蘭菲菲 周偉寧 陳延冰 丁紅珂

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學遺傳中心，廣東 廣州 511442)

短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR)是由2～8個堿基組成核心序列的一類DNA遺傳標記，遵循孟德爾遺傳定律[1]。STR基因座核心序列的重復數(shù)目在不同個體中存在差異，具有高度的遺傳多態(tài)性，STR基因座的等位基因分型作為第二代法醫(yī)DNA分型技術廣泛應用于法醫(yī)遺傳學的親權鑒定和個體識別[2]。目前應用于法醫(yī)遺傳學的檢測試劑盒中等位基因分型標準物(allelic ladder)中包含了試劑盒所使用的每個STR基因座的人群中常見等位基因分型[3]。隨著STR基因座遺傳標記在法醫(yī)遺傳學應用的顯著增加及不同種族和民族等位基因分型的差異，越來越多的等位基因分型標準物之外的(off- ladder，OL)等位基因被發(fā)現(xiàn)[4]。我們應用Powerplex21體系檢測廣東地區(qū)漢族人群中Penta D基因座的OL等位基因現(xiàn)象，并計算/命名OL的等位基因分型，正確判讀鑒定結果，為廣東地區(qū)漢族人群Penta D基因座OL等位基因分型提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 親子鑒定家系來自廣東省婦幼保健院2016～2018年受理的辦理入戶鑒定案件和個人了解的案件，篩選廣東籍漢族人群列為研究對象。研究家系為生母、孩子和被檢父的三聯(lián)體親子鑒定或者父子/女、母子/女的二聯(lián)體親子鑒定，簽署知情同意書后采集血液樣本。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 血液樣本按照Chelex-100法提取DNA。在1.5ml的離心管中加入1ml純凈水，取2μl全血加入，劇烈震蕩后室溫放置30 min。12000轉/分室溫離心3 min，棄上清后收集血細胞沉淀。加200 μl 5%的Chelex-100混合液，劇烈震蕩后瞬時離心，56℃孵育30 min。100℃煮沸8min，13000 轉/分室溫離心3min，上清DNA保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 取DNA 1μl，按照Powerplex21體系(美國Promega公司)的說明書進行20個常染色體和1個性染色體STR基因座的PCR復合擴增。

1.2.3 STR基因座的等位基因分型 取PCR擴增產物1μl，每個孔加入8.5μl甲酰胺及0.5μl分子量內標，同時設置allelic ladder、陰陽性對照孔，充分混合后瞬時離心，95℃變性3 min后迅速置于冰上冷卻5 min。用3500XL基因分析儀(美國AB公司)進行毛細管電泳，使用GeneMapperID-X軟件分析，獲得DNA的STR基因座等位基因分型。

1.2.4 STR基因座OL (off-ladder)稀有等位基因的計算/命名 以ladder作為分型標準，結合OL等位基因的片段大小和漂移率進行計算命名[5]。

2 結果

2.1 Penta D基因座STR基因座OL等位基因分型結果 利用PowerPlex21體系在三聯(lián)體親子鑒定案件的父親和孩子中檢測發(fā)現(xiàn)Penta D基因座存在OL等位基因(圖1)，父親的等位基因分型為10,OL；孩子的等位基因分型為9,OL；母親的等位基因分型為9。

圖1 Powerplex21體系檢測Penta D基因座OL等位基因分型

2.2 Penta D基因座off-ladder等位基因的分型計算 根據(jù)OL等位基因的大小，結合基因分型標準物(allelic ladder)等位基因的大小，計算基因座的漂移率，進而計算OL等位基因的大小后進行分型命名。

3 討論

親權鑒定的實踐和研究中，不同STR基因座的off-ladder等位基因現(xiàn)象國內外有報道，例如D13S317、D19S433、D21S11、D16S539、D3S1358、TPOX、THO1、D7S820和FGA基因座等[5，6]。OL等位基因一般分為兩種類型：一種是超出了該基因座基因分型標準物(allelic ladder)的范圍，在范圍之外；另外一種是沒有超出基因座的allelic ladder范圍，在兩個等位基因之間[7]。Powerplex21體系是由Promega公司研發(fā)生產的遺傳學檢測系統(tǒng)，廣泛應用于人群遺傳多態(tài)性和法醫(yī)物證檢測研究，能夠同時檢測20 個常染色體和1個性染色體STR基因座，但在國內沒有應用該系統(tǒng)進行廣東地區(qū)漢族人群Penta D基因座OL稀有等位基因的研究報道。本文發(fā)現(xiàn)的OL等位基因超出了Powerplex21體系中Penta D基因座Allelic Ladder的最大范圍17，屬于第一種類型。Penta D基因座位于人類21號染色體短臂(21q22.3)，是核心序列為5堿基(AAAGA)的重復序列，Powerplex21體系中采用JOE熒光標記，基因分型標準物(Allelic Ladder)的片段長度范圍為377～450bp，Penta D基因座的等位基因分型標準物中核心序列重復次數(shù)范圍為 2.2、3.2、5-17。該基因座的遺傳多態(tài)性較高，有文獻報道在Penta D基因座發(fā)現(xiàn)OL和稀有等位基因11.2、18、19等[8]，這些OL等位基因對于提高該基因座的個體識別能力具有重要意義。

遇到STR基因座出現(xiàn)OL等位基因時，根據(jù)Allelic Ladder的分型標準和漂移率計算命名，OL等位基因計算命名一般有兩種情況：過濾漂移率之后，如果OL峰的片段長度變化是Allelic Ladder相對應峰的整數(shù)倍(X倍)，則計算為Allelic Ladder相對應峰大小±X；如果OL峰的片段長度變化不是Allelic Ladder相對應峰的整數(shù)倍，只是增加或者減少幾個堿基(bp)，著計算為Allelic Ladder相對應峰大小.X(X為相差的堿基數(shù))(例如相差1個堿基或者2個堿基分別為10.1、10.2)。本研究中，孩子Penta D基因座的OL等位基因，過濾掉漂移率(-0.09 bp)之后，OL等位基因(470.37 bp)比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17(450.27 bp)大20.19 bp，而Penta D基因座為五核苷酸的重復，即OL等位基因比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17大約4個重復序列(20.19/5=4.038≈4)，因此，OL等位基因命名為21(圖2)。

父親Penta D基因座的OL等位基因，過濾掉漂移率(0.03 bp)之后，OL等位基因(470.47 bp)比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17(450.27 bp)大20.17 bp，而Penta D基因座為五核苷酸的重復，即OL等位基因比Allelic Ladder中Penta D基因座的等位基因17大約4個重復序列(20.17/5=4.034≈4)，因此，OL等位基因命名為21(圖2)。本研究在廣東地區(qū)漢族人群中發(fā)現(xiàn)Penta D基因座存在OL等位基因21，該等位基因同時屬于稀有等位基因，而且孩子與父親同時存在OL等位基因，即孩子的OL等位基因21是來源于父親的遺傳，這種在親代和子代中遺傳的稀有等位基因發(fā)生頻率非常低，在人群中的頻率很小，因此，會對親子鑒定中父權指數(shù)(PI)值和累積父權指數(shù)(CPI)值計算有很大的影響，進而影響親子鑒定的鑒定結論。鑒于OL稀有等位基因非常小的人群頻率，在計算OL基因座的父權指數(shù)時可以考慮使用該STR基因座的最小等位基因頻率。本研究發(fā)現(xiàn)的OL稀有等位基因，可以作為Powerplex21體系中Allelic Ladder等位基因的補充，對于提高該檢測體系及Penta D基因座的檢測效能提供一定的應用價值。

圖2 Penta D基因座OL等位基因大小