鄭小鵬，馮 靜，宋朝宇，王芳芳，張慧明，隋洪玉，辛 華，陳 光

0 引 言

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種高發(fā)病率和高死亡率的終生代謝性疾病，急/慢性并發(fā)癥的出現(xiàn)降低了患者的生活質(zhì)量[1-2]。糖尿病腎病(diabetic Nephropathy，DN)作為DM嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，發(fā)生過(guò)程十分隱匿，臨床診斷只能依據(jù)大量蛋白尿，一旦發(fā)現(xiàn)蛋白尿腎損壞往往比較嚴(yán)重且不可逆轉(zhuǎn)，最終只能通過(guò)腎替代治療來(lái)延續(xù)生命[3-4]。開(kāi)展DN發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究不僅是國(guó)際醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，而且也是我國(guó)腎病領(lǐng)域丞待解決的難題。目前，臨床中對(duì)于DN的治療尚無(wú)特效療法[5-6]，尋找有效的治療策略迫在眉睫。為此科研工作者將腎的中藥治療作為當(dāng)今臨床治療腎疾病的突破點(diǎn)。

黃芩屬唇形科植物，含有多種黃酮類(lèi)化合物[7]。黃芩苷是黃芩中一種重要的黃酮類(lèi)化合物，具有清熱解毒、抗炎、抗氧化作用、在治療腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)許多方面都有很好療效[8-9]。近年來(lái)，黃芩苷在降血糖血脂、改善代謝綜合征方面的作用受到廣泛關(guān)注，特別是在DN的治療方面展現(xiàn)了更好的應(yīng)用前景[10-11]。本實(shí)驗(yàn)使用黃芩苷灌胃DN大鼠，旨在研究探討黃芩苷的抗纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性清潔級(jí)SD大鼠45只，體重180～220 g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(黑)2016-014)黃芩苷購(gòu)于源葉生物；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；檸檬酸鈉和檸檬酸購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)公司；血糖儀與血糖試紙購(gòu)自三諾生物傳感股份有限公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growthfactor β1，TGF-β1)抗體購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司；α-SMA抗體購(gòu)于北京博奧森公司；β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；PAS染色試劑盒購(gòu)于Solarbio公司；Masson染色試劑盒購(gòu)于Solarbio公司；全自動(dòng)生化分析儀(Beckman coulter)；曝光機(jī)(Tanon-5200Multi)；希森美康尿液分析儀(UF-1000i)；顯微鏡(Leica DM4000B)。

1.2 方法

1.2.1 分組造模與給藥 本次實(shí)驗(yàn)大鼠在佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，環(huán)境溫度為(24±1)℃，相對(duì)濕度55%±10%，自由進(jìn)食、飲水。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)化分組將45只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、黃芩苷處理組，各15只。正常組不予處理，模型組與黃芩苷處理組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)65 mg/kg。72 h后尾靜脈采血，血糖儀檢測(cè)大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)值(禁食 ≥8 h)，按照連續(xù)3 d檢測(cè)的大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下血糖值均≥16.7 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)，可確定DM造模成功，自DM造模成功起，對(duì)照組正常飲食，其他組大鼠均給予高脂高糖飲食，黃芩苷處理組給予黃芩苷160 mg/kg/d(黃芩苷純度≥98%，使用三蒸水進(jìn)行稀釋)灌胃，正常對(duì)照組與模型組給予等劑量等滲鹽水灌胃，于第4周、第8周代謝籠收集尿液進(jìn)行尿常規(guī)檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性可判斷DN大鼠模型構(gòu)建成功(參照藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)第四版)，8周后處死。

1.2.2 一般指標(biāo)檢測(cè) 所有大鼠每周固定時(shí)間稱重，尾靜脈采血使用血糖儀進(jìn)行血糖監(jiān)測(cè)。第4周，第8周將大鼠轉(zhuǎn)入代謝籠中，不禁食不禁水，收集尿液進(jìn)行尿常規(guī)檢測(cè)。正常記錄各組大鼠飲食和飲水量，隨時(shí)觀察其精神狀態(tài)及毛色變化，每周固定時(shí)間監(jiān)測(cè)血糖/體重變化。采用尾靜脈穿刺采血法取血，血糖檢測(cè)儀測(cè)定大鼠血糖值變化。

1.2.3 腎功能檢測(cè) 各組大鼠眼球取血，分離血清，4 ℃離心(離心半徑40 cm，3000 r/min，15 min)，經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)的生化指標(biāo)檢測(cè)。第8周于代謝籠中收集各組大鼠尿液進(jìn)行尿常規(guī)檢測(cè)。

1.2.4 腎組織病理學(xué)檢測(cè) 所有大鼠第8周末處死取材，大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg) 麻醉，取部分腎組織置于10%中性甲醛中固定，大鼠腎組織包埋切片，分別進(jìn)行HE染色，PAS及Masson染色。400倍鏡下隨機(jī)挑取3張圖片進(jìn)行腎組織病理學(xué)觀察；另一部分腎組織凍存于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot相關(guān)蛋白檢測(cè)。

1.2.5 HE染色 取材組織塊，常規(guī)固定，包埋，切片，脫蠟水洗2 min后蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分色30 s，自來(lái)水浸泡15 min，置伊紅液中2 min，常規(guī)脫水，透明，封固，顯微鏡觀察并照相。觀察各組大鼠腎基本病理改變和炎性反應(yīng)情況。

1.2.6 Masson染色 取組織切片，常規(guī)脫蠟至水后用配制好的 Weigert 鐵蘇木精染色液(24 h之內(nèi)使用)染核7 min，酸性乙醇分化液分化10 s，水洗，Masson藍(lán)化液返藍(lán)3 min，水洗。三蒸水洗1 min。麗春紅品紅染色液染色8 min，磷鉬酸溶液洗90 s，用配置好的弱酸工作液洗1 min。苯胺藍(lán)染色液中浸泡80 s。弱酸工作液洗1 min。95%乙醇快速脫水。無(wú)水乙醇脫水5 min×3次，二甲苯透明10 min×3次。中性樹(shù)脂封固。顯微鏡觀察并照相，觀察各組大鼠腎纖維化程度。

1.2.7 PAS染色 常規(guī)固定，常采用 10%的福爾馬林，常規(guī)脫水包埋。石蠟切片脫蠟入蒸餾水；自來(lái)水沖洗3 min，再用三蒸水浸洗5 min×2次。 置于氧化劑中，室溫(25～30 ℃)放置7 min，自來(lái)水沖洗2 min，三蒸水浸洗5 min。切片放入Schiff Reagent中，于室溫中用錫紙避光浸染15 min。自來(lái)水沖洗10 min。 樣本置于蘇木精染色液中，染細(xì)胞核90 s。酸性分化液分化5 s。三蒸水沖洗15 min使其返藍(lán)，逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水。二甲苯透明，中性樹(shù)脂封固。顯微鏡觀察并照相，觀察腎小球系膜基質(zhì)及膠原纖維含量。

1.2.8 Western blot檢測(cè) 取50 mg腎組織，加入裂解液，蛋白酶抑制劑(PMSF)于研磨器中，均勻研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，超聲破碎7 s×3次后冰浴30 min，4 ℃離心15 min(補(bǔ)充離心半徑14 000 r/min)。取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×Loading Buffer 1∶4混勻后煮沸10 min，凍存于-20 ℃冰箱備用。蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜(PVDF膜甲醇浸泡10 s激活)，5%脫脂奶粉37 ℃封閉90 min，加一抗(TGF-β1，β-Actin，α-SMA濃度為1∶1000)，4 ℃過(guò)夜。次日，TBST洗膜5 min/4次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗 (1∶7000) ，室溫?fù)u床30 min后37 ℃孵育1 h，TBST洗膜4次/5 min?；瘜W(xué)發(fā)光試劑ECL顯影，曝光。Tanon Gis對(duì)其進(jìn)行吸光度分析。以所測(cè)得的各指標(biāo)的吸光度與內(nèi)參β-actin吸光度的比值代表定量值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況觀察 與正常組對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠精神萎靡，不喜運(yùn)動(dòng)，毛色黃無(wú)光澤，飲食/水量明顯增加；與模型組相比，黃芩苷處理4周后，上述情況有所改善，治療8周后整體狀況明顯好轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)全部時(shí)間內(nèi)，正常組大鼠全部存活，造模后第2周模型組大鼠死亡1只，第3周死亡1只；黃芩苷處理組第2周死亡1只。

2.2 各種大鼠FBG和體重比較 與正常對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠空腹血糖在造模后4、8周明顯升高，而體重降低(P<0.05)；與模型組相比，黃芩苷治療組大鼠在造模后4、8周血糖明顯下降(P<0.05)，體重?zé)o明顯改善(P>0.05)。見(jiàn)表1。

項(xiàng)目nFBG(mmol/L)造模4周造模8周體重(g)造模4周造模8周正常對(duì)照組156.20±1.067.44±1.08521.14±36.56522.00±38.98模型組1324.49±1.76*30.40±2.98*287.22±83.05*307.44±80.76*黃芩苷組1419.62±2.82*#22.03±1.70*#281.78±47.96*334.44±77.53*

與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05

2.3 各組大鼠腎功能比較 與正常對(duì)照組大鼠BUN、Scr、24 h尿量相比，模型組大鼠明顯升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，黃芩苷處理組大鼠的BUN和Scr水平均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別nBUN(mmol/L)Scr(μmol/L)24 h尿量(mL)尿蛋白正常對(duì)照組158.01±0.9224.15±3.2410.78±1.24(-)模型組1316.97±3.63*52.58±2.33*32.65±2.69*(+)黃芩苷組1412.73±0.67*#43.77±1.73*#19.34±2.16*#(±)

與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05

2.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 各染色結(jié)果顯示，正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)病理學(xué)改變；HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠腎小球體積增大，系膜區(qū)增寬，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；PAS染色結(jié)果顯示，腎小球系膜增生，呈紫紅色，腎小球基質(zhì)內(nèi)有大量染成紫紅色的糖原物質(zhì)沉積；Masson染色結(jié)果顯示，腎小球染色偏藍(lán)，腎纖維化嚴(yán)重。黃芩苷處理后腎的組織形態(tài)學(xué)改變均明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.5 Western blot檢測(cè) 與正常組大鼠相比，模型組大鼠的TGF-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，黃芩苷處理組大鼠的TGF-β1與α-SMA的蛋白表達(dá)水平明顯下降 (P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖 1 鏡下觀察大鼠腎組織病理變化( ×400)

Figure 1 HE, PAS, Masson staining to observe the pathological changes of rat kidney( ×400)

1:正常組； 2：模型組； 3：黃芩苷組

a:Western blot檢測(cè); b:TGF-β1蛋白表達(dá)量; c:α-SMA蛋白表達(dá)量

與正常組相比，*P<0.05，與模型組相比，#P<0.05

圖 2 黃芩苷處理降低糖尿病腎病大鼠TGF-β1與α-SMA的表達(dá)

Figure 2 Baicalin treatment reduced TGF-β1and α-SMA expression in rats with diabetic nephropathy

3 討 論

DN既是DM最常見(jiàn)而嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥，又是其主要的致死原因之一。目前國(guó)內(nèi)臨床上無(wú)有效的治療方案。因此尋找高效低毒藥物及有效治療策略尤為重要。目前的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有抗氧化、降低炎癥反應(yīng)等作用，尤其在DN的治療方面具有極高的應(yīng)用價(jià)值。因此本研究目的是通過(guò)黃芩苷處理DN大鼠，檢測(cè)其對(duì)糖尿病腎病腎損傷的干預(yù)作用，旨在為糖尿病腎病的有效治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。所有慢性腎疾病發(fā)展的必然結(jié)局就是腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致終末期腎功能衰竭[12-13]。。然而，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩苷能抑制不同組織器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展，主要作用機(jī)制包括夠抑制促纖維因子表達(dá)、抑制纖維化信號(hào)通路、抗炎、抗氧化等，是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的多組織器官抗纖維化藥物[14]。

隨著研究的不斷深入，Yang 等[15]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對(duì)DN患者有著較好的治療效果，可通過(guò)下調(diào)24 h尿白蛋白、β2微球蛋白，降低血管通透性以改變DN患者的腎功能，通過(guò)抗炎、抗氧化等途徑延緩DN的進(jìn)展。黃芩苷是否通過(guò)其他機(jī)制保護(hù)腎還有待進(jìn)一步研究。為此，本實(shí)驗(yàn)采用黃芩苷處理DN大鼠后首先對(duì)比了各組大鼠的一般狀態(tài)、體重、空腹血糖值、血尿氮素(BUN)水平、血肌酐(Scr)水平和24 h尿量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與模型組大鼠相比，黃芩苷處理組大鼠一般狀況有明顯改善，空腹血糖、BUN、Scr以及24 h尿量均明顯下降，但體重并無(wú)明顯改善。高血糖作為引起糖尿病腎病的重要始動(dòng)因素，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中通過(guò)多種途徑發(fā)揮作用，黃芩苷的降血糖作用對(duì)于糖尿病腎病的治療有著重要作用。這與劉洋[16]等的研究結(jié)果一致。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，DN組大鼠炎性病變，糖原沉積以及腎纖維化程度嚴(yán)重，黃芩苷的處理對(duì)這些病理改變有明顯的改善作用。

TGF-β1作為業(yè)界公認(rèn)的具有強(qiáng)致纖維化作用的重要因子，在DN發(fā)生過(guò)程中可通過(guò)多種途徑(包括自分泌與旁分泌)促使腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞，加速腎小管間質(zhì)纖維化[17-18]，α-SMA作為細(xì)胞骨架的主要成分，其在纖維化的診斷與鑒別診斷中具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)α-SMA高表達(dá)于DN大鼠腎組織，可作為纖維化檢測(cè)指標(biāo)[19]。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃芩苷的處理可降低DN組大鼠TGF-β1與α-SMA的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明黃芩苷對(duì)DN大鼠腎功能及腎纖維化有明顯的改善作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立DN大鼠模型，證實(shí)了黃芩苷對(duì)DN大鼠的腎保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與黃芩苷通過(guò)低調(diào)節(jié)TGF-β1的水平從而降低α-SMA的蛋白表達(dá)相關(guān)，本研究為DN的治療提供了新的理論依據(jù)，同時(shí)也為黃芩苷的臨床應(yīng)用開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。