枯草芽孢桿菌的篩選及其與光合細(xì)菌復(fù)配對(duì)養(yǎng)殖水體的凈化

劉珍珠 樊振 劉歡歡

摘要：以光合細(xì)菌和枯草芽孢桿菌為試驗(yàn)菌種，研究二者最優(yōu)濃度配比，應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)中提高降解水體氨氮、NO-2和化學(xué)需氧量（COD）濃度的能力。測(cè)定7種枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線，選取生長(zhǎng)性能較好的菌株K1、K2、K3進(jìn)行產(chǎn)酶活性檢測(cè)，篩選出菌株K3進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組（CK）和7個(gè)復(fù)合菌組（P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7），7個(gè)復(fù)合菌組（光合細(xì)菌 ∶ 枯草芽孢桿菌）的濃度配比分別為P1（1 ∶ 0）、P2（0 ∶ 1）、P3（1 ∶ 1）、P4（2 ∶ 1）、P5（3 ∶ 1）、P6（1 ∶ 2）、P7（1 ∶ 3），分析各試驗(yàn)組的氨氮、NO-2和化學(xué)需氧量等水質(zhì)指標(biāo)，選取處理結(jié)果最優(yōu)的復(fù)合菌組。結(jié)果表明，復(fù)合菌能夠明顯降低水體氨氮，其中P6降解能力最強(qiáng)，降解效果高于對(duì)照組4.9倍;能去除亞硝酸根濃度和水體中的化學(xué)需氧量。復(fù)合菌組的最佳濃度配比為1 ∶ 2，該濃度配比組較對(duì)照組和其他試驗(yàn)組能夠明顯凈化養(yǎng)殖水質(zhì)，有效提高凈化水質(zhì)能力。

關(guān)鍵詞：光合細(xì)菌（Photosynthetic bacteria）;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;復(fù)合菌;養(yǎng)殖水體;凈化水質(zhì)

中圖分類號(hào)： S182;X52? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）06-0164-04

近年來隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，工業(yè)化的高密度養(yǎng)殖不斷擴(kuò)大，與此同時(shí)，未處理養(yǎng)殖廢水和工業(yè)、生活污水的排放不僅使環(huán)境受到嚴(yán)重的污染，還影響人們的生活用水衛(wèi)生問題。養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到破壞，致使養(yǎng)殖業(yè)病害頻繁發(fā)生[1]。池塘自凈與調(diào)節(jié)能力并不能滿足清除殘餌、魚蝦排泄物等富營(yíng)養(yǎng)因子的需要，養(yǎng)殖水體中氨氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硫化物等嚴(yán)重超標(biāo)，池塘水質(zhì)惡化，魚蝦病害頻頻發(fā)生[2]。為了解決上述問題，抗生素和各類化學(xué)藥劑在養(yǎng)殖池塘中大量而頻繁的施用，嚴(yán)重破壞了養(yǎng)殖環(huán)境的生物體系，不僅使養(yǎng)殖池塘的微生態(tài)失調(diào)，而且使農(nóng)藥殘留超標(biāo)，污染養(yǎng)殖水環(huán)境[3]。微生態(tài)制劑凈水以其高效率、低成本、見效快成為最有前景的凈水方法。目前應(yīng)用的凈水微生態(tài)制劑主要種類有光合細(xì)菌、芽孢桿菌、硝化細(xì)菌和酵母菌等。光合細(xì)菌能夠改善水質(zhì)，增加溶氧，降低氨氮，增加生產(chǎn)力[4]?？莶菅挎邨U菌可以減少病害，降低氮磷，增加溶氧，增產(chǎn)增效[5-6]。兩者結(jié)合起來使用會(huì)產(chǎn)生不一樣的效果。有關(guān)光合細(xì)菌和芽孢桿菌協(xié)同凈化水質(zhì)的研究已有報(bào)道，羅勇勝等研究認(rèn)為，光合細(xì)菌與枯草芽孢桿菌二者協(xié)同凈化作用效果較好[7];李君華等研究認(rèn)為，二者協(xié)同作用能凈化水質(zhì)，提高刺參免疫能力[8];姜海明等研究發(fā)現(xiàn)，光合細(xì)菌和芽孢桿菌使用濃度比例為3 ∶ 1時(shí)，對(duì)烏鱧養(yǎng)殖水的氨氮和化學(xué)需氧量（COD）去除率最高[9]。因此，本研究擬通過對(duì)光合細(xì)菌和枯草芽孢桿菌2種菌設(shè)置不同濃度配比進(jìn)行水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)，來確定養(yǎng)殖水質(zhì)凈化作用的最優(yōu)配比，以期得到養(yǎng)殖生產(chǎn)中復(fù)合菌的最佳濃度配比。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與水體來源 試驗(yàn)所用光合細(xì)菌為新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所生態(tài)實(shí)驗(yàn)室保藏，枯草芽孢桿菌菌粉、養(yǎng)殖廢水由新疆昌吉天康畜牧科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 本試驗(yàn)所使用的光合細(xì)菌培養(yǎng)基為RCVBN培養(yǎng)基。RCVBN培養(yǎng)基配方：乙酸鈉 3.00 g，丙酸鈉1.00 g，硫酸銨1.00 g，硫酸鎂 0.20 g，氯化鈉1.00 g，磷酸二氫鉀0.30 g，磷酸氫二鉀0.50 g，氯化鈣0.05 g，酵母膏0.10 g，微量元素1.00 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.0。

枯草芽孢桿菌活化、生長(zhǎng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL。

枯草芽孢桿菌活性檢測(cè)培養(yǎng)基。淀粉酶培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉 2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.0～7.2，瓊脂粉20 g。蛋白酶培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母膏1 g，酪素 5 g，磷酸氫二鉀1 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.0～7.2，瓊脂粉20 g。纖維素酶培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉2 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至 7.2～7.4，瓊脂粉20 g。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 單人雙面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-1F），購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-2102C），購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱（SPX-250BF2），購(gòu)自上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070），購(gòu)自上海鴻都電子科技有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-75 SII），購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;電子天平（JW-B5003，0.001 g），購(gòu)自諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司;調(diào)速型迷你離心機(jī)（Super Mini Dancer），購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;pH計(jì)（MT-5000），購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司;紫外分光光度計(jì)（UV-2550），購(gòu)自日本島津自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)性能良好的枯草芽孢桿菌篩選

1.2.1.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將筆者所在實(shí)驗(yàn)室選購(gòu)的7種菌粉標(biāo)記為K1、K2、K3、K4、K5、K6、K8，稱取0.1 g用無菌梯度稀釋法，稀釋涂布于LB培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出明顯的單菌落，挑取單菌落于LB培養(yǎng)液中分別在20、25 ℃ 2種溫度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，每2 h取樣測(cè)量1次菌液濃度，并觀察這7種枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況。

1.2.1.2 產(chǎn)酶活性的檢測(cè) 選取其中生長(zhǎng)活性最好的枯草芽孢桿菌，用打孔法檢測(cè)其產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等3種酶的活性，分別在淀粉酶培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基和纖維素酶培養(yǎng)基上用打孔法將培養(yǎng)24 h后的枯草芽孢桿菌菌液用移液槍吸入孔中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察產(chǎn)酶圈。

1.2.2 枯草芽孢桿菌和光合細(xì)菌的復(fù)配試驗(yàn)

1.2.2.1 復(fù)配菌的制備 將純化培養(yǎng)的2種菌按照比例配制，試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組（不添加菌）和7個(gè)復(fù)配菌組，7個(gè)復(fù)配菌組（光合細(xì)菌 ∶ 枯草芽孢桿菌）濃度配比分別為P1（1 ∶ 0）、P2（0 ∶ 1）、P3（1 ∶ 1）、P4（2 ∶ 1）、P5（3 ∶ 1）、P6（1 ∶ 2）、P7（1 ∶ 3）。光合細(xì)菌活菌數(shù)為1.3×109 CFU/mL，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為5.17×1011 CFU/g?？莶菅挎邨U菌每份加菌量為0.002 5 g，光合細(xì)菌添加量每份為13 mL。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)室模擬生物降解試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取塑料箱（0.5 m×0.4 m×0.5 m），每個(gè)加入養(yǎng)殖池塘水（稀釋豬糞水）13 L，復(fù)合菌劑投放量為50 mL（濃度3.85 mL/L），試驗(yàn)組除對(duì)照外共有7組，每組2個(gè)平行。在室內(nèi)光照，溫度控制在30 ℃條件下培養(yǎng)并觀察。分析各試驗(yàn)組的化學(xué)需氧量濃度（高錳酸鉀法）、氨氮含量（納氏試劑）、亞硝酸根含量等水質(zhì)指標(biāo)。每隔1 d測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定8 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的篩選

如圖1所示，在培養(yǎng)時(shí)間為26 h內(nèi)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為20 ℃時(shí)，菌種K1的生長(zhǎng)速率最快，在培養(yǎng)26 h時(shí)，菌液濃度最高;菌種K2的生長(zhǎng)速率次之，其次是菌種K3。當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，菌種K1、K2和K3的生長(zhǎng)速率較快，菌液濃度較高。因此，選擇K1、K2和K3這3株菌進(jìn)行產(chǎn)酶活性檢測(cè)。

2.2 產(chǎn)酶活性能力檢測(cè)結(jié)果

對(duì)K1、K2和K3這3株枯草芽孢桿菌進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性能力檢測(cè)，結(jié)果如表1所示，菌種K1產(chǎn)蛋白酶圈直徑為1.680 cm，產(chǎn)淀粉酶圈直徑為0.832 cm，產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm;菌種K2產(chǎn)蛋白酶圈直徑為1.836 cm，產(chǎn)淀粉酶圈直徑為0.828 cm，產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm;菌種K3產(chǎn)蛋白酶圈直徑為2.160 cm，產(chǎn)淀粉酶圈直徑為 1.236 cm，產(chǎn)纖維素酶圈直徑為 0.000 cm。菌株K3的產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶活性能力比菌種K1和K2強(qiáng)， 菌種K1和K2產(chǎn)蛋白酶與產(chǎn)淀粉酶的活性能力相當(dāng)，3株菌的產(chǎn)纖維素酶活性能力都很弱，產(chǎn)纖維素酶圈直徑都為0.000 cm。因此選擇K3菌株與光合細(xì)菌進(jìn)行復(fù)配。

2.3 不同處理對(duì)NH+4降解效果的影響

如圖2所示，CK（對(duì)照組）對(duì)NH+4濃度的降解趨勢(shì)最緩，最終結(jié)果與原始相差不大。而其他復(fù)合菌組對(duì)NH+4濃度的降解速率在前8 d均快于CK，其中P6組的降解速率比其他組快，P3和P7組降解速率為7組復(fù)合菌組中最慢。

2.4 不同處理對(duì)NO-2降解效果的影響

如圖3所示，CK的降解速率比復(fù)合菌組的慢，但是總體差異不明顯，各組對(duì)NO-2的降解速率差異不明顯。

2.5 不同處理對(duì)COD降解效果的影響

如圖4所示，CK的COD隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，與復(fù)合菌組呈現(xiàn)差異明顯，P1與P7組對(duì)COD的降解能力較強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，光合細(xì)菌、枯草芽孢桿菌以及

復(fù)合菌都能有效降低水體氨氮、化學(xué)需氧量和NO-2濃度的能力。光合細(xì) 菌 ∶ 芽 孢桿菌=1 ∶ 2（P6）時(shí)，對(duì)水中氨氮的降解效果最好，比對(duì)照組高出4.9倍，比單一光合細(xì)菌（P1）與單一枯草芽孢桿菌（P2）分別高出1.9、1.5倍，復(fù)合菌效果明顯優(yōu)于單一菌。因?yàn)轲B(yǎng)殖池塘水體中飼養(yǎng)魚類喂食的餌料較多，所以水體中的氨氮含量增加，氨氮容易引起水中藻類及其他微生物大量繁殖，形成富營(yíng)養(yǎng)化污染，使水中溶解氧含量下降，魚類大量死亡，甚至?xí)?dǎo)致湖泊干涸。由于氨氮對(duì)養(yǎng)殖水體的危害較大，就不得不尋找其他方法來解決現(xiàn)存的高密度養(yǎng)殖后果。

光合細(xì)菌 ∶ 芽孢桿菌=1 ∶ 2（P6）時(shí)，對(duì)水體中亞硝酸鹽降解效果最好，其降解率是CK組的1倍，但與其他復(fù)合菌組處理效果差異不明顯。養(yǎng)殖池塘由于大規(guī)模高密度的養(yǎng)殖，很容易造成水體缺氧，在厭氧狀態(tài)下，水體中的硝酸根離子還原成亞硝酸根離子，亞硝酸根離子大量積累，對(duì)養(yǎng)殖水體的環(huán)境與養(yǎng)殖動(dòng)物造成嚴(yán)重危害。而光合細(xì)菌與芽孢桿菌對(duì)于水體中氨氮的去除能力較強(qiáng)，因此，在養(yǎng)殖池塘中添加微生態(tài)制劑是一種較好的解決方案。

光合細(xì)菌 ∶ 芽孢桿菌=1 ∶ 3（P7）時(shí)，對(duì)水體中化學(xué)需氧量降解效果最好，在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，對(duì)照組的COD呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，P7組對(duì)COD的降解明顯，降解效率高于單一組1.9倍。COD是評(píng)價(jià)水體質(zhì)量的重要指標(biāo)，COD的高低在很大程度上反映水環(huán)境的有機(jī)污染或水體的清潔度[10]。光合細(xì)菌在厭氧條件下可以固定CO2，也可以利用低級(jí)脂肪酸、氨基酸等作為碳源進(jìn)而降低COD[10]。芽孢桿菌是具有高活性消化酶系的異養(yǎng)菌，能迅速將養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物分解為小分子有機(jī)酸、氨基酸及氨，從而降低COD。2種細(xì)菌都具有降解有機(jī)物的能力，二者存在共生關(guān)系[11-12]。P7組中復(fù)合菌濃度比例取得最好的COD降解效果，說明兩者共生達(dá)到平衡，都能夠發(fā)揮各自的有機(jī)物降解能力，達(dá)到最佳降低COD的效果。

微生態(tài)制劑的使用不但提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中降解有機(jī)污染的能力，還大大節(jié)省了養(yǎng)殖成本，其中光合細(xì)菌既能發(fā)揮高效的降解作用，利用水體中有毒的胺、H2S等，還能分泌一些對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物有益的活性物質(zhì)[13]。枯草芽孢桿菌除了可以限制養(yǎng)殖水體中有害菌的生存和繁殖，養(yǎng)殖動(dòng)物食用后可改善體內(nèi)生態(tài)環(huán)境，并對(duì)動(dòng)物某些疾病有防治作用。復(fù)合菌的使用既可以使各類微生物都各自發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，又能相互利用、取長(zhǎng)補(bǔ)短，使利益最大化。

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