王 妹，姜鈞耀，杜雨軒，葛曉軍

0 引 言

肺癌的發(fā)病率及死亡率均居世界前列[1-2]。其中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的發(fā)病率占肺癌發(fā)病率的80%[3]。由于早期癥狀不明顯，大部分患者檢出后已是晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，且肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。對(duì)于這類患者的治療主要以放化療為主[4]。然而部分患者對(duì)放化療的療效并不佳[5-6]。

吉非替尼是治療NSCLC在內(nèi)的一種靶向化療藥，其主要通過靶向作用于人類表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)從而阻斷信號(hào)向下游的傳導(dǎo)，抑制RAS-RAF-MEK-ERK通路的激活從而抑制細(xì)胞增殖與侵襲[7-8]。研究表明，吉非替尼通常具有良好的耐受性，并在NSCLC中具有抗腫瘤活性[9-12]；2項(xiàng)大型II期吉非替尼單藥治療研究對(duì)已治療的晚期NSCLC患者進(jìn)行了進(jìn)一步證實(shí)，吉非替尼對(duì)EGFR-TK抑制劑的治療反應(yīng)可能持續(xù)長達(dá)2～3年[13-14]。然而，早期對(duì)化療敏感的患者最終都會(huì)產(chǎn)生耐藥，藥物的平均反應(yīng)時(shí)間為6～8個(gè)月[15]。其耐藥的機(jī)制仍然是目前研究的熱點(diǎn)。

微小RNA(MicroRNA)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，長19至25個(gè)核苷酸，MicroRNA是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的小型非編碼RNA，是目前公認(rèn)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑[16]。據(jù)報(bào)道，MicroRNA可以通過沉默靶基因mRNA的表達(dá)而負(fù)向調(diào)控多種基因[17]，每個(gè)MicroRNA可以調(diào)控多達(dá)數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)[18-19]。MicroRNA在癌癥的進(jìn)展中發(fā)生明顯變化，相對(duì)于mRNA，microRNA更有希望作為在各種疾病的診斷和治療應(yīng)用中的靶目標(biāo)而被使用和開發(fā)。血漿microRNA已被用于癌癥早期檢測(cè)，如結(jié)腸直腸癌等[20-21]。MicroRNA在癌癥診斷中也顯示出高靈敏度和特異性，進(jìn)一步證實(shí)了其作為生物標(biāo)志物的潛力。本研究通過建立對(duì)吉非替尼耐藥的亞克隆H1299、A549細(xì)胞，并進(jìn)行了microRNA表達(dá)微陣列分析和功能研究，以探究NSCLC化療耐藥的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H1299購自American Type Culture Collection，將A549、H1299細(xì)胞長期暴露于吉非替尼中建立出吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞系。

RPMI-1640、胎牛血清購自Life Technologies公司，吉非替尼購自AstraZeneca公司，RNase購自美國Epicentre公司，dNTP購自HyTest Ltd公司，RT緩沖液和RT引物購自Invitrogen Life Technologies公司， G-fectin購自Genolution Pharmaceutical公司，YM-100微型離心柱購自EMD Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H1299細(xì)胞培養(yǎng)于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h更換1次培養(yǎng)基，2～3 d傳代一次，所有試驗(yàn)均使用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行，所有細(xì)胞系均采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法測(cè)試支原體污染為陰性。

1.2.2 吉非替尼耐藥細(xì)胞的構(gòu)建 將吉非替尼用培養(yǎng)基稀釋為0.01 μg / mL，添加到細(xì)胞中，在含吉非替尼的培養(yǎng)基中保留2～4周，或直到細(xì)胞重新聚集為止。然后將吉非替尼濃度提高0.5～2倍。逐步增加劑量持續(xù)16～24個(gè)月，直到吉非替尼濃度達(dá)到≥10倍起始濃度，此后，將吉非替尼耐藥細(xì)胞系維持在其達(dá)到的最高吉非替尼濃度以下。

1.3 方法

1.3.1 吉非替尼對(duì)細(xì)胞活性的影響檢測(cè) 采用CCK-8試劑盒分析吉非替尼對(duì)A549、H1299細(xì)胞的活性影響：取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×103密度接種于96孔板，加入180 μL不含吉非替尼的細(xì)胞培養(yǎng)基。 24 h后，向每個(gè)孔中加入20 μL 含有0.1、1、10、100、1000 μg/mL吉非替尼的培養(yǎng)基，48 h后加入含10%CCK-8的RPMI-1640培養(yǎng)基，并用全波長酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，GraphPad prism7軟件計(jì)算IC50。

1.3.2 細(xì)胞MiRNA表達(dá)譜分析 用TRIzol提取總RNA，并通過生物分析儀確定RNA完整性。通過YM-100微型離心柱過濾RNA樣品(5 μg)得到miRNA(<300 nt)。聚(A)聚合酶用于小RNA的3′末端添加聚(A)尾，寡核苷酸標(biāo)記用于進(jìn)一步的熒光標(biāo)記。2種類型的標(biāo)記用于標(biāo)記匹配的RNA樣品。使用微循環(huán)泵在微流體生物芯片上完成雜交。雜交混合物包含100 μL的6X SSPE緩沖液(0.90 mol/L NaCl，60 mmol/L Na2HPO4、6 mmol/L EDTA，pH 6.8)和25%甲醛，溫度為34 ℃。 AxonGenePix?4000B微陣列掃描儀用于捕獲Cy3和Cy5特異性熒光雜交圖像。 ArrayPro完成數(shù)字轉(zhuǎn)換。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)MiRNA的表達(dá)量檢測(cè) qPCR用于檢測(cè)miRNA表達(dá)譜， 進(jìn)行qPCR以驗(yàn)證從微陣列分析獲得的差異性miRNA表達(dá)譜。使用TRIzol提取總RNA，并通過生物分析儀確定RNA完整性?？俁NA作為模板，并加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)，RNase，dNTP，RT緩沖液和RT引物。將混合物在16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育40 min和85 ℃孵育5 min，以生成miRNA cDNA文庫。 U6用作內(nèi)參。隨后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案使用ABIPRISM?7900系統(tǒng)進(jìn)行PCR定量。其條件為95 ℃下變性10 min，然后在95 ℃下10s，在60 ℃下延伸1 min，共循環(huán)40次。

1.3.4 MiRNA-7轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種在6孔板中，加入含有10%FBS的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基。 使用G-fectin，10 nmol 過表達(dá)mir-7的質(zhì)粒(5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3′)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 并設(shè)置的空載RNA序列(5′-AAC AGT CGC GTT TGC GAC TGG-3′)作為陰性對(duì)照。 轉(zhuǎn)染3 d后，換為不含miR-7的培養(yǎng)基。在初次轉(zhuǎn)染后的第5天，使用qPCR對(duì)miR-7的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估。qPCR的引物序列如下：正向5′-GGGCCCGCTCTAGACT CGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG-3′，反向5′-CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTC

GAGGCTGATC-3′。

1.3.5 Mir-7的靶標(biāo)預(yù)測(cè) TargetScan(http://www.targetscan.org/)、Microcosm Targets(http：// www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)和microRNA.org(http：/ /www.microrna.org/microrna/home.do)用于計(jì)算miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)。

1.3.6 EGFR的表達(dá)檢測(cè) 加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，以13 500×g離心10 min去除細(xì)胞碎片，BCA法測(cè)量蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白緩沖液混勻放置100 ℃ 取30 μg增量后的蛋白上樣，80 V電泳2 h，20 V轉(zhuǎn)膜45 min進(jìn)行半干轉(zhuǎn)，應(yīng)用5%脫脂牛奶/BSA封閉1 h。加入EGFR一抗，4 ℃孵育，次日用TBST清洗3遍，每遍10 min，加入對(duì)應(yīng)二抗，再用TBST清洗3遍，每遍10 min，顯色曝光。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的IC50檢測(cè) 通過CCK-8法檢測(cè)，A549、H1299細(xì)胞的IC50分別為2.05 μg/mL、1.87 μg/mL，A549、H1299吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞的IC50分別為6.81 μg/mL、6.89 μg/mL，吉非替尼獲得性耐藥肺癌細(xì)胞的IC50是非耐藥細(xì)胞的3倍。見圖1。通過CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的IC50結(jié)果顯示，在不含吉非替尼的培養(yǎng)基中維持3周后，A549、H1299耐藥細(xì)胞的 IC50不變(6.75 μg/mL、6.73 μg/mL)。

圖 1 A549、H1299細(xì)胞與其獲得性吉非替尼耐藥細(xì)胞對(duì)吉非替尼的IC50值

Figure 1 A549 and H1299 control cell line and resistant cell line response to gefitinib treatment

2.2 耐藥前后的細(xì)胞形態(tài)觀察 與A549及H1299非耐藥細(xì)胞比較，其耐藥細(xì)胞生長較為緩慢，細(xì)胞形態(tài)擴(kuò)大且扁平，耐藥細(xì)胞類似于衰老細(xì)胞。耐藥細(xì)胞暴露于高濃度的吉非替尼中細(xì)胞表現(xiàn)為急性喪失，偽足增加。見圖2。

圖 2 耐藥細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變

Figure 2 the cell morphology of A549 and H1299 cells and their Gefitinibresistant cells line

2.3 耐藥后細(xì)胞的MiRNA譜分析 在耐藥細(xì)胞中檢測(cè)到43種miRNA的表達(dá)譜發(fā)生了顯著變化(1.98～15.0倍)，其中有25種上調(diào)的miRNA和18種下調(diào)miRNA，選取差異較為明顯的miRNA：mir-21、mir-124c、mir-181、mir-7、mir-146a、mir-145-p基因進(jìn)行qPCR定量檢測(cè)，結(jié)果表明mir-21、mir-124c、mir-181明顯上調(diào)，mir-7、mir-146a、mir-145-p明顯下調(diào)，與微陣列檢測(cè)結(jié)果一致，其中mir-7變化最顯著(P<0.05)。見表1，圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染miR-7基因后的吉非替尼耐藥細(xì)胞系的藥物敏感性分析 耐藥細(xì)胞中miR-7表達(dá)明顯低于非耐藥細(xì)胞。通過TargetScan，Microcosm Targets和microRNA.org目標(biāo)預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-7潛在靶標(biāo)進(jìn)行評(píng)估結(jié)果表明，EGFR是miR-7的靶基因之一。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞mir-7表達(dá)量(0.84±0.10)比較，轉(zhuǎn)染過表達(dá)mir-7的質(zhì)粒后細(xì)胞(6.72±0.84)升高(P<0.05)。提取細(xì)胞蛋白，通過Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)EGFR的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，miR-7表達(dá)升高后，細(xì)胞內(nèi)EGFR表達(dá)明顯降低。表明miR-7是EGFR的負(fù)向調(diào)控因子，確定了EGFR與miR-7表達(dá)之間的相關(guān)性。見圖4。通過CCK-8法比較耐藥細(xì)胞及miR-7轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的IC50值的變化，結(jié)果表明，H1299耐藥細(xì)胞IC50由7.23 μg/mL降低至2.46 μg/mL，A549耐藥細(xì)胞IC50由6.85降低至2.23 μg/mL(P<0.05)。見圖5。

表 1 吉非替尼耐藥與非耐藥H1299、A549肺癌細(xì)胞中microRNA的差異表達(dá)水平

Table 1 The differential expression levels of micro(mi)RNA in gefitinib resistant A549 and H1299 cells and parental cells

編號(hào)H1299名稱倍數(shù)(log2)P值A(chǔ)549名稱倍數(shù)(log2)P值1miR-2112.2400.0025miR-2112.0210.00302miR-124c11.6210.0049miR-18111.4220.00533miR-18111.1850.0153miR-124c10.9930.01874miR-2149.0730.0020miR-21410.2660.00205miR-319.0230.0401miR-318.5240.04156miR-148a8.5490.0071miR-148a8.4640.00707miR-299-5p7.9580.0251miR-299-5p8.1120.02598miR-1277.0950.0149miR-1276.7870.01469miR-6606.8520.0077miR-6606.7720.007310miR-226.4260.0135miR-226.3430.012711miR-7665.1980.0053miR-24-15.2430.004712miR-24-15.1050.0027miR-7665.1290.002313miR-7624.9760.0154miR-7625.0870.016214miR-1434.6850.0056miR-1434.6910.005315miR-1324.1940.0234miR-376a4.2560.022416miR-99a4.1560.0132miR-99a4.1410.014817miR-376a4.0930.0310miR-1324.0980.030318miR-1453.8590.0171miR-1453.6670.017019miR-125b3.5310.0028miR-125b3.1320.002520miR-130a3.2160.0069miR-130a2.9910.007321miR-423-5p2.9950.0184miR-423-5p2.8760.017422miR-4972.5240.0251miR-4972.5530.024723miR-7442.3880.0004miR-3752.4340.000824miR-3752.2580.0021miR-7442.2250.001225miR-140-3p1.9820.0338miR-140-3p1.9980.034126miR-7-14.0350.0051miR-7-15.0970.004527miR-146a-9.9610.0246miR-146a-11.9560.023828miR-142-5p-9.4580.0210miR-142-5p-9.5980.019729miR-122-7.5580.0234miR-122-7.3510.026330miR-494-5.5210.0184miR-126-5.3390.010531miR-424-5.3850.0046miR-424-5.2330.007332miR-126-5.2100.0363miR-494-5.0170.034333miR-224-4.7790.0342miR-224-4.9850.030534miR-638-4.5620.0098miR-155-4.6360.010135miR-155-4.2980.0066miR-638-4.1760.005336miR-483-3p-3.9950.0154miR-483-3p-4.0880.017737miR-92a-3.7800.0001miR-92a-3.9760.000338miR-505-3.6510.0298miR-505-3.6480.031439miR-125-3p-3.4750.0234miR-125-3p-3.1220.025540miR-572-2.9650.0259miR-572-2.4940.026341miR-100-2.3910.0181miR-100-2.3210.017742miR-720-2.2500.0105miR-720-2.1650.009343let-7e-1.9870.0121let-7e-2.0090.0107

圖 3 qPCR檢測(cè)耐藥細(xì)胞與非耐藥細(xì)胞間miRNA的差異表達(dá)

Figure 3 q PCR used to detects the differential expression of miRNA between drug-resistant and the parental

1:非耐藥細(xì)胞；2：耐藥細(xì)胞；3：耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-7質(zhì)粒

圖 4 Western blot檢測(cè)H1299、A549 EGFR蛋白表達(dá)

Figure 4 Western blot analysis detectedthe expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) protein in all kinds cells

圖 5 上調(diào)miR-7后耐藥細(xì)胞的IC50

Figure 5 the IC50of gefitinib resistence cells witch transfected of miR-7 gene

3 討 論

目前，化學(xué)療法仍然是治療NSCLC的主要治療方法[21-22]。然而，化學(xué)療法目前已經(jīng)遇到了瓶頸，盡管部分患者對(duì)化療藥的初始反應(yīng)良好，但大多數(shù)NSCLC患者仍會(huì)發(fā)生化療耐藥和復(fù)發(fā)[23-24]。因此，需要開發(fā)新型的靶向特異性分子以減輕耐藥，對(duì)miRNA的研究使之成為可能。

已有報(bào)道關(guān)于miRNA在肺癌的藥物耐藥性中作用。此前的研究表明，miR-134/487b/655基因有助于轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)且直接靶向作用于膜相關(guān)鳥苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinaseinverted-2, MAGI2)WW和PDZ結(jié)構(gòu)域從而影響吉非替尼的耐藥性[25]，而抑制MAGI2導(dǎo)致肺癌細(xì)胞磷酸酶和張力蛋白同源物喪失穩(wěn)定性，這提示miR-134/miR-487b/miR-655簇可能是晚期肺腺癌患者的新型潛在治療靶標(biāo)。 Dong等[26]表明，與對(duì)順鉑敏感的細(xì)胞系相比，在順鉑耐藥的肺癌細(xì)胞系中miR-31明顯上調(diào)。 An等[27]使用miRNA芯片分析鑒定出經(jīng)Rh2處理后的A549細(xì)胞與未處理的A549細(xì)胞相比，有24種miRNA存在明顯的差異表達(dá)。還檢測(cè)到miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222在吉非替尼刺激的NSCLC細(xì)胞中異常表達(dá)，這可能在吉非替尼誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞凋亡和EMT中起重要作用[28]。這些作用可能是通過抑制BCL2、凋亡肽酶激活因子1、蛋白激酶Cε和肉瘤病毒癌基因同源物的基因的表達(dá)而介導(dǎo)的。

一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究表明，miR-7通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中EGFR的表達(dá)在乳腺癌患者治療的耐藥性發(fā)展中發(fā)揮作用[29]。據(jù)報(bào)道，MiR-7還可以調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞中IGF-1R的表達(dá)[30]。本研究中，通過微陣列技術(shù)對(duì)吉非替尼耐藥A549、H1299細(xì)胞及非耐藥細(xì)胞中MiRNA表達(dá)量的比較，篩選出差異表達(dá)較為明顯的miR-7，qPCR研究結(jié)果表明吉非替尼耐藥細(xì)胞的miR-7表達(dá)明顯降低，qPCR檢測(cè)結(jié)果與微陣列一致。本研究通過生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)了miR-7的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)EGFR是miR-7的主要靶標(biāo)之一，通過Western blot分別檢測(cè)了2種細(xì)胞內(nèi)EGFR的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞EGFR表達(dá)明顯高于非耐藥細(xì)胞，本研究結(jié)果表明，EGFR受miR-7負(fù)調(diào)控作用，并且在吉非替尼耐藥細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)水平上調(diào)與miR-7的降低密切相關(guān)。

有報(bào)道，EGFR信號(hào)傳導(dǎo)不僅有助于腫瘤細(xì)胞的增殖，分化、抗凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)，而且還參與了疾病的進(jìn)展[31]。因此，miR-7的降低導(dǎo)致EGFR表達(dá)升高在肺癌細(xì)胞治療的耐藥性發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，miR-7可能通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中EGFR的表達(dá)。

本研究中，miRNA表達(dá)譜檢測(cè)到了吉非替尼耐藥和吉非替尼敏感的A549、H1299細(xì)胞之間的差異表達(dá)模式。在分析的miRNA基因中，有43種miRNA在細(xì)胞系之間發(fā)生了顯著改變(>1.98倍)，包括25種miRNA的上調(diào)和18種miRNA的下調(diào)。上述miRNA在細(xì)胞中的差異表達(dá)水平提示這些miRNA在NSCLC細(xì)胞耐藥性發(fā)展中作用。

本研究的局限性在于只預(yù)測(cè)了miR-7的靶目標(biāo)，所用細(xì)胞系較少，后續(xù)將選用更多細(xì)胞系， 對(duì)篩選出的更多miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)miRNA在細(xì)胞中的差異表達(dá)在細(xì)胞耐藥中發(fā)揮重要作用。