李堂昊，布冠好，趙益菲，陳復(fù)生

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

大豆富含優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)與油脂[1]，但大豆也是公認(rèn)的八大食物過敏原之一。有研究表明，對大豆過敏的兒童比例高達(dá)13%[2]。β-伴大豆球蛋白被認(rèn)為是引發(fā)機(jī)體食物過敏的主要成分[3]，其3個亞基均具有致敏性，其中α亞基的致敏性最強(qiáng)，25%的大豆敏感病人的血清能夠識別它，是最早被公認(rèn)的主要過敏原蛋白[4-5]。國內(nèi)外對于大豆過敏尚無根本解決辦法，只能依靠避免攝入來防止食物過敏反應(yīng)的發(fā)生。大豆提供氨基酸平衡的高品質(zhì)蛋白質(zhì)，常作為原輔料出現(xiàn)在許多食品中，這無疑給大豆過敏人群帶來了潛在威脅[6]。

對于食物過敏，尋找一種有效的加工技術(shù)來控制過敏原顯得尤為重要[7]。熱加工可以一定程度地減少過敏原的抗原性，但不能完全清除[8]。近年來，非熱加工技術(shù)，特別是超高壓(HHP)技術(shù)在食品加工領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。超高壓處理能夠有效延長食品貨架期，且對食品風(fēng)味與營養(yǎng)價值幾乎沒有影響[9]。目前，國內(nèi)外學(xué)者已將超高壓作為一種有效的非熱加工技術(shù)應(yīng)用于食品中過敏原的消減[10-11]。Li等[12]比較了4種物理方法(微波、高強(qiáng)度超聲、高壓均質(zhì)化和超高壓)對嬰兒配方奶粉中大豆分離蛋白致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)4種方式均能在一定程度上消減大豆分離蛋白與過敏患者血清的結(jié)合能力，超高壓的消減效果最佳，達(dá)到46.6%。Meinlschmidt等[9]提出在風(fēng)味蛋白酶水解前施加500 MPa的超高壓處理，使大分子的蛋白質(zhì)水解成小分子的肽，破壞了原有的抗原表位，使處理后的樣品幾乎檢測不出β-伴大豆球蛋白的免疫反應(yīng)性。Xi等[13]研究表明，經(jīng)過400 MPa超高壓處理15 min，β-伴大豆球蛋白的抗原性降低了40%。因此，超高壓處理可能是降低大豆蛋白免疫特性的一種有效方法。

不同超高壓處理?xiàng)l件對β-伴大豆球蛋白的抗原性與結(jié)構(gòu)的影響研究較少，且兩者間的構(gòu)效關(guān)系尚不明確。作者通過等電點(diǎn)冷沉法提取β-伴大豆球蛋白，設(shè)置不同的超高壓條件對其進(jìn)行處理，利用Western-Blot與ELISA法定性和定量分析β-伴大豆球蛋白的免疫活性，通過SDS-PAGE、紅外光譜與熒光光譜表征處理前后β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)的變化，探究超高壓處理前后β-伴大豆球蛋白免疫活性與結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，為超高壓進(jìn)一步應(yīng)用于消除食源性過敏原提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

脫脂大豆粉：河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；β-伴大豆球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(C5868)、HRP-羊抗兔IgG(A6154)：Sigma公司；兔抗β-伴大豆球蛋白血清：實(shí)驗(yàn)室自制；牛血清蛋白(BSA)：北京索萊寶科技有限公司；凝膠電泳試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

熒光分光光度計(jì)：美國Varian公司；恒溫生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；超高靜壓裝置：包頭科發(fā)有限公司；傅里葉紅外光譜儀、酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾儀器有限公司；電泳裝置：北京市六一儀器廠；高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白的制備

β-伴大豆球蛋白的提取采用一種優(yōu)化過的方法[14-16]。料液比(g/mL)為1∶15，脫脂大豆粉與0.03 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)在45 ℃下浸提1 h，離心(4 ℃，10 000 r/min，20 min)取上清液。加入0.01 mol/L NaHSO3和5 mmol/L CaCl2，調(diào)節(jié)pH值至6.4，4 ℃過夜，離心后取上清液。調(diào)節(jié)pH值至5.5，攪拌1 h，離心取上清液。加入等體積冰水，調(diào)節(jié)pH至4.8，離心后的沉淀為β-伴大豆球蛋白。0.03 mol/L的Tris-HCl復(fù)溶，4 ℃透析2 d，凍干后備用。

1.3.2 超高壓處理

用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)溶解β-伴大豆球蛋白，真空密封后進(jìn)行超高壓處理。試驗(yàn)因素設(shè)置為超高壓壓強(qiáng)、加壓時間以及蛋白質(zhì)量濃度。超高壓處理?xiàng)l件：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度與加壓時間分別為5 mg/mL和20 min時，壓強(qiáng)范圍為100～600 MPa；蛋白質(zhì)量濃度與壓強(qiáng)分別為5 mg/mL和500 MPa，時間范圍為5～30 min；壓強(qiáng)與加壓時間分別為500 MPa和20 min，蛋白質(zhì)量濃度范圍為5～30 mg/mL。

1.3.3 SDS-PAGE分析

參照趙益菲等[8]的方法對樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.4 ELISA法

采用間接競爭ELISA法測定超高壓處理后抗原性的變化[17-18]。標(biāo)準(zhǔn)抗原用50 mmol/L的碳酸鹽緩沖溶液(pH 9.6)稀釋至0.4 μg/mL(由前期試驗(yàn)確定)，100 μL/孔包被于96孔酶標(biāo)板中，樣品與兔抗血清(1∶6 400稀釋)混合，4 ℃過夜。接下來的試驗(yàn)流程與趙益菲等[8]的一致。吸光度(OD)用酶標(biāo)儀測定，OD=OD450-OD620，其中OD450和OD620表示在450 nm和620 nm波長下測得的吸光度。樣品抗原性的大小用抗原抑制率表示，抗原抑制率越大表示樣品具有的抗原性越高。

抗原抑制率/%=(1-OD/OD0)×100,

式中：OD為樣品吸光度;OD0為無競爭體系的吸光度。

1.3.5 Western-Blot法

通過Western-Blot法分析β-伴大豆球蛋白的免疫原性[19]。

1.3.6 FTIR分析

試驗(yàn)參考趙益菲等[8]的方法。樣品紅外光譜用Peak fit 4.12軟件分析，得到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量[20]。

1.3.7 熒光光譜分析

β-伴大豆球蛋白表面疏水性指數(shù)用8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽(ANS)探針測定[21]。樣品蛋白用10 mmol/L PBS(pH 7.0)稀釋至5 mg/mL，不同處理?xiàng)l件下的樣品用同一PBS緩沖液梯度稀釋成6種稀釋度。4 mL樣品溶液中加入20 μL的ANS溶液(80 mmol/L)，搖勻后測定樣品在390 nm激發(fā)波長與470 nm發(fā)射波長下的熒光強(qiáng)度。用測得的熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)量濃度擬合所作曲線的初始斜率表示表面疏水性指數(shù)。

超高壓處理后對β-伴大豆球蛋白進(jìn)行熒光光譜分析，掃描參數(shù)：激發(fā)波長設(shè)置為390 nm，波長范圍400～600 nm。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測定3次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 16.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，并用OriginPro 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-伴大豆球蛋白的提取

通過凱氏定氮測得提取的β-伴大豆球蛋白的蛋白含量為92.70%，圖1是提取樣品的SDS-PAGE圖譜。提取出的β-伴大豆球蛋白α′、α、β3個亞基條帶清晰，且與SPI中β-伴大豆球蛋的3個亞基位置相符，經(jīng)Gel-pro analyzer軟件分析，其蛋白純度達(dá)到72.68%，提取純度較高，可用于下一步試驗(yàn)。

M：Marker；SPI：大豆分離蛋白；β-conglycinin：制備的蛋白

2.2 超高壓處理對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

圖2—圖4表示不同超高壓處理?xiàng)l件對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響。由圖2可知，隨著處理壓強(qiáng)的增加，β-伴大豆球蛋白在壓強(qiáng)為400 MPa時顯示出最低的抗原性，與未超高壓處理相比，降低了45.30%。圖3表明，β-伴大豆球蛋白的抗原性隨加壓時間的延長呈先降低后升高趨勢。這與Xi等[13]的研究結(jié)果相似?？乖越档偷脑蚩赡苁浅邏禾幚硎沟鞍鬃冃?，導(dǎo)致IgG無法識別蛋白質(zhì)表面的抗原表位，無法誘發(fā)超敏反應(yīng)[22-23]。繼續(xù)加大壓強(qiáng)與延長加壓時間反而會增加β-伴大豆球蛋白抗原性，這可能是壓強(qiáng)的增大與加壓時間的延長使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，原本被掩蓋的抗原表位暴露，抗原性上升[24]。圖4表明，隨著蛋白質(zhì)量濃度提高，β-伴大豆球蛋白的抗原性持續(xù)上升，這可能是由于蛋白質(zhì)量濃度提升，使作用在蛋白上的壓強(qiáng)減小。由以上結(jié)果可知，不同條件的超高壓處理能夠顯著影響β-伴大豆球蛋白的抗原性。

注：圖中不同字母代表的數(shù)值之間具有顯著性差異(P<0.05)，圖3、圖4同。

圖3 不同加壓時間對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

2.3 超高壓處理對β-伴大豆球蛋白亞基及免疫原性的影響

采用SDS-PAGE與免疫印跡法對超高壓處理后的β-伴大豆球蛋白的亞基組成和免疫原性進(jìn)行分析。圖5為不同超高壓處理后蛋白的SDS-PAGE圖譜，從圖5可以看出，隨著壓強(qiáng)的增加，β-伴大豆球蛋白的各亞基條帶沒有顯著變化，表明β-伴大豆球蛋白經(jīng)超高壓處理后亞基的組成并未發(fā)生改變。圖6為免疫印跡結(jié)果，超高壓處理的β-伴大豆球蛋白(條帶2—7)均出現(xiàn)免疫反應(yīng)條帶。隨著壓強(qiáng)的增加，出現(xiàn)明顯的顏色變淺現(xiàn)象，但條帶并未完全消失，這說明超高壓處理可以降低β-伴大豆球蛋白的免疫原性。結(jié)合前面ELISA的結(jié)果可知，隨著壓強(qiáng)的提高，β-伴大豆球蛋白的抗原性和免疫原性會出現(xiàn)一定程度的降低，這可能是由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化使其與抗體結(jié)合的能力下降。

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；SPI：大豆分離蛋白；1：未超高壓的β-伴大豆球蛋白；2：100 MPa; 3：200 MPa; 4：300 MPa;5：400 MPa; 6：500 MPa; 7：600 MPa

1：0 MPa；2：100 MPa；3：200 MPa；4：300 MPa；5：400 MPa；6：500 MPa；7：600 MPa

2.4 β-伴大豆球蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化

圖7為β-伴大豆球蛋白在不同超高壓處理?xiàng)l件下的紅外光譜圖。紅外光譜的酰胺Ⅰ(1 600～1 700 cm-1)、酰胺Ⅱ(1 530～1 550 cm-1)和酰胺Ⅲ(1 260～1 330 cm-1)是蛋白質(zhì)的特征吸收區(qū)域[25]。由圖7可知，與未處理的β-伴大豆球蛋白相比，超高壓處理后，3條蛋白質(zhì)特征吸收區(qū)域并未發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移，但是特征區(qū)域的透過率明顯上升，表明經(jīng)超高壓處理后β-伴大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

與未處理樣品相比，400 MPa超高壓處理時，蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角的含量顯著下降，而無規(guī)則卷曲和β-折疊的含量顯著上升。 ELISA結(jié)果顯示，400 MPa時β-伴大豆球蛋白的抗原性最低，這表明β-伴大豆球蛋白抗原性的變化可能與二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角的含量下降有關(guān)。有研究指出，過敏原的抗原表位多位于β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)上[28]，與本研究的結(jié)果不同。原因可能是β-伴大豆球蛋白的抗原表位分布不同，文中優(yōu)勢的抗原表位出現(xiàn)在α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)上。綜上可知，β-伴大豆球蛋白的抗原性與二級結(jié)構(gòu)之間存在著相關(guān)性，但是這種關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。

1：0 MPa；2:100 MPa;3:200 MPa;4：300 MPa;5：400 MPa;6：500 MPa;7：600 MPa

表1 超高壓處理后β-伴大豆球蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量

注：同一列的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著。

2.5 蛋白質(zhì)表面疏水性及空間結(jié)構(gòu)分析

圖8 超高壓處理β-伴大豆球蛋白的表面疏水性

圖8為β-伴大豆球蛋白的表面疏水性。由圖8可知，表面疏水性隨超高壓處理壓強(qiáng)的增加而上升。表面疏水性在400 MPa時急劇上升，繼續(xù)加大壓強(qiáng)，表面疏水性并未有顯著變化。這可能是由于超高壓破壞了蛋白質(zhì)原有的空間結(jié)構(gòu)，使原本在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，蛋白質(zhì)的疏水性增加[29]；繼續(xù)增大壓強(qiáng)并不能進(jìn)一步擴(kuò)大疏水區(qū)域，說明此時蛋白結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。圖9為超高壓處理后β-伴大豆球蛋白的熒光光譜圖。熒光光譜顯示最大吸收峰并未發(fā)生明顯的藍(lán)移或紅移，表明超高壓處理并未顯著改變β-伴大豆球蛋白所處環(huán)境的極性。但隨著壓強(qiáng)的增加，熒光強(qiáng)度顯著變化，這表明超高壓處理改變了β-伴大豆球蛋白的三級結(jié)構(gòu)，使得疏水性氨基酸更多地暴露在蛋白質(zhì)表面。壓強(qiáng)為400 MPa時，大量的疏水性氨基酸暴露，此時處理后的β-伴大豆球蛋白也表現(xiàn)出最低的抗原性，這可能是由于超高壓處理改變了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象表位被破壞，從而減少被IgG抗體的識別。也有可能是抗原表位大多存在于親水區(qū)域，超高壓處理使大量的疏水區(qū)域暴露，從而親水區(qū)域減少，抗原表位被掩蓋[28]。綜上可知，超高壓處理后大量疏水性基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變，抗原表位被破壞或掩蓋，從而使β-伴大豆球蛋白的抗原性降低。

1：0 MPa；2：100 MPa；3：200 MPa；4：300 MPa；5：400 MPa；6：500 MPa；7：600 MPa

3 結(jié)論

超高壓處理能夠顯著改變β-伴大豆球蛋白的抗原性及空間結(jié)構(gòu)。超高壓處理后β-伴大豆球蛋白抗原性發(fā)生變化，在400 MPa時抗原性降低最顯著，降低了45.30%。紅外光譜結(jié)果表明，超高壓處理使β-伴大豆球蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與未處理樣品相比，400 MPa時α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角的含量顯著下降，而無規(guī)則卷曲和β-折疊的含量顯著上升。熒光光譜分析結(jié)果顯示，超高壓處理改變了β-伴大豆球蛋白的三級結(jié)構(gòu)，大量疏水區(qū)域暴露，可能掩蓋或破壞其抗原表位。本研究分析了不同條件的超高壓處理對β-伴大豆球蛋白抗原性及結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)超高壓處理可以改變蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，可能影響其抗原表位，從而達(dá)到調(diào)控蛋白過敏原抗原性的目的。該研究為大豆蛋白過敏原的脫敏提供加工方法，為開發(fā)低敏性或無致敏性大豆產(chǎn)品提供理論依據(jù)。