-30]都有極其重要的作用。該研究發(fā)現(xiàn)疾病頻發(fā)的夏季高溫期，餌料和腸道樣品中均出現(xiàn)較大比例的發(fā)光桿菌屬細菌。PCoA圖顯示餌料樣品與腸道樣品相靠攏，表明腸道菌群與餌料菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)性較高，與海水和網(wǎng)衣附著物樣品相似度較低，餌料成為影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的主要因素。該研究所采餌料樣品均為冰鮮魚蝦，由于來源不穩(wěn)定及長期存放易變質(zhì)等客觀原因，其中往往攜帶大量的病原微生物，成為導致該地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖許氏平鲉發(fā)病的主要原因之一。國外學者在進行網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類疾病發(fā)生原因的調(diào)查后，也認為冰鮮雜魚是疾病發(fā)生的主要誘因之一[31-32]。對于網(wǎng)箱養(yǎng)殖系統(tǒng)而言，選擇使用人工配合飼料，杜絕病原菌導入，是防控疾病發(fā)生的有效方式之一。

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