田明明，孫大康，孟 瑋，王 楠，倪 娜，李清春，王雁林，孫洪亮

0 引 言

表觀遺傳修飾是當今生命科學領域中的研究熱點，在沒有基因序列改變的情況下，基因功能可逆及可遺傳改變。其中，組蛋白修飾包括甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化及糖基化等，組蛋白修飾與許多基本的生物學功能密切相關，如細胞周期調(diào)控，DNA復制和修復，轉錄活性和染色體形態(tài)及功能的穩(wěn)定性等[1-4]。其中，組蛋白磷酸化是對組蛋白氨基酸殘基特殊位點的磷酸化修飾。組蛋白H3磷酸化可調(diào)控減數(shù)分裂過程，參與染色體的凝聚和分離過程進而影響紡錘體和微管裝配[5]。關于組蛋白磷酸化修飾在卵母細胞成熟進程中的研究文獻偏少，且部分研究結果間存在差異，Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵母細胞在GV時期的組蛋白H3S10磷酸化修飾程度偏高；而Swain等[7]發(fā)現(xiàn)小鼠GV期卵母細胞未觀察到H3S10磷酸化修飾；以上研究得出不同的結論可能與所用小鼠品系及不同抗體有關；在兔GV期的卵母細胞中研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3S10未發(fā)生磷酸化[8]?？傊?，哺乳動物卵母細胞成熟進程中組蛋白磷酸化修飾在減數(shù)分裂過程中的作用機制仍需進一步探討。

組蛋白H3磷酸化修飾主要與Aurora激酶家族有關[9]，研究發(fā)現(xiàn)Aurora激酶抑制劑ZM447439處理小鼠卵母細胞后，引起染色體及紡錘體發(fā)生異常[10]，表明Aurora激酶調(diào)節(jié)卵母細胞組蛋白H3的磷酸化修飾，參與減數(shù)分裂發(fā)生過程。而Shuda等[11]研究表明過表達Aurora B可恢復ZM447439處理導致的染色體異常，這也表明Aurora B激酶負責卵母細胞染色體的調(diào)控。因此，卵母細胞的組蛋白磷酸化修飾可能由Aurora激酶介導調(diào)控，但具體以何種方式調(diào)控影響后續(xù)減數(shù)分裂過程需待進一步研究。

本試驗以豬卵母細胞為研究對象，研究Aurora激酶抑制劑ZM447439對卵母細胞成熟、組蛋白H3Ser10磷酸化及Aurora B激酶變化的影響，進而探討組蛋白磷酸修飾在卵母細胞成熟過程中的作用機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 成熟液中除TCM-199購自Gibco公司外，除特殊說明外，實驗所用試劑均購買于Sigma公司。ZM447439(Tocris Bioscience): 需溶于二甲基亞砜(DMSO)，配制成3種不同濃度工作液(5、10 和30 μmol/L)。豬卵母細胞成熟液：TCM-199+10%豬卵泡液+10 IU/mL eCG+10 IU/mLhCG;抗體：一抗為小鼠單克隆抗H3Ser10抗體(1∶200，Abcom)；二抗為FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體(1∶200，Cell Signal)。

1.2 方法

1.2.1 豬卵母細胞獲取和成熟 將從農(nóng)貿(mào)市場收集運回實驗室的卵巢沖洗消毒， 10 mL注射器抽取卵巢表面不同直徑的卵泡，將卵泡液移入試管中置于39 ℃恒溫箱放置15 min中，棄上清，在體視顯微鏡下選取顆粒細胞松散，胞質均勻的卵丘卵母細胞復合體(COCs)，于洗卵液清晰去除組織塊，移入成熟液中再38.5 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h后，換成不含激素的成熟液再次培養(yǎng)20 h。體外成熟42 h后將COCs轉移至1%透明質酸酶的洗卵液中孵育10 min，用100 μL移液槍反復吹打COCs，挑取卵母細胞做后續(xù)實驗備用。

1.2.2 卵母細胞處理 將COCs分為4個組，一組正常培養(yǎng)作為對照組，另外3組分別添加5、10、30 μmol/L ZM447439的成熟液中，體外培養(yǎng)27 h，分別為5、10、30 μmol/L ZM447439處理組。收集豬卵母細胞進行后續(xù)組蛋白H3Ser10磷酸化修飾相關實驗。

1.2.3 免疫組化分析 收集不同時期的卵母細胞，用T-BSA-PBS洗液(阻斷液)清洗去除培養(yǎng)液中的血清等成分，移于含4%多聚甲醛的PBS中固定30 min。移入阻斷液中靜置5 min清洗3次。卵母細胞移入1%TritonX-100中透化處理10 min，移入阻斷液中放置5 min重復2次。卵母細胞移入1%BSA中孵育1 h，目的是封閉非特異性位點。阻斷液靜置5 min清洗3次，將卵母細胞移入1%BSA稀釋的小鼠單克隆抗H3Ser10抗體，于4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天將胚胎置于培養(yǎng)箱中孵育20 min，隨后移入阻斷液中靜置5 min清洗3次，將細胞取出并置于二抗FFITC標記山羊抗小鼠IgG抗體中，室溫避光孵育1.5 h。移入阻斷液中靜置5 min清洗3次。10 mg/mL PI避光染色5 min。移入阻斷液中靜置5 min清洗3次，最后用凡士林封固。通過激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5)觀察卵母細胞染色情況，并計算熒光強度。

1.2.4 實時熒光定量PCR 使用10 μL/管微量細胞裂解液(Cells-to-cDNATMII Kit，Ambion, UK)，每管放入20個卵母細胞，每組試驗重復3次。將含有卵母細胞的裂解液放入PCR儀中,75℃反應15 min，滅活RNase。加入DNase I和 10×Buffer，37 ℃反應 40 min，再加入random primer，EDTA和dNTP, 65 ℃水浴10 min，以中止反應。最后根據(jù)說明書加入Reverse transcriptase SSⅡRT，5×Buffer、DTT和RNase Inhibitor, 25 ℃中反應10 min，42 ℃反應90 min，95 ℃反應10 min，4 ℃停止。反轉完成后將cDNA用ddH2O稀釋成20 μL體積備用。實時熒光定量PCR的反應體系為20 μL：RT-PCR產(chǎn)物1 μL，2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) 10 μL，Primer F/R(10 μmol/L)0.6 μL，Rnase Free water 8.4 μL。反應條件：95 ℃變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，每個樣品至少重復3次。18 s(上游：5＇-GATGGGCGGCGGAAAATTG-3＇，下游：5＇ -TCCTCAACACCACATGAGCA-3＇)作內(nèi)參，采用2-△△Ct公式計算目的基因Aurora B(上游：5＇- CCAAACATCTTGCGTCTCTA -3＇，下游：5＇- TGGCAGTATATCAGAGCGTC -3＇)的表達量。

2 結 果

2.1 豬卵母細胞成熟過程中組蛋白H3S10磷酸化表達情況 GV期豬卵母細胞H3S10磷酸化未表達，從GVBD期組蛋白H3S10磷酸化開始表達，至AI期，磷酸化水平呈升高趨勢，在MI或AI期磷酸化修飾達到最高水平； 至MII期磷酸化水平逐漸降低。與 GVBD期組蛋白H3S10磷酸化水平比較，MI期和AI期明顯升高(P<0.05)，AI期較MII期明顯升高(P<0.05)。MI期與AI期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

2.2 組蛋白H3S10磷酸化對豬卵母細胞核成熟的影響 與對照組相比， 10、30 μmol/L ZM447439處理組GVBD期卵母細胞比例增加(P<0.05)，MI、AI期明顯下降(P<0.05)，5 μmol/L ZM447439處理組對卵母細胞體外成熟核進程影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這也表明隨著ZM447439濃度升高將嚴重影響卵母細胞核進程，卵母細胞無法完成減數(shù)分裂。見表1。

綠色代表H3S10磷酸化，紅色代表DNA

圖 1 不同成熟時期豬卵母細胞組蛋白H3S10磷酸化表達( ×200)

Figure 1 Immunolocalization of phH3S10 at during porcine oocyte maturation( ×200)

與GVBD期比較，*P<0.05;與AI期比較，#P<0.05

圖 2 豬卵母細胞體外成熟各時期組蛋白H3S10磷酸化水平

Figure 2 Relative intensity level of phH3S10 during porcine oocyte maturation

組別n不同時期卵母細胞比例(%)GVBD期MI期AI期對照組852.56±0.0387.42±0.1410.02±0.215 μmol/L ZM447439處理組955.95±0.9584.22±0.139.83±0.0910 μmol/L ZM447439處理組9332.14±0.51*66.88±0.13*1.01±0.03*30 μmol/L ZM447439處理組10195.34±0.59*4.66±0.04*0.00±0.00*

與對照組比較，*P<0.05

2.3 ZM447439對豬卵母細胞組蛋白H3S10磷酸化表達的影響 與對照組卵母細胞發(fā)生H3S10去磷酸化修飾比例(0)比較，5 μmol/L ZM447439處理組[(10.9±0.21)%]升高(P>0.05)，10 μmol/L、30 μmol/L ZM447439處理組[(35.2±0.39)%、(95.4±0.65) %]明顯升高(P<0.05)。以上結果表明，隨ZM447439濃度逐漸增大，豬卵母細胞H3S10磷酸化表達水平逐漸降低，進一步發(fā)現(xiàn)卵母細胞中H3S10磷酸化消失的比例隨之增加。 見圖3。

a:對照組； b-d:分別為5、10、30 μmol/L ZM447439處理組

圖 3 ZM447439對豬卵母細胞H3S10磷酸化時空分布的影響( ×200)

Figure 3 Effects of ZM447439 on the distribution of H3S 10Ph at different stages of pig oocytes( ×200)

2.4 ZM447439對豬卵母細胞蛋白激酶Aurora B基因表達的影響 10、30 μmol/L ZM447439處理組AuroraB基因的相對表達量(0.65±0.10、0.53±0.09)較對照組(1.00±0.03)顯著降低(P<0.05)，而5 μmol/L ZM447439處理組(0.92±0.08)較對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

已有的研究發(fā)現(xiàn)從低等動物到高級的哺乳動物[13]，組蛋白H3磷酸化修飾機制具有高度的保守性，其中，組蛋白H3第10個絲氨酸位點(S10)的磷酸化修飾可作為細胞分裂的一個標志。在卵母細胞減數(shù)分裂過程中，組蛋白磷酸化修飾隨著染色質空間結構的變化也處于不斷變化過程中[14]。有研究表明組蛋白H3S10磷酸化修飾與染色體的濃縮具有相關性[15]。而也有研究報道，Aurora B和組蛋白H3磷酸化不是卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中染色質凝聚必需的[5]。在哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂不同階段，尤其是恢復后，組蛋白H3磷酸化的表達模式尚不清楚[16-17]，而組蛋白H3磷酸化在豬卵母細胞減數(shù)分裂過程中的研究報道很少。

本試驗從mRNA和蛋白層面，檢測了組蛋白H3S10磷酸化在豬卵母細胞減數(shù)分裂各時期的動態(tài)分布情況。本研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3S10的磷酸化均開始于豬卵母細胞GVBD期，GV期均未檢測到磷酸化信號，這與Bui等的報道一致[19]，Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細胞GV期均發(fā)生磷酸化，這也表明在不同物種中卵母細胞的組蛋白H3S10磷酸化修飾模式各有差別，需更深入的研究與卵母細胞成熟相關性。本試驗中發(fā)現(xiàn)豬卵母細胞從GVBD期組蛋白H3S10磷酸化開始表達，至AI期，磷酸化水平呈升高趨勢，在MI或AI期磷酸化修飾達到最高水平；到MII期磷酸化水平逐漸降低。我們推測，隨著減數(shù)分裂進程的發(fā)展，組蛋白磷酸化修飾的功能是通過影響轉錄因子與功能基因啟動子的啟動利于基因的調(diào)控，加速蛋白質合成，最終促進卵母細胞細胞質的成熟。與小鼠卵母細胞H3S10磷酸化模式有著不相同之處，Wang等[16]研究結果發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細胞組蛋白H3S10磷酸化在GVBD發(fā)生，且MI期的高水平表達一直維持到MII期。對于上述結果我們推測可能與不同物種、品系及所用檢測抗體相關。已有的研究結果表明小鼠和豬卵母細胞組蛋白H3S10在MI、AI和MII期均發(fā)生磷酸化[19]，這進一步說明組蛋白H3S10磷酸化修飾存在于豬卵母細胞減數(shù)分裂過程中，并且對減數(shù)分裂發(fā)生具有重要調(diào)控作用。

哺乳動物卵母細胞中組蛋白的磷酸化狀態(tài)可能是由功能相互拮抗的PP1/PP2A和Aurora激酶共同調(diào)控[20]。Aurora激酶分為三類：Aurora A，Aurora B和Aurora C。在卵母細胞成熟過程中，Aurora B激酶不僅參與組蛋白H3S10磷酸化的調(diào)控，而且調(diào)控染色體動態(tài)變化[21]，且組蛋白H3S10磷酸化修飾隨著染色體凝聚的變化而變化[9]。ZM447439是一種Aurora激酶抑制劑，具有有效抑制組蛋白H3S10的磷酸化的作用[22]。王慧利等[19]研究發(fā)現(xiàn)50μM ZM447439才能對小鼠卵母細胞組蛋白H3S10的磷酸化修飾起著顯著地抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)隨ZM447439濃度的提高，豬卵母細胞H3S10磷酸化水平及Aurora B激酶表達水平降低，該結果表明Aurora激酶抑制劑可調(diào)控豬卵母細胞H3S10磷酸化修飾及Aurora B激酶的功能。研究也發(fā)現(xiàn)低濃度ZM447439對卵母細胞核成熟進程影響不大，但是隨著ZM447439濃度升高嚴重影響卵母細胞核成熟進程，影響到卵母細胞的成熟度，絕大多數(shù)卵母細胞阻滯在GVBD期，我們可以推測出ZM447439通過作用于Aurora B激酶及H3S10磷酸化修飾，導致卵母細胞減數(shù)分裂阻滯。

綜上所述：本研究試驗結果顯示，組蛋白H3S10磷酸化及Aurora B激酶參與調(diào)控了卵母細胞減數(shù)分裂過程，這對研究人類輔助生殖領域中部分患者卵子不成熟提供一種思路，也為深入研究組蛋白磷酸化修飾在卵母細胞減數(shù)分裂過程調(diào)控的分子基礎奠定了基礎。