趙陽(yáng) 游元丁 冉茂乾

摘要 [目的]通過(guò)樣品的分離鑒定，提升檢測(cè)能力，確保檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性和可靠性，增加檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)。[方法]根據(jù)樣品指導(dǎo)書(shū)和標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.5—2012，分離編號(hào)分別為19-A766和19-A835的2個(gè)測(cè)量審核樣品，并進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)鑒定，同時(shí)使用全自動(dòng)微生物鑒定儀（VETEK 2 COMPACT）進(jìn)行確認(rèn)。[結(jié)果] 19-A835 25 mL樣品中未檢出志賀氏菌，19-A766 25 mL樣品中檢出志賀氏菌;測(cè)量審核結(jié)果為滿意結(jié)果。[結(jié)論]此次測(cè)量審核結(jié)果豐富了檢測(cè)人員的檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，提高了檢測(cè)能力，為進(jìn)一步完善食品檢測(cè)工作打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 志賀氏菌;測(cè)量審核;檢測(cè)能力;分離;鑒定

Abstract [Objective]Through the separation and identification of samples， improve the detection ability， ensure the authenticity and reliability of the test results， and increase the testing experience.[Method]The separated samples （named as 19A766 and 19A835） were identified using biochemistry and serology methods， and validated using a fully automated microbiome （VETEK 2 COMPACT） according to the sample instructions and standard GB 4789.5-2012. [Result]The Shigella was detected in 19A766 （25 ml） samples， but not in 19-A835 （25 mL） samples. The measurement audit results were regarded as satisfaction. [Conclusion]Our analysis enriches the experience and increases the ability of inspectors， which may provide a solid foundation for further food testing.

Key words Shigella;Measurement review;Test ability;Isolation;Identification

《能力驗(yàn)證規(guī)則》（CNAS-RL02：2018）[1]定義能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力。測(cè)量審核（measurement audit）是能力驗(yàn)證計(jì)劃的一種，有時(shí)也稱為“一對(duì)一”的能力驗(yàn)證計(jì)劃，是實(shí)驗(yàn)室對(duì)被測(cè)物品（材料或制品）進(jìn)行實(shí)際測(cè)試，將測(cè)量結(jié)果與參考值進(jìn)行比較的活動(dòng)。測(cè)量結(jié)果的滿意度是判定實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展或校準(zhǔn)該項(xiàng)目能力的標(biāo)準(zhǔn)，是能力驗(yàn)證計(jì)劃的有效補(bǔ)充，也是中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（China national accreditation service for conformity assessment， CNAS）判定實(shí)驗(yàn)室能力的重要技術(shù)依據(jù)[1-2]。

志賀氏菌屬（Shigella）是一類具有高度傳染性和嚴(yán)重危害性的革蘭氏陰性腸道致病菌，是細(xì)菌性痢疾的病原菌，臨床感染可導(dǎo)致痢疾，其癥狀以發(fā)熱、脫水和便血為特征，其在自然界中分布較為廣泛，對(duì)人類和動(dòng)物健康造成嚴(yán)重的影響。志賀桿菌屬分為4群：痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌[3-4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，由志賀氏菌引起的腸道感染病例全球每年約有1.2億，造成死亡的有60多萬(wàn)[5]。在我國(guó)食源性致病菌中，志賀氏菌感染導(dǎo)致的痢疾病例占細(xì)菌性痢疾病例的8.5%[6]。引起志賀氏菌感染的食品主要有奶和奶制品、生的蔬菜、水果、沙拉、土豆、禽肉（魚(yú)肉、雞肉、蝦）、面包制品等，幾乎涵蓋了人們?nèi)粘?duì)食品的基本需求。因此，提高檢測(cè)人員對(duì)志賀氏菌檢測(cè)能力極為重要。

筆者通過(guò)國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中傳統(tǒng)的檢測(cè)方法[7]，對(duì)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供的測(cè)量審核樣進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到提升檢測(cè)人員檢測(cè)素質(zhì)和能力的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品信息。樣品購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心，編號(hào)分別為19-A766和19-A835。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑。志賀氏菌增菌肉湯、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、麥康凱瓊脂（MAC）、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、志賀氏菌干制生化鑒定試劑盒等均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;VITEK2革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡購(gòu)自生物梅里埃公司;志賀氏菌全套診斷血清購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限公司。所有培養(yǎng)基和試劑均驗(yàn)證合格且在有效期內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理。樣品性狀為白色凍干塊狀，包裝于真空西林瓶?jī)?nèi)，按樣品說(shuō)明準(zhǔn)備待測(cè)樣品原液。

1.2.2 增菌。在生物安全柜內(nèi)以無(wú)菌操作取檢樣25 mL加入裝有滅菌的225 mL志賀氏菌增菌肉湯的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放置于密封盒（已放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋和氧氣指示劑）內(nèi)，于（41.5±1.0）℃，厭氧培養(yǎng)16～20 h。增菌結(jié)果如表1所示。

1.2.3 分離。取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂、MAC瓊脂和志賀氏菌顯色培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)20～24 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)并記錄。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h再進(jìn)行觀察。

1.2.4 生化試驗(yàn)。選取“1.2.3”中選擇性瓊脂平板上符合志賀氏菌菌落特征的平板，從平板上挑取菌落轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)采用志賀氏菌干制生化鑒定試劑盒和全自動(dòng)微生物鑒定儀（VITEK 2 COMPACT）進(jìn)行鑒定。根據(jù)志賀氏菌生化試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，挑取新鮮培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種三塘鐵與半固體瓊脂生化管，同時(shí)用接種環(huán)挑取同一菌落至適量0.85%無(wú)菌生理鹽水中，制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木痪鷳乙?將菌懸液按每孔0.2 mL接種量加入試劑盒的圓孔中，按照說(shuō)明書(shū)相應(yīng)添加無(wú)菌液體石蠟，蓋上蓋盒，與三塘鐵和半固體瓊脂生化管一同于（36±1）℃培養(yǎng)，綿子糖試驗(yàn)若24 h仍為陰性，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48 h再觀察結(jié)果[8]。全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定方法：在麥?zhǔn)媳葷峁軆?nèi)加入3 mL 0.45%的無(wú)菌生理鹽水，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)的單菌落制成0.50～0.63個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鶆蚓鷳乙?，按儀器作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行上機(jī)鑒定。

1.2.5 血清學(xué)鑒定。將潔凈載玻片分為2個(gè)區(qū)域，標(biāo)記為血清試驗(yàn)組和對(duì)照組，挑取一環(huán)純培養(yǎng)待測(cè)單菌落，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域的上部，在血清試驗(yàn)組滴加1滴抗血清，對(duì)照組滴加1滴生理鹽水。再用無(wú)菌接種環(huán)分別將2個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研磨成乳狀液，將玻片傾斜搖動(dòng)混合1 min，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性平板分離

取增菌后志賀氏菌增菌液劃線接種選擇性平板，19-A766和19-A835在各平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)見(jiàn)表2。通過(guò)志賀氏菌顯色培養(yǎng)基可判斷，白色菌落、周圍培養(yǎng)基紫紅色為志賀氏菌，而黃色菌落可能為沙門氏菌和（或）大腸桿菌，藍(lán)綠色菌落可能為產(chǎn)氣腸桿菌和（或）其他菌。

2.2 初步生化試驗(yàn)

挑取可疑菌落進(jìn)行初步生化試驗(yàn)，典型志賀氏菌生化特征是斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫、半固體管中無(wú)動(dòng)力菌株，初步生化試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，19-A835樣品生化試驗(yàn)結(jié)果與典型志賀氏菌生化特征不符;19-A766樣品從不同選擇性平板上均有符合典型志賀氏菌生化特征的菌落。

2.3 生化試驗(yàn) 從“2.2”中挑取19-A766樣品中已培養(yǎng)的菌苔進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示（表4），19-A766-2、19-A766-3、19-A766-5、19-A766-6、19-A766-7均符合典型志賀氏菌生化特征。

2.4 全自動(dòng)微生物生化系統(tǒng)鑒定

同時(shí)，挑取19-A835和19-A766不同選擇性平板上可疑菌落的純培養(yǎng)物進(jìn)行全自動(dòng)微生物生化系統(tǒng)鑒定。其中，19-A835-1鑒定為大腸桿菌，19-A835-2和19-A835-3鑒定為弗羅因德氏枸櫞酸桿菌，因此，樣品19-A835鑒定結(jié)果為未檢出志賀氏菌，符合生化反應(yīng)鑒定結(jié)果;19-A766-1、19-A766-4、19-A766-8鑒定為肺炎克雷伯菌，19-A766-2鑒定為低反應(yīng)生物模型，19-A766-3、19-A766-5、19-A766-6和19-A766-7鑒定為宋內(nèi)氏志賀氏菌，因此樣品19-A766鑒定結(jié)果為檢出志賀氏菌，與生化鑒定結(jié)果相符。

2.5 血清學(xué)鑒定

根據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果，將樣品19-A766中生化鑒定陽(yáng)性可疑菌落（19-A766-2、19-A766-3、19-A766-5、19-A766-6、19-A766-7）進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)鑒定，抗血清中出現(xiàn)凝結(jié)成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒(méi)有發(fā)生自凝現(xiàn)象，血清學(xué)鑒定為陽(yáng)性。通過(guò)生化鑒定結(jié)果和血清學(xué)鑒定結(jié)果確定25 mL樣品中，編號(hào)19-A835樣品未檢出志賀氏菌，編號(hào)19-A766樣品檢出志賀氏菌。

3 結(jié)論與討論

志賀氏菌的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法在疾病診斷過(guò)程中不可或缺，微生物的生存性可在分離培養(yǎng)過(guò)程和生化試驗(yàn)過(guò)程中得以體現(xiàn)[4]。采用常規(guī)生化鑒定方法進(jìn)行志賀氏菌檢驗(yàn)，可直接對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀性觀察[7]，結(jié)合全自動(dòng)微生物鑒定儀可降低可疑菌落的假陽(yáng)性，提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。同時(shí)，使用志賀氏菌新生霉素增菌肉湯可排除革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，提高目標(biāo)菌的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[9]。此次測(cè)量審核樣中檢測(cè)出大腸桿菌、弗羅因德氏枸櫞酸桿菌、肺炎克雷伯菌作為干擾菌株，這3種菌株均為革蘭氏陰性桿菌。經(jīng)生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)和全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定結(jié)果顯示，樣品19A-835為志賀氏菌陰性，樣品19A-766為志賀氏菌陽(yáng)性，測(cè)量審核結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意。

使用全自動(dòng)微生物檢定儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，編號(hào)19-A766-2可疑菌落鑒定結(jié)果為低反應(yīng)生物模型，可能是菌落不單一、菌液濃度未達(dá)到所需麥?zhǔn)媳葷岫?，菌落生長(zhǎng)不在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，光學(xué)讀數(shù)頭出現(xiàn)問(wèn)題導(dǎo)致的[10]。可進(jìn)一步重新進(jìn)行試驗(yàn)，排查問(wèn)題出現(xiàn)的原因，定期對(duì)儀器進(jìn)行清潔維護(hù)，提高全自動(dòng)微生物鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

通過(guò)此次測(cè)量審核結(jié)果，檢測(cè)人員可積累判斷假陽(yáng)性菌落和生化試驗(yàn)結(jié)果的經(jīng)驗(yàn)，增加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員的檢測(cè)能力，為進(jìn)一步檢測(cè)工作打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì). 能力驗(yàn)證規(guī)則：CNAS-RL02：2018[Z].2018.

[2] 區(qū)偉珍.淺談實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的方法[J].廣東化工，2015，42（7）：116，83.

[3] 張繼瑜，劉紅，張笑兵，等.志賀氏菌福氏2a毒力大質(zhì)粒DNA全序列的測(cè)定與基因分析[J].中國(guó)科學(xué)（C輯：生命科學(xué)），2003，33（1）：40-46.

[4] 崔慶剛，楊志遠(yuǎn)，杜永新，等.志賀氏菌的生化特性及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2017（1）：23-25.

[5] 李志明.志賀氏菌傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，10（3）：571-575.

[6] 趙懷龍，付留杰，唐功臣. 我國(guó)主要的食源性致病菌[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2012，28（11）：1212-1216.

[7] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)：GB 4789.5—2012[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[8] 游元丁，趙陽(yáng)，徐孟懷，等.奶粉中沙門氏菌檢測(cè)能力驗(yàn)證分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（5）：193-195.

[9] 陳雨欣，石建良，蘇粉良，等.能力驗(yàn)證樣品中志賀氏菌的分離與鑒定[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2015（9）：62-63.

[10] 劉杰，趙滿倉(cāng)，周海峰. VITEK II 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)應(yīng)用問(wèn)題分析[J].中國(guó)醫(yī)療設(shè)備，2013，28（9）：119-121.