蔡 波,邢錢偉，吳 優(yōu)，管楊波，郭 新

0 引 言

腎癌是臨床常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤，在我國位居泌尿系腫瘤第二位[1-2]，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。腎癌起病隱匿，往往缺乏早期臨床表現[3]。盡管由于診斷技術的改善使偶發(fā)性腎癌的診斷率提高，依然有25%～30%的腎癌患者在確診時已出現遠處轉移[4]。而晚期轉移患者治療療效不夠理想，且嚴重影響著患者生活質量。目前腎癌的發(fā)病機制尚不完全清楚，可能與遺傳、肥胖、吸煙、高血壓等因素相關。因此深入探究腎癌發(fā)生進展的機制，尋找臨床更有效的生物標志物和治療靶標對腎癌的早期診斷和治療顯得尤為重要。

人源性RUNX相關轉錄因子1 (runt-related transcription factor 1，RUNX1)基因屬于RUNX轉錄調控家族成員之一，也稱為AML1，是造血功能的主調控基因[5-6]。它不僅是控制造血干細胞產生的基本轉錄因子，而且是調控造血干細胞分化產生骨髓細胞和淋巴細胞的關鍵轉錄因子。既往研究報道RUNX1在人急性淋巴瘤、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌及甲狀腺瘤等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用[7-10]，但RUNX1在人腎癌中的作用報道較少。因此本研究研究旨在研究RUNX1基因在腎癌中的表達及生物學功能。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數據 從GEO數據庫下載GSE66272腎癌芯片原始CEL文件，包括26份腎癌患者組織樣本和26份癌旁組織樣本。利用R軟件讀取原始文件后，使用Affy包中的RMA算法標準化數據后得到基因的表達矩陣，將預處理后得到的基因表達矩陣文件用R軟件讀入，利用R 軟件中l(wèi)imma 包對腎癌組織樣本和癌旁組織樣本基因進行差異表達分析，并且應用貝葉斯檢驗方法進行多重檢驗校正。差異基因鑒定標準：表達值倍數變化(fold change, FC)≥ 2 或< - 2，P<0.01。

1.2 組織標本與細胞 選取2015年1月至2019年6月南通大學附屬醫(yī)院泌尿外科20份腎癌患者組織標本，另取對應癌旁組織標本。其中男12例，女8例，42～84歲，平均年齡(58.30±7.26)歲，腎癌細胞株786-O及正?；I小管細胞HK2購自ATCC，采用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(購自Hyclone公司)，胎牛血清購中國四季青公司。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準(批準號：2019003)，患者均簽署知情同意書。

1.3 腎癌細胞株轉染實驗 在786-O細胞中敲低RUNX1基因。RUNX1 -target具體的小干擾RNA(siRNA)由吉凱基因(中國，上海)合成。RUNX1-靶特異性siRNA (si-RUNX1)的有義序列如下：siRNA1, 5′- CCAGGTTGCAAGATTTAAT-3′； siRNA2，5′-CUCCGUACATUCGGAUAGUAT-3′; siRNA3, 5′- GGCAGAAACTAGATGATCA-3′，對照 序列為5′- CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3′。對數生長期的786-O細胞接種于6孔板，待細胞密度融合為約60%時將細胞分為：siRNA1組(轉染si-RUNX1的siRNA1序列)、siRNA2組(轉染si-RUNX1的siRNA2序列)、siRNA3組(轉染si-RUNX1的siRNA3序列)、對照組(對照序列空載體siRNA轉染)。3個RUNX1小干擾RNA轉染786-O細胞，培養(yǎng)48 h后，提取RNA分別檢測siRNA的敲減效率。

1.4 實時定量PCR測定RUNX1含量 采用試劑盒提取腎癌組織及癌旁正常組織中的總RNA，用RT-PCR法測定各組RUNX1表達量，內參使用GAPDH進行標準化。

1.5 細胞克隆形成實驗 取各組轉染的786-O細胞，制備單細胞懸液，以800/孔接種于6孔板，細胞培養(yǎng)箱溫育靜置培養(yǎng)2周時間，待細胞克隆形成，終止培養(yǎng)，使用4%多聚甲醛固定克隆細胞，0.1%結晶紫對細胞群落進行染色， 統計細胞克隆形成數量。

1.6 MTT法檢測786-O細胞增殖活性 取各組轉染的786-O細胞，以3000/孔接種于96孔板培養(yǎng)，實驗結束前在每個孔中加入20 μL MTT在37 ℃孵育4 h棄培養(yǎng)液，各孔再加入DMSO 150 μL，室溫振蕩10 min。通過酶標儀測量490 nm處的吸光度。

1.7 Transwell 腫瘤細胞侵襲實驗 消化轉染后的對數生長期細胞，制備單細胞懸液，離心后用不含血清的培養(yǎng)液重懸細胞計數，然后在24孔板中加入600 μL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，取Transwell小室置于24孔板，在小室中加入200 μL細胞濃度為3×105/mL的細胞懸液，培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫進行染色。顯微鏡下采集圖像，計數遷移細胞，進行侵襲遷移細胞數量統計分析。

1.8 Western blot檢測蛋白水平變化 取各組轉染后的細胞，RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白，用BCA法檢測細胞蛋白濃度，取蛋白樣品與5×上樣緩沖液以4∶1 的比例混勻后，水浴鍋100 ℃反應5 min。統一上樣量，SDS-PAGE凝膠電泳90 min，Bio-Rad裝置濕轉蛋白于PVDF膜上，17 mA轉膜過夜，切取含目的條帶的PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。孵育RUNX1、E-cadherin、N-cadherin、MMP9、t-AKT、p-AKT、t-GSK3β及p-GSK3β一抗抗體(美國abcom公司，1∶1000)與GAPDH 內參抗體(美國abcom公司，1∶1000)4 ℃過夜，TBST洗膜5 min×3次，室溫孵育二抗(1∶10 000)2 h，再用TBST洗膜5 min×3次，ECL顯影。

2 結 果

2.1 GEO基因芯片分析及RUNX1對腎癌患者生存預后影響 篩選出971個差異表達基因，其中上調基因493個，下調基因 478個。熱圖及火山圖顯示，RUNX1在腎癌細胞樣本中明顯上調，提示RUNX1在腎癌中高表達，其可能與腎癌的發(fā)生發(fā)展相關。TCGA腫瘤數據庫顯示，RUNX1基因高表達患者總生存率及無病生存率較RUNX1基因低表達者明顯降低(P<0.01)。 見圖1。

a：熱圖；b:火山圖；c：總生存率；d：無病生存率

圖 1 GEO基因芯片分析及RUNX1對腎癌患者預后影響

Figure 1 GEO gene chip analysis and RUNX1 effect on the prognosis of patients with renal cancer

2.2RUNX1在腎癌及癌旁組織中的表達 GEPIA數據庫分析顯示，RUNX1在腎癌組織中的表達水平(1.95±0.09)顯著高于癌旁組織(0.62±0.05)，且II、III級腫瘤中RUNX1表達水平明顯比I級高(P<0.01)。RUNX1在腎癌細胞株(769P、A498、CAKI-1、786-O)較HK2表達升高(P<0.001)，且786-O細胞系表達量最高。因此后續(xù)實驗采用786-O細胞系。見圖2。

與HK2比較，*P<0.05

圖 2RUNX1在腎癌中的表達

Figure 2 RUNX1 is overexpressed in renal cancer

2.3RUNX1質粒轉染786-O細胞后siRNA敲減效率比較 siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組的siRNA敲減效率顯著低于對照組(P<0.01)。其中siRNA1的敲減效果最佳，后續(xù)實驗采用siRNA1檢測。見圖3。

與對照組比較，*P<0.05

圖 3RUNX1小干擾RNA轉染786-O細胞后敲減效果

Figure 3 The knockdown effect of RUNX1 small interfering RNA in 786-O cells

2.4RUNX1對 786-O細胞增殖活性影響 MTT檢測結果顯示，siRNA1組顯著抑制786-O腎癌細胞的增殖(P<0.01)，見圖4。克隆形成結果同樣顯示，與對照組比較，siRNA1組786-O腎癌細胞的集落形成效率顯著降低(P<0.003)。

與對照組比較，*P<0.05

圖 4RUNX1基因敲低對786-O細胞活力的影響

Figure 4 RUNX1 gene knockdown reduces viability of 786-O cells

2.5 轉染后腎癌細胞的體外遷移能力transwell實驗結果 siRNA1組的細胞過膜數量[(98.67±3.53)個/視野]明顯低于對照組[(143.3±8.74)個/視野]，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5。Western blot 結果顯示，siRNA1組RUNX1、N-cadherin、MMP9、p-AKT及p-GSK3β較對照組明顯下降，E-cadherin明顯增加。說明RUNX1可能通過AKT通路促進腎癌細胞的遷移。見圖6。

a:對照組； b:siRNA1組

圖 5RUNX1敲減后AKT通路對786-O腎癌細胞遷移能力的影響(結晶紫染色 ×100)

Figure 5 RUNX1 knockdown inhibits migration of 786-O cells (crystal violet staining ×100)

圖 6RUNX1敲減后AKT通路對786-O腎癌細胞遷移能力的影響

Figure 6 RUNX1 knockdown inhibits migration of 786-O cells

3 討 論

既往研究顯示RUNX1作為RUNX轉錄因子家族中的一員，在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。Keita及Eldholm等[11-12]關于卵巢癌的研究表明RUNX1在卵巢癌組織中高表達，促進卵巢癌細胞增殖，遷移和侵襲，發(fā)揮致癌基因的作用。 在食管癌的研究中發(fā)現RUNX1作為LincRNAuc002yug.2的下游調控基因促進食管癌細胞細胞增殖和腫瘤生長[13]。在乳腺癌中RUNX1既可以發(fā)揮致癌作用，也可以發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[14]。RUNX1缺失促進雌激素受體陽性乳腺癌上皮細胞的生長和干細胞性，但在雌激素受體陰性的乳腺癌上皮細胞系中RUNX1缺失發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[15-16]。RUNX1在胃癌中也扮演著致癌抑癌的雙重角色[17-19]。RUNX1相關生物功能機制研究顯示，其可能通過EMT通路途徑從而影響腫瘤細胞的侵襲遷移[13-15]。然而RUNX1在腎癌的發(fā)生發(fā)展中的作用機制目前尚不清楚。

本研究利用GEO數據庫芯片發(fā)現RUNX1在腎癌組織中表達量明顯高于癌旁正常組織，進一步分析TCGA 數據庫分析顯示，高RUNX1表達患者預后較低RUNX1表達患者預后差，GEPIA數據庫基因芯片數據進一步驗證了以上結果。收集本院腎癌及癌旁組織標本，并提取標本的RUNX1表達量進行分析。研究結果發(fā)現RUNX1在腎癌組織中表達量明顯高于癌旁組織(P<0.05)，提示RUNX1的表達可能與腎癌的發(fā)生發(fā)展相關。因此，RUNX1在腎癌中表達上調，可能作為原癌基因參與腎癌的腫瘤形成及進展。

為進一步確定RUNX1是否作為功能性的原癌基因參與腎癌進展，本研究檢測RUNX1對腎癌細胞增殖和遷移的影響。成功使用RUNX1 siRNA轉染786-O細胞株，并進一步對轉染細胞進行了MTT、克隆形成實驗及transwell實驗。MTT實驗結果顯示RUNX1 siRNA轉染顯著抑制腎癌細胞的增殖，克隆形成實驗同樣表明，與對照組相比，RUNX1 siRNA轉染中的腎癌細胞786-O的集落形成效率顯著降低。Transwell實驗結果顯示與對照組細胞過膜數量相比，siRNA1組的細胞過膜數量減少，差異有統計學意義。蛋白免疫印跡試驗結果顯示si-RUNX1組促進腫瘤細胞遷移相關的蛋白N-cadherin明顯下降，E-cadherin明顯增加,蛋白水平驗證了RUNX1的表達水平確與腎癌細胞的遷移能力相關，RUNX1可能通過EMT途徑促進腎癌細胞的侵襲遷移，進一步通路蛋白結果顯示RUNX1基因下調后AKT通路關鍵功能蛋白p-AKT及p-GSK3β明顯下調，說明RUNX1可能通過AKT通路促進腎癌細胞的侵襲遷移。

綜上所述，本研究結果顯示腎癌組織中RUNX1的表達水平較癌旁正常組織高表達，并且敲減RUNX1表達可以抑制腎癌細胞的增殖轉移，提示RUNX1對腎癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用，并且與腎癌的增殖轉移密切相關，其可作為腎癌的潛在臨床診治靶點及預后標志物。