玉米螟的分子連接性指數(shù)模糊聚類分析

趙昕 陳小穎 陳日曌

摘要：玉米螟危害多種作物，對(duì)我國(guó)玉米產(chǎn)量與質(zhì)量的影響尤為明顯，我國(guó)作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，防治玉米螟至關(guān)重要。為進(jìn)一步研究不同種類玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育歷程及習(xí)性，以達(dá)到更好地防治效果，利用遺傳多樣性分析和分子連接性指數(shù)模糊聚類方法對(duì)不同地理位置和不同寄主的玉米螟進(jìn)行生物進(jìn)化研究，分析玉米螟基于不同地理位置和不同寄主2種情況是否各自存在生物型分類。結(jié)果表明，在不同地理位置上玉米螟存在生物型分類，而在不同寄主上玉米螟不存在生物型分類。這一研究成果為玉米螟的分類研究和玉米螟防治提供了一種有效的方法。

關(guān)鍵詞：玉米螟;DNA序列;分子連接性指數(shù);模糊聚類分析;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S435.132?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）06-0029-07

收稿日期：2019-03-08

玉米螟，別稱玉米鉆心蟲，屬鱗翅目螟蛾科，是一種世界性害蟲，在我國(guó)主要有亞洲玉米螟[Ostrinia furnacalis（Guenée）]和歐洲玉米螟[Ostrinia nubilalis （Hübner）]，其中亞洲玉米螟在我國(guó)是優(yōu)勢(shì)種[1]。

玉米螟的分布非常廣泛，在我國(guó)除了西藏和青海等省份未見報(bào)道外，其他省份均有發(fā)生，其中黃淮平原和北方地區(qū)發(fā)生最為嚴(yán)重。玉米螟除了分布廣泛外，寄主植物的種類也很多，包括玉米、大豆、蔬菜等。相關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示，每年我國(guó)有10多個(gè)省份的農(nóng)作物都受到玉米螟的危害，減產(chǎn)幅度達(dá)到17.5%～51.0%。因此，玉米螟蟲的防治對(duì)于我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)乃至世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都至關(guān)重要[1]。我國(guó)目前防治玉米螟的手段主要有化學(xué)防治、生物防治、農(nóng)業(yè)防治等方法[2]。這些措施的綜合使用對(duì)玉米螟的防治雖然具有一定的效果，但還是沒有從根本上解決玉米螟的危害問題，大部分玉米螟依然繼續(xù)危害農(nóng)作物。為更好地解決這一問題，國(guó)內(nèi)外諸多研究人員把目光放在了對(duì)玉米螟的分類研究上，若玉米螟能夠得到有效的種內(nèi)分類，即可更好地研究各個(gè)類別玉米螟生長(zhǎng)發(fā)育習(xí)性，從而能夠?qū)τ衩酌M(jìn)行針對(duì)性的防治，優(yōu)化防治效果。

由于目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)玉米螟的種內(nèi)分類尚無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)，因此本研究試圖利用模糊聚類方法對(duì)玉米螟的CO Ⅰ基因序列進(jìn)行基于不同地理位置種群和不同寄主種群的遺傳多樣性和分子連接性指數(shù)聚類分析，探究玉米螟在不同地理位置和不同寄主上有無(wú)生物型分類。

1 材料與方法

1.1 樣本獲取

本研究所用樣本是通過玉米螟性誘捕器捕獲的61個(gè)稈野螟屬玉米螟昆蟲（誘捕器主要為水盆式誘捕器和黏板式誘捕器），其中包括捕自不同寄主和不同地區(qū)的57個(gè)亞洲稈野螟屬玉米螟昆蟲和4個(gè)歐洲稈野螟屬玉米螟昆蟲（表1）。圖1為玉米螟樣本圖。

1.2 數(shù)據(jù)獲取

1.2.1 試驗(yàn)器材與試劑 （1）器材主要有研磨機(jī)、離心機(jī)、DC-800渦旋混合器、水浴鍋、PCR儀、DYY-12C型電泳儀，滅菌的1.5 mL離心管和 2 mL 收集、移液器、紫外分光光度儀等。（2）試劑主要有Insect DNA Kit（50） D0926-01 DNA提取試劑盒、PCR引物、Mixture試劑，均購(gòu)于吉林省庫(kù)美生物科技有限公司。

本試驗(yàn)操作室為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院分子實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 基因提取 本研究所用數(shù)據(jù)為玉米螟的DNA序列，因此采用Insect DNA Kit（50） D0926-01 DNA提取試劑盒對(duì)玉米螟進(jìn)行DNA提取。稱取單只玉米螟標(biāo)本裝入1.5 mL離心管中，并裝入2顆小鋼珠，放入液氮中，5 min后取出，將離心管置于研磨機(jī)上研磨至標(biāo)本粉碎，然后在12 000 r/min的離心機(jī)中離心 1 min;加入350 μL Buffer CTL和 25 μL OB蛋白酶，渦旋均勻，于60 ℃水浴箱中振蕩孵育30 min后，加入5 μL RNaseA混勻，于室溫下放置10～15 min，其他步驟參照Insect DNA Kit（50）D0926-01試劑盒說明。

完成操作步驟獲取DNA溶液，對(duì)溶液進(jìn)行濃度測(cè)定后，進(jìn)行基因擴(kuò)增等后續(xù)步驟，以獲得CO Ⅰ基因序列。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 根據(jù)所要提取的COI基因片段進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，上下游引物分別設(shè)計(jì)為YRS-1：5′-TTATCGCTTAAATCTCAGC-3′，YRS-2：5′-GACCTTCAAGTAGAAATCG-3′[3]。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序分別見表2和表3。

最后在4 ℃下保存PCR產(chǎn)物。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析并在紫外分光光度儀下檢測(cè)其濃度。圖2為部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。

1.3 玉米螟遺傳研究

玉米螟的取食選擇具有多樣性，目前針對(duì)玉米螟寄主植物種類的研究較多，但對(duì)于玉米螟是否存在寄主分類的研究少之又少，本研究利用玉米螟COI基因探討玉米螟基于不同寄主和不同地理位置的分類。

1.3.1 采自不同地理位置的玉米螟種群遺傳研究 將玉米螟依據(jù)采集的地理位置不同劃分為美國(guó)、吉林長(zhǎng)春、河南商丘、廣西南寧、湖北武漢、安徽合肥6個(gè)種群，討論玉米螟是否存在基于不同地理位置的遺傳分化。

由表4可知，除河南商丘種群外，其他5個(gè)種群內(nèi)部無(wú)顯著遺傳差異（P>0.1），而河南商丘種群內(nèi)部存在顯著的遺傳差異（P<0.01）。然后進(jìn)一步分析固定指數(shù)（Fst）。

由表5可知，各地理位置種群間的Fst均大于025，表明不同地理位置的種群之間存在遺傳分化，之后利用聚類分析進(jìn)一步驗(yàn)證。

因此，以橫軸為樣本間遺傳距離（P），縱軸為堿基轉(zhuǎn)換距離（Ts）和顛換距離（Tv），構(gòu)造散點(diǎn)圖，當(dāng)序列間分歧逐漸變大，坐標(biāo)點(diǎn)呈線性分布時(shí)，表示序列間替換尚未達(dá)到飽和，序列能夠進(jìn)行后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析[3]。

本研究采用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的回歸分析檢驗(yàn)遺傳距離與顛換距離、轉(zhuǎn)換距離是否符合線性關(guān)系，使用MATLAB軟件編程計(jì)算所得CO Ⅰ基因堿基替換擬合結(jié)果見圖3。

1.4 堿基飽和度檢驗(yàn)

利用分子生物學(xué)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹需要首先對(duì)堿基的飽和度進(jìn)行檢驗(yàn)，作為能否進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的判斷依據(jù)。若分子生物學(xué)分析顯示，分子數(shù)據(jù)不能構(gòu)造系統(tǒng)發(fā)育樹，那么，統(tǒng)計(jì)學(xué)中的聚類分析缺乏前提保障，得到的聚類結(jié)果在生物學(xué)領(lǐng)域沒有意義，缺乏說服力。

生物學(xué)中的堿基飽和度分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)中的回

歸分析一致，即分析堿基間的遺傳距離與堿基轉(zhuǎn)換（transition）和顛換（transversion）距離是否構(gòu)成線性相關(guān)關(guān)系。其中，遺傳距離為多個(gè)性狀基因型值構(gòu)成的多維空間的幾何距離，是評(píng)定物種間遺傳差異程度的指標(biāo);顛換為異型堿基的置換，顛換距離為序列對(duì)之間發(fā)生的顛換位點(diǎn)數(shù)與序列長(zhǎng)度的比值;而轉(zhuǎn)換是同型堿基的置換，轉(zhuǎn)換距離為序列對(duì)之間發(fā)生的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)數(shù)與序列長(zhǎng)度的比值。其中堿基的類型分為2種，即嘌呤和嘧啶。

由圖3、表8可知，遺傳距離與堿基轉(zhuǎn)換距離之間呈線性關(guān)系（P=0.037 309 063），且擬合程度良好（r2=0.999 450 238），精確度高（標(biāo)準(zhǔn)誤差?。?。

由上式可以得到61個(gè)樣本間的相似關(guān)系，從而得到模糊相似矩陣。

1.5.4 模糊等價(jià)矩陣的構(gòu)建 由于“1.5.3”節(jié)中所求得的矩陣（R）是否具有傳遞性尚不明確，因此為了分類，需根據(jù)（R）構(gòu)造模糊等價(jià)矩陣（R*）。本研究采用平方法構(gòu)建（R）*。

當(dāng)k使（R）2k=（R）2k+1時(shí)，此時(shí)的（R）2k即為所求的模糊等價(jià)矩陣R*，即（R）*=（R）2k。

根據(jù)求得（R）*后可知，在不同的分類水平（λ）上，所得到的截距陣不同，從而獲取的分類情況也不同。圖4為模糊聚類分析動(dòng)態(tài)聚類譜系圖。

由圖4可知，不同的分類水平，有不同的分類數(shù)與之對(duì)應(yīng)。當(dāng)λ=0.998 2時(shí)，美國(guó)、吉林長(zhǎng)春、河南商丘、廣西南寧、湖北武漢、安徽合肥6個(gè)種群都單獨(dú)聚在一起，即河南商丘種群包括8、11、24、61、23、30、35、52、27、28、39、49、53、56、60、57、12、44、22、37、46、42、47，美國(guó)種群包括1、2、3、4，吉林長(zhǎng)春種群包括5、 33、18、32、59、51、17、31、20、29、41、9、58、10、13、21、45、34、7，廣西南寧包括19、36、38、54，湖北武漢包括6、48，安徽合肥包括14、40，當(dāng)λ=0966 6時(shí)，樣本得到不同的國(guó)家分類，分為歐洲和亞洲2個(gè)類別，也屬于依據(jù)不同的地理位置范疇，說明各個(gè)不同地理位置種群之間具有種類區(qū)別。

2 結(jié)論與討論

對(duì)6個(gè)不同地理位置種群和4個(gè)不同寄主種群進(jìn)行生物型分類研究，針對(duì)不同地理位置種群，遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，除河南商丘種群外，其他5個(gè)種群內(nèi)部無(wú)顯著遺傳差異現(xiàn)象，河南商丘種群種內(nèi)存在顯著的遺傳差異，并且各個(gè)種群間的遺傳分化水平很大，聚類結(jié)果存在同一地理位置的種群均聚在同一分支的分類情況，表明不同地理位置種群存在生物型分類，形成這種現(xiàn)象的原因是不同地理位置的種群由于地理隔離需要適應(yīng)各自的地理環(huán)境和生存環(huán)境，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的物種進(jìn)化形成基于地理位置的種群差異。針對(duì)不同寄主植物種群，遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，4個(gè)不同寄主種群內(nèi)部也不存在遺傳差異現(xiàn)象且種群間遺傳分化水平低，說明種群內(nèi)部基因交流現(xiàn)象頻繁，聚類結(jié)果中不同寄主的標(biāo)本交叉存在，沒有將相同寄主種群聚為獨(dú)立分支，表明基于不同寄主的種群不存生物型分類。

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