梁玉玲，鮮于梁艷，劉雯雯，張媛媛

(1．河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)中心，河北 保定 071002)

白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.，屬菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，為常用中藥材，其主要藥用成分為蒼術(shù)酮、倍半萜內(nèi)酯等揮發(fā)油類，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎[1]以及抗腫瘤[2]和調(diào)節(jié)胃腸道功能的功效[3].目前野生白術(shù)資源瀕臨滅絕，市場上所用的生藥材大部分來自人工種植白術(shù)，而人工栽培白術(shù)需經(jīng)過繁瑣的、長時(shí)間的育苗過程[4].利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)得到大量白術(shù)試管苗來滿足白術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)種植.國內(nèi)關(guān)于白術(shù)離體植株再生的報(bào)道并不多，主要集中在利用白術(shù)側(cè)芽、葉片、莖尖或根狀莖萌發(fā)的幼芽作為外植體進(jìn)行其離體快繁[5-8]，但增殖率不高，且經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生易產(chǎn)生體細(xì)胞遺傳變異，影響再生植株的品質(zhì)穩(wěn)定.本研究利用白術(shù)胚軸、胚根幼嫩外植體誘導(dǎo)其直接分化芽，再誘導(dǎo)芽生根，建立離體植株再生體系.為藥用植物白術(shù)的工廠化育苗和脫病毒以及利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行品質(zhì)改良提供了有效的再生途徑.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.種子購自河北安國藥材市場.

1.2 培養(yǎng)基

以MS(Murashige and Skoog)為基本培養(yǎng)基，添加不同的生長調(diào)節(jié)劑組合,其中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+TDZ(thidiazuron)1.0 mg/L，MS+6-BA(6-benzyladenine) 1.0 mg/L，MS+ NAA(naphthylacetic acid) 0.2 mg/L +TDZ(0.2，0.5，1.0，1.5，2.0) mg/L和MS+TDZ 1.5 mg/L+NAA(0.2，0.5，1.0，1.2) mg/L；生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L和1/2 MS+IBA(indol 3-butiric acid) 0.5 mg/L.培養(yǎng)基中添加蔗糖和瓊脂，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%和0.8%，pH 5.8，121 ℃高壓滅菌15 min.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 無菌幼苗的獲得

選取粒大、飽滿的種子，用流水沖洗干凈，體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡1 min后，采用2步法消毒,即去除種皮前用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2浸泡種子10 min，無菌水沖洗3～5次，無菌水中浸泡6 h后，剝?nèi)シN皮；再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的NaClO消毒10 min，無菌水沖洗3～5遍.消毒后的種子，接種于無附加生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，于25 ℃黑暗處培養(yǎng)，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)移至光下繼續(xù)培養(yǎng).

1.3.2 不定芽的誘導(dǎo)分化與增殖

待種子萌發(fā)后繼續(xù)培養(yǎng)1周，株高2～3 cm時(shí)取出，分別切取胚根、胚軸、子葉和第1片真葉作為外植體，切成0.3～0.5 cm，分別接種至1.2中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的分化.將誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4周后的分化不定芽繼續(xù)培養(yǎng)于篩選出的最適芽分化培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng).

1.3.3 生根誘導(dǎo)

將生長健壯的2～3 cm長的綠芽，轉(zhuǎn)接至1/2 MS+NAA 0.5 mg/L或1/2 MS+IBA 0.5 mg/L的生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根.

1.3.4 培養(yǎng)條件

植物材料光照培養(yǎng)條件為(25±2) ℃,光照12 h/d，光照強(qiáng)度3 000 lx；暗培養(yǎng)條件為(25±2) ℃，黑暗.

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

芽分化率=分化芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；外植體平均分化芽數(shù)=分化芽數(shù)/分化芽外植體數(shù)；愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；生根率=生根芽數(shù)/接種芽總數(shù)×100%.使用軟件SPSS 22.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行誤差和顯著性分析.

1.3.6 再生植株的移栽

將已經(jīng)生根且生長狀態(tài)良好的試管苗，打開培養(yǎng)瓶蓋，培養(yǎng)間中煉苗2～3 d后小心取出試管苗，洗凈培養(yǎng)基，移栽至裝有滅菌基質(zhì)(蛭石、砂和營養(yǎng)土質(zhì)量比為1∶1∶1)的小缽中,澆透水,薄膜覆蓋保濕,注意通風(fēng)和保持適宜的溫度.

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA和TDZ對白術(shù)不同類型外植體分化不定芽的影響

白術(shù)不同外植體在添加不同種類細(xì)胞分裂素(1 mg/L TDZ或1 mg/L 6-BA)的MS培養(yǎng)基中分化不定芽的效果不同.在培養(yǎng)初期(3～5 d)，上胚軸和胚根外植體在切口處明顯膨大，顏色為鮮艷的黃綠色，而子葉和真葉外植體切口部位沒有明顯的膨大且大部分切口顏色變暗；培養(yǎng)2周以后在膨大的胚軸和胚根處開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，繼續(xù)培養(yǎng)至4周時(shí)，胚根和胚軸外植體均從外植體上直接分化出了不定芽，沒有明顯的愈傷組織產(chǎn)生(圖1a,b)，而子葉和真葉外植體在相同的培養(yǎng)基中均沒有出現(xiàn)不定芽分化，只有少量愈傷組織產(chǎn)生.不同種類細(xì)胞分裂素對不定芽分化率的影響不同，胚軸在含有1 mg/L TDZ的培養(yǎng)基中不定芽分化率為66.63%，在1 mg/L 6-BA時(shí)為63.33%；胚根在含有1 mg/L TDZ的培養(yǎng)基中芽分化率為50.00%，在1 mg/L 6-BA時(shí)為26.67%；每個(gè)外植體分化不定芽2～5個(gè)，其中胚根在2種不同的培養(yǎng)基中的不定芽分化數(shù)目有極顯著的差異(P<0.01)；胚軸在MS+1 mg/L TDZ培養(yǎng)基上分化芽5個(gè)，在2種培養(yǎng)基中的不定芽分化數(shù)目差異不明顯(P>0.05)(表1).與添加6-BA相比，無論是胚軸外植體還是胚根外植體，添加TDZ的培養(yǎng)基中芽誘導(dǎo)率較高，產(chǎn)生不定芽較多，表明TDZ誘導(dǎo)白術(shù)外植體產(chǎn)生不定芽的效果更好.

表1 細(xì)胞分裂素TDZ和6-BA對白術(shù)不同外植體分化不定芽的影響

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.01) .

2.2 不同質(zhì)量濃度TDZ與0.2 mg/L NAA組合對白術(shù)不同外植體分化不定芽的影響

在0.2 mg/L NAA條件下，考察不同質(zhì)量濃度TDZ對白術(shù)胚軸和胚根外植體不定芽分化的影響.胚軸和胚根在不同質(zhì)量濃度TDZ分化培養(yǎng)基上均有不定芽分化，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)芽分化率和芽數(shù)(表2).觀察不定芽的分化情況發(fā)現(xiàn)，外植體在培養(yǎng)1周以后切口部位開始腫脹，但沒有明顯的愈傷組織產(chǎn)生，培養(yǎng)2周出現(xiàn)芽原基突起，之后不定芽直接由傷口部位及其附近部位產(chǎn)生.胚根和上胚軸外植體不定芽分化率和不定芽數(shù)均受到不同TDZ質(zhì)量濃度的顯著影響(P<0.01).當(dāng)TDZ質(zhì)量濃度為0.2～1.5 mg/L時(shí)，胚根外植體芽分化率為15.38%～68.30%，平均不定芽為(3.58±1.62)～(7.95±1.72)個(gè)；胚軸外植體芽分化率為84.38%～91.18%，平均不定芽為(4.11±1.96)～(13.13±2.75)個(gè).2種外植體不定芽分化率均在TDZ質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)最高，TDZ質(zhì)量濃度為2.0 mg/L時(shí)最低；不定芽數(shù)在TDZ質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時(shí)最高，0.2 mg/L時(shí)最低.在相同TDZ質(zhì)量濃度下，上胚軸外植體的不定芽分化率和每個(gè)外植體平均分化芽數(shù)均高于胚根外植體.在實(shí)驗(yàn)中，將不同質(zhì)量濃度TDZ培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后分化不定芽少于3個(gè)的胚軸和胚根外植體轉(zhuǎn)接入MS+1.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d后，平均分化芽分別提高至(15.67±1.53)個(gè)和(7.52±1.34)個(gè).

表2 不同質(zhì)量濃度TDZ與0.2 mg/L NAA組合對白術(shù)胚根和上胚軸分化不定芽的影響

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.01) .

2.3 不同質(zhì)量濃度NAA與1.5 mg/L TDZ組合對白術(shù)不同外植體分化不定芽的影響

選定 TDZ質(zhì)量濃度 1.5 mg/L與不同質(zhì)量濃度NAA進(jìn)行組合，研究不同質(zhì)量濃度NAA對白術(shù)胚根和下胚軸2種外植體不定芽分化的影響.NAA質(zhì)量濃度為0.2～1.2 mg/L時(shí)，隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，2種外植體的不定芽分化率以及不定芽數(shù)都逐漸減小，不同NAA質(zhì)量濃度之間存在顯著差異(P<0.01)(表3).結(jié)果表明，NAA質(zhì)量濃度的增加會逐漸抑制白術(shù)胚根和上胚軸外植體不定芽的分化，同時(shí)，較高質(zhì)量濃度的NAA還會促進(jìn)愈傷組織的形成(數(shù)據(jù)略).

表3 不同質(zhì)量濃度NAA與1.5 mg/L TDZ組合對誘導(dǎo)白術(shù)胚根和胚軸分化不定芽的影響

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.01) .

2.4 不定芽誘導(dǎo)生根與移栽

當(dāng)分化的不定芽長至2～3 cm時(shí)，將其成簇切下，接種至1/2 MS+IBA 0.5 mg/L和1/2 MS+NAA 0.5 mg/L中誘導(dǎo)生根.培養(yǎng)20 d左右，在芽的基部接觸培養(yǎng)基的部分出現(xiàn)根原基，25 d開始生根，培養(yǎng)40 d后根長可達(dá)2～3 cm(圖1c).在1/2 MS+IBA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，生根率為66.66%，在1/2 MS+NAA 0.5 mg/L 培養(yǎng)基中，生根率為31.03%.在含IBA的培養(yǎng)基中再生根更加粗壯，生根后的再生植株葉片綠色并逐漸伸展變大.待白術(shù)再生植株根長至2～3 cm 時(shí)，經(jīng)煉苗2～3 d后，移栽至土壤基質(zhì)中(圖1d)，移栽7 d后統(tǒng)計(jì)試管苗的成活率可達(dá)85% 以上.在誘導(dǎo)生根實(shí)驗(yàn)中嘗試了將成簇的不定芽分離成單芽接種至相同培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～4周后芽變黃枯萎，沒有根長出，原因尚需進(jìn)一步研究.

a.胚根外植體分化不定芽；b.上胚軸外植體分化不定芽；c.具根的再生植株；d.再生植株移栽.圖1 白術(shù)不定芽分化與植株再生Fig.1 Adventitious shoot differentation and plant regeneration for Atractylodes macrocephala in vitro

3 討論

本研究利用無菌幼苗胚軸和胚根作為外植體建立了直接誘導(dǎo)不定芽分化的白術(shù)離體再生體系，2種外植體在MS+TDZ 1.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L中不定芽分化率分別為91.18%和68.30%，每個(gè)外植體分化芽為(13.13±2.75)個(gè)和(7.95±1.72)個(gè)，不定芽在1/2 MS+IBA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中生根，生根率66.66%.白術(shù)是重要的藥用植物，其干燥的根莖作為藥材使用.有研究者報(bào)道以白術(shù)葉片、葉柄、莖段、胚軸為外植體經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)再生芽以及以莖尖、腋芽為外植體促進(jìn)芽原基伸長及叢生芽產(chǎn)生進(jìn)行白術(shù)的離體快速繁殖.朱玉球等[9]以白術(shù)葉片和葉柄為外植體誘導(dǎo)愈傷組織再生芽分化，在添加不同激素配比MS培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)率分別為8.3%～67.4%和17.6%～89.6%，分化率分別為5.4%～42.5%和6.3%～21.7%.陳娟等[7]以白術(shù)葉片為外植體經(jīng)誘導(dǎo)愈傷組織再生植株建立再生體系，其愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)96.7%，芽分化率為90%.在這2則報(bào)道中都是經(jīng)愈傷組織再生芽，前者報(bào)道的芽分化率最高為42.5%，腋芽增殖倍數(shù)最高4.35[9].后者中愈傷組織分化率最高達(dá)90%，但是同時(shí)也指出愈傷組織容易褐化，用帶腋芽原基的小塊可以誘導(dǎo)出叢生芽，其增殖倍數(shù)最高達(dá)4.45[7].在植物離體培養(yǎng)中愈傷組織培養(yǎng)階段容易產(chǎn)生褐化、體細(xì)胞變異等現(xiàn)象，且長期繼代培養(yǎng)的愈傷組織還會出現(xiàn)分化能力和遺傳穩(wěn)定性降低等變化，所以誘導(dǎo)外植體直接分化不定芽是保持母體植株遺傳穩(wěn)定性的一個(gè)有效途徑.在本研究中誘導(dǎo)白術(shù)胚軸和胚根直接分化不定芽，分化率高、每個(gè)外植體分化芽數(shù)多，且避免了愈傷組織培養(yǎng)階段容易產(chǎn)生體細(xì)胞變異的現(xiàn)象，在一定程度上可以提高再生植株的遺傳穩(wěn)定性.胚軸分化率較胚根高，每個(gè)外植體上不定芽分化多，生長健壯，而且每個(gè)無菌幼苗的胚軸可以被切成4～6個(gè)外植體切段，減少了種子的消耗.利用胚軸作為外植體誘導(dǎo)直接分化芽在蜜桔Citrustangerina中也有報(bào)道，在MS附加6-BA和 NAA的培養(yǎng)基中蜜桔胚軸、子葉節(jié)能直接分化出芽，而莖尖則不分化[10].TDZ是一種新型的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性，本研究中TDZ 1.5 mg/L結(jié)合NAA0.2 mg/L誘導(dǎo)芽的分化效果高于其他組合.在鳳仙花Impatienswalleriana高效植株再生和轉(zhuǎn)化體系建立中，利用TDZ結(jié)合6-BA誘導(dǎo)鳳仙花子葉節(jié)直接分化芽的數(shù)量高達(dá)每個(gè)外植體167個(gè)[11].使用TDZ誘導(dǎo)高效離體再生在甘露子中也有報(bào)道[12]，在白術(shù)離體再生中使用TDZ尚未見報(bào)道.本研究利用胚軸、胚根作為外植體直接分化不定芽，建立了白術(shù)高效再生體系，這一再生體系可用于白術(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化，為利用植物基因工程技術(shù)改良白術(shù)品質(zhì)提供技術(shù)保障，還可以用于白術(shù)工廠化育苗與脫病毒.