夏 凱，錢成鞏，梁新樂

(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018)

醋酸菌(acetic acid bacteria)是一類嚴格好氧的革蘭氏陰性細菌，因其強大的氧化乙醇產(chǎn)生乙酸能力而被廣泛用于工業(yè)食醋生產(chǎn)[1]。醋酸菌廣泛分布于自然環(huán)境、花、水果、醋以及酒等發(fā)酵食品中，在目前已知的19個屬中，醋桿菌(Acetobacter)和葡萄糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter)主要用于食醋發(fā)酵[2]。在食醋生產(chǎn)過程中，菌種的耐酸性能是制約高酸度醋生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。過去幾十年的研究逐步揭開了醋酸菌的高耐酸機制，主要體現(xiàn)在一些和耐酸直接相關(guān)的特殊蛋白的發(fā)現(xiàn)(如乙醇脫氫酶、ABC轉(zhuǎn)運子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等)以及脂肪酸代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成等生物過程[3-5]。但是潛在的調(diào)控通路仍知之甚少。

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)在目前已知調(diào)控通路中研究相對透徹，QS在微生物細胞響應(yīng)環(huán)境壓力中發(fā)揮重要作用，與細菌種群密度相關(guān)[6]。微生物可通過感知環(huán)境中信號分子的濃度來實現(xiàn)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以實現(xiàn)細胞在群體水平上的壓力響應(yīng)。根據(jù)識別和調(diào)控方式的不同，已知信號分子主要分為AHLs類、AI-2、寡肽類以及DSF和PQS類[7]。目前，銅綠假單胞菌、大腸桿菌、西瓦氏菌、以及哈氏弧菌中QS的研究相對成熟，研究發(fā)現(xiàn)QS在生物膜的形成、毒力因子合成和釋放以及壓力響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[8]。然而，工業(yè)微生物中QS的研究相對薄弱，主要在乳酸菌中[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)QS調(diào)節(jié)系統(tǒng)與乳酸菌生長過程中細菌素的分泌以及抗菌肽的產(chǎn)生密切相關(guān)，同時也在乳酸菌生長過程中特別是為應(yīng)對外界不利環(huán)境所發(fā)生的細胞形態(tài)變化、黏附能力的改變方面扮演重要角色[11]。

目前，醋酸菌中有關(guān)QS的報道主要在葡萄糖酸醋桿菌中，研究發(fā)現(xiàn)QS與細胞產(chǎn)酸和纖維素的合成密切相關(guān),且主要起作用的是AHLs類信號分子[12-13]。除此之外，醋酸菌其他菌種如醋桿菌中的QS研究未見報道。在傳統(tǒng)食醋發(fā)酵生產(chǎn)過程中，微生物菌群復(fù)雜[14-15]，預(yù)示著QS在細胞響應(yīng)環(huán)境壓力以及與其他微生物相互作用過程中扮演重要角色。

本研究中，筆者以分離于浙江傳統(tǒng)玫瑰醋中的一株高耐酸巴氏醋桿菌(A.pasteurianus)Ab3以及國內(nèi)高酸度食醋生產(chǎn)用菌株巴氏醋桿菌CICC 20001(原滬釀1.01,A.pasteurianusCICC 20001)為研究對象[3,16]，采用指示菌生物檢測法和儀器分析方法探究了巴氏醋桿菌中的QS特性。在此基礎(chǔ)上，進一步結(jié)合生物信息學(xué)分析，對醋桿菌中的QS分布和遺傳進化規(guī)律進行揭示，以期為深入研究巴氏醋桿菌的壓力響應(yīng)機制以及其他醋桿菌QS系統(tǒng)的調(diào)控作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基和試劑

巴氏醋桿菌Ab3(分離于玫瑰醋)和CICC 20001(浙江五味和食品有限公司提供)均在YPD 培養(yǎng)基(10 g/L酵母浸出粉，5 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖，體積分數(shù)2%乙醇)中培養(yǎng)。

紫色紫桿菌CV026(ChromobacteriumviolaceumCV026)和根癌農(nóng)桿菌(AgrobacteriumtumfaciensA136)(保藏于筆者所在實驗室)均在LB培養(yǎng)基(5 g/L酵母浸出粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，pH 7.0)中培養(yǎng)，其中紫色紫桿菌和根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)體系中分別加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素、50 μg/mL的壯觀霉素和5 μg/mL的四環(huán)素。

哈氏弧菌(Vibrioharveyi) BB170和BB152(保藏于筆者所在實驗室)在LM培養(yǎng)基(5 g/L酵母浸出粉，10 g/L蛋白胨，20 g/L NaCl)或AB培養(yǎng)基(0.3 mol/L NaCl；0.05 mol/L MgSO4；1 mol/L磷酸鉀緩沖液，體積分數(shù)1%；0.1 mol/L L-精氨酸溶液，體積分數(shù)1%；50%甘油溶液，體積分數(shù)2%；10%酪氨酸溶液，pH 7.5，體積分數(shù)2%)中培養(yǎng)。以上所述菌株培養(yǎng)條件均為30 ℃、180 r/min。固體培養(yǎng)基的配制為液體培養(yǎng)基加入20 g/L的瓊脂。

AHLs(C6-HSL和C12-HSL)，Sigma 公司；抗生素、X-gal、IPTG等，上海生工生物股份有限公司；酵母浸出粉和蛋白胨，OXOID公司；其余化學(xué)試劑均購于西隴化工股份有限公司。

1.2 基因組數(shù)據(jù)

本研究中所用19種醋桿菌共89個基因組序列下載于NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.3 巴氏醋桿菌群體感應(yīng)信號分子檢測

1.3.1 信號分子粗提液制備

信號分子的濃縮提取過程參照文獻[12]的研究。-80 ℃甘油管保存的巴氏醋桿菌劃線于準(zhǔn)備好的YPD平板，待單菌落形成后，挑取單菌落至30 mL YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期(OD約為0.6) 以1%的接種比例轉(zhuǎn)接于新鮮的YPD培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。每隔12 h取樣進行信號分子提取實驗。提取過程如下：醋酸菌發(fā)酵液離心后收集上清液(8 000 r/min，5 min)，加入等量的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，最后用HPLC級甲醇溶出，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 牛津杯擴散法檢測AHLs

-80 ℃甘油管保存的紫色紫桿菌CV026劃線于準(zhǔn)備好的LB抗性平板，待單菌落形成后挑取單菌落至5 mL的LB液體抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對數(shù)期后(OD為0.5～0.8)以1%的接種比例轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。將活化好的菌種以1%的比例和新鮮的LB固體培養(yǎng)基混合均勻后倒平板，平板凝固后，放上牛津杯，每個牛津杯中加入150 μL的信號分子粗提液或陽性對照(C6-HSL，質(zhì)量濃度為1 μg/mL，溶于甲醇)或陰性對照(甲醇)。之后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 T型劃線檢測AHLs

準(zhǔn)備好新鮮的LB培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基混合固體平板或CaCO3平板(加入20 g/L CaCO3)。將活化好的紫色紫桿菌CV026或根癌農(nóng)桿菌以及目標(biāo)菌株醋酸菌分別于平板的特定位置進行T型劃線，而后靜置培養(yǎng)觀察結(jié)果。以根癌農(nóng)桿菌為指示菌時，在LB平板表面涂布50 μL質(zhì)量濃度為20 μg/mL的X-gal。

1.3.4 AI-2信號分子檢測

Ⅱ類信號分子的檢測采用生物發(fā)光法[17]。-80 ℃ 甘油管保存的哈氏弧菌劃線于準(zhǔn)備好的LM平板,待形成單菌落后，挑取單菌落至30 mL LM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，然后以1%比例轉(zhuǎn)接至AB培養(yǎng)基，其中BB152過夜培養(yǎng)后收集上清液作為陽性對照。過夜培養(yǎng)后的指示菌BB170采用新鮮AB培養(yǎng)基以1∶ 5 000的稀釋比例稀釋，檢測采用不透光96孔板(每孔200 μL，包括180 μL的哈氏弧菌稀釋液以及20 μL的待檢測樣品或陽性對照或陰性對照(培養(yǎng)基)?？装逯糜谖⑸锔咄亢Y選系統(tǒng)(VICTOR X3，Perkin Elmer)中進行熒光測定(激發(fā)波長485 nm；發(fā)射波長535 nm)，每隔30 min測定1次，連續(xù)測8 h。所有實驗均進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.5 儀器分析法檢測信號分子AHLs和AI-2

發(fā)酵液中可能存在的AHLs和AI-2采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)進行檢測，檢測參照文獻[18-19]方法進行，檢測儀器為安捷倫液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(1200-6210)，柱子采用C18反向分析柱(150 mm×2 mm×5 μm，Phenomenex,UK)。液相洗脫程序：等度洗脫10 min(甲醇與水的體積比40∶ 60)；然后梯度洗脫(甲醇比例由40%升至90%，流速0.2 mL/min)；最后等度洗脫20 min。質(zhì)譜條件：進樣口溫度300 ℃，電壓 5 kV，m/z掃描范圍 50～600。

1.3.6 醋桿菌中QS生物信息學(xué)分析

基于AHLs類信號分子的QS系統(tǒng)：包括LuxI類信號分子合成酶以及LuxR類信號分子受體蛋白。LuxI和LuxR在醋桿菌中的同源序列分布分析步驟：選取經(jīng)研究證實的LuxI和LuxR的保守結(jié)構(gòu)域，如LuxI為IPR001690和IPR018311，LuxR為IPR016032、IPR005143、IPR000792以及IPR011911等。利用BLAST序列比對軟件(選擇模式為blastp模式，基因組數(shù)據(jù)包括19種醋桿菌共89個基因組序列，相似度選擇一般，E值0.1)進行比對搜索分析[20]。選擇經(jīng)過比對確認的序列(序列相似度>30%)進行進一步的保守結(jié)構(gòu)域分析、序列比對分析以及遺傳進化分析。AI-2合成體系的分析參照上述方法，分析對象包括AI-2合成途徑中關(guān)鍵酶LuxS和Pfs的保守結(jié)構(gòu)域PRK02260、PRK05584，以及受體蛋白LuxP和LsrB的保守結(jié)構(gòu)域cd06303、COG0583和PRK15408。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析采用在線數(shù)據(jù)庫CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?)。

進化樹的構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件，構(gòu)建時樹的模型選擇鄰近法(NJ)，參數(shù)選擇p-distance，Gap不保留，bootstrap為1 000。序列比對分析：序列比對分析采用ClustalW?；蛟诨蚪M上的線性結(jié)構(gòu)分析由在線軟件完成(http://archaea.u-psud.fr/SyntTax/)。本研究所有數(shù)據(jù)處理采用Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 巴氏醋桿菌Ab3和CICC 2001中AHLs測定

通過平板牛津杯擴散法和T型平板劃線法對巴氏醋桿菌Ab3不同生長時期的發(fā)酵液進行測定，結(jié)果如圖1所示(由于不同生長時期發(fā)酵上清液的測定結(jié)果類似，因此牛津杯擴散法只展現(xiàn)了24 h發(fā)酵上清液的測定結(jié)果；T型劃線結(jié)果拍攝于菌生長48 h后)。突變后的紫色紫桿菌CV026自身不能合成信號分子，但能識別并感應(yīng)環(huán)境中的信號分子，對?；鶄?cè)鏈長度為C4-C8的AHL類信號分子具有不同的敏感性，因此可通過觀察顏色變化判斷目標(biāo)菌株是否產(chǎn)信號分子[20]。由圖1可見：與對照直接加入C6-HSL能使CV026變紫相比，巴氏醋桿菌Ab3發(fā)酵上清液中不存在使CV026變色的信號分子(圖1(a))?？紤]到Ab3產(chǎn)生的乙酸可能會對指示菌產(chǎn)生影響，同時為了排除取樣時間點對結(jié)果造成的誤差，筆者進一步在CaCO3平板上采用T型劃線法進行連續(xù)測定。CaCO3可中和Ab3菌株產(chǎn)生的乙酸，T型劃線結(jié)果顯示，陽性對照即信號分子標(biāo)準(zhǔn)品可使紫色紫桿菌合成紫色素，而Ab3菌株不能使CV026菌落變紫；同樣，陰性對照C12-HSL標(biāo)準(zhǔn)品也不能使CV026菌落變色(圖1(b))。類似的結(jié)果也在不加CaCO3的平板上得到(圖1(c))。

筆者同時對另一株巴氏醋桿菌CICC 20001的AHLs合成情況進行了測定，獲得了和菌株Ab3測定中類似的結(jié)果，平板擴散法和T型劃線法均未證明巴氏醋桿菌CICC 20001能合成酰基側(cè)鏈長度在C6以下的AHLs(圖1(d～f))?？紤]到巴氏醋桿菌可能合成?；鶄?cè)鏈長度在6個碳原子以上的AHLs，筆者進一步選取了檢測范圍更廣的根癌農(nóng)桿菌作為指示菌進行檢測(檢測范圍為?；鶄?cè)鏈長度為C6～C14的信號分子)[19,21]。突變后的根癌農(nóng)桿菌自身不能合成AHLs,但仍保留了信號分子識別基因且同時導(dǎo)入LacZ編碼基因，該基因的啟動子來源于根癌農(nóng)桿菌中AHLs的合成酶基因traI。因此，當(dāng)環(huán)境中存在AHLs時，TraR蛋白可識別并同時調(diào)控LacZ的表達，通過水解底物X-gal產(chǎn)生藍色色素。

T型劃線結(jié)果顯示無論是Ab3還是菌株20001均不能使根癌農(nóng)桿菌變藍，與對照采用C12-HSL使指示菌產(chǎn)生藍色色素形成鮮明對比(圖1(g～i))。這表明巴氏醋桿菌Ab3和CICC 20001不能合成并分泌碳鏈長度為6～14的AHLs類信號分子。AHLs類信號分子目前只在葡萄糖酸醋桿菌中被發(fā)現(xiàn)，?；鶄?cè)鏈長度在C2～C14不等[12-13,19]。而巴氏醋桿菌中并未有過報道，巴氏醋桿菌是否采用其他種類信號分子進行交流，需要進一步研究。

C6—C6-HSL；C12—C12-HSL；Ab3—巴氏醋桿菌Ab3；20001—巴氏醋桿菌 CICC 20001圖1 巴氏醋桿菌中AHLs檢測Fig.1 AHLs detection of A.pasteurianus

2.2 巴氏醋桿菌Ab3和CICC 2001中AI-2測定

Ⅱ類自誘導(dǎo)物(AI-2)的檢測采用生物發(fā)光法。AI-2首先在哈氏弧菌中被發(fā)現(xiàn)，參與生物發(fā)光過程的調(diào)控，因此借助該菌能響應(yīng)AI-2信號分子來對目標(biāo)樣品進行檢測是一種快速簡便的方法[17]。筆者使用的哈氏弧菌BB170經(jīng)過基因型改造后不能對AI-1類信號分子進行響應(yīng)，只能感應(yīng)AI-2，雖然其本身也能產(chǎn)生AI-2，但是需要群體密度到達一定時才會以發(fā)光的形式體現(xiàn)。因此，當(dāng)外源AI-2不存在時，BB170通過感應(yīng)自身產(chǎn)生的AI-2信號分子而發(fā)光需要在大約3～5 h后，而當(dāng)外源信號分子存在時則可在短時間內(nèi)產(chǎn)生熒光[17]。對巴氏醋桿菌中的AI-2檢測結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)加入陽性對照即野生菌哈氏弧菌BB152培養(yǎng)液(培養(yǎng)12 h的上清液)，熒光值在0.5 h后開始上升(圖2(a))。而加入不同培養(yǎng)時間的巴氏醋桿菌Ab3培養(yǎng)液上清時，未發(fā)現(xiàn)熒光值有所上升，相反在開始的2.5 h內(nèi)熒光值處于下降趨勢，熒光下降是由于BB170培養(yǎng)液稀釋后因環(huán)境中不含有外源AI-2而自身所帶熒光逐步猝滅所導(dǎo)致；2.5 h后所有的測試組熒光值開始回升，4 h后達到陽性對照的水平。同樣的趨勢也發(fā)現(xiàn)于陰性對照即加入純培養(yǎng)基的試驗組中，預(yù)示著巴氏醋桿菌Ab3不能合成能使哈氏弧菌產(chǎn)生熒光的AI-2信號分子。類似的結(jié)果也在巴氏醋桿菌20001中出現(xiàn)，加入不同培養(yǎng)時期的上清液，和陽性對照相比，實驗組的熒光值在前2.5 h內(nèi)一直處于下降趨勢，且在2.5 h時達到最低值，之后開始回升(圖2(b))。兩組中熒光值的回升是由于BB170自身開始產(chǎn)生信號分子誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生熒光。綜合可知，通過生物發(fā)光檢測法，本研究未能發(fā)現(xiàn)巴氏醋桿菌Ab3和CICC 20001合成AI-2信號分子。

圖2 生物發(fā)光法檢測巴氏醋桿菌中AI-2類信號分子Fig.2 Fluorescence-based detection of AI-2 in A.pasteurianus Ab3 (a) and CICC 20001 (b)

2.3 巴氏醋桿菌Ab3和CICC 20001不能合成AHLs和AI-2

考慮到指示菌檢測可能帶來的誤差，借助LC-MS分析方法，筆者進一步對巴氏醋桿菌中可能存在的信號分子進行分析。依據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)巴氏醋桿菌Ab3和CICC 20001發(fā)酵液中存在AHLs和AI-2相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。相關(guān)結(jié)果與上文所述采用生物指示菌檢測的結(jié)果相互對應(yīng)，這表明AHLs和AI-2合成體系在巴氏醋桿菌中Ab3和CICC 20001并非普遍存在。此次研究雖仍不能排除它們可能利用其他一些目前未知的小分子物質(zhì)作為信號分子，但至少AHLs和AI-2在巴氏醋桿菌Ab3和CICC 20001中的丟失似乎是一種趨勢。

圖3 醋桿菌中LuxI和LuxR分布分析Fig.3 Distribution of LuxI and LuxR in Acetoabcter

2.4 醋桿菌中LuxI和LuxR的分布存在種間差異性

鑒于未能在巴氏醋桿菌Ab3和CICC 20001 中檢測到AHLs和AI-2信號分子，筆者進一步從基因組水平分析其可能的原因，并將研究對象擴大至整個醋桿菌屬。AHLs類信號分子主要由合成酶LuxI催化合成，由LuxR受體蛋白負責(zé)識別并對目標(biāo)基因進行調(diào)控[22]。LuxI和LuxR保守結(jié)構(gòu)域同源序列分析顯示LuxI和LuxR在醋桿菌中的分布主要以3種形式存在：完整的LuxI+LuxR結(jié)構(gòu)，LuxI orphan結(jié)構(gòu)(即基因組中只存在信號分子合成酶序列)以及LuxR orphan(基因組中只存在信號分子受體序列)(圖3)。其中具有完整LuxI+LuxR結(jié)構(gòu)較多的菌種分別是A.orleanensis、A.orientalis、A.indonesiensis、A.cibinongensis、A.persici、A.cerevisiae、A.senegalensis以及A.malorum(平均數(shù)量≥1)。A.orientalis、A.persici、A.cerevisiae以及A.tropicalis同時含有較多的LuxI orphan結(jié)構(gòu)(平均數(shù)量為0.6～1，圖3(b))。而A.syzygii和A.orleanensis則擁有更多的LuxR orphan 結(jié)構(gòu)。A.aceti、A.papaya以及A.pomorum等菌種中不具有任何LuxI和LuxR相關(guān)結(jié)構(gòu)。值得注意的是巴氏醋桿菌基因組中不含有完整LuxI+LuxR結(jié)構(gòu)，且只有少數(shù)菌株保留LuxI或LuxR結(jié)構(gòu)。本文研究對象基因組中同樣不存在任何和AHLs合成相關(guān)的序列，這與上文所述未能在所研究巴氏醋桿菌中檢測到AHLs的結(jié)果一致。因此，巴氏醋桿菌Ab3和CICC 20001不能合成AHLs的原因在于其編碼體系的丟失。LuxI和LuxR在醋桿菌不同種中的分布存在差異，而這可能與菌種生存環(huán)境密切相關(guān)。

2.5 醋桿菌中LuxI和LuxR的分布與生存環(huán)境相關(guān)

醋酸菌廣泛分布于自然環(huán)境、植物以及發(fā)酵食品中[1]，而群體感應(yīng)主要發(fā)揮壓力響應(yīng)調(diào)控的作用[6]，因此，生存環(huán)境的不同勢必導(dǎo)致群體感應(yīng)系統(tǒng)在醋桿菌中的分布差異。不同分離來源醋桿菌基因組中LuxI和LuxR同源序列平均數(shù)量如表1所示。由表1可知，分離于植物、水果、以及自然環(huán)境中的菌種具有更多的LuxI orphan和LuxI+LuxR結(jié)構(gòu)(平均數(shù)量分別為0.44和0.69)，遠高于那些自食醋等發(fā)酵食品中分離菌種的平均數(shù)量(0.22和0.27)。但這些菌種含有較少的LuxR orphan結(jié)構(gòu)(0.06)。分離于果蠅腸道等宿主的菌種中擁有較多完整的LuxI+LuxR結(jié)構(gòu)(0.50)。因此，醋桿菌中LuxI和LuxR的分布與菌種生長環(huán)境密切相關(guān)。

表1 不同分離來源醋桿菌基因組中LuxI和LuxR同源序列平均數(shù)量

Table 1 Isolation-dependent average number of the homologs of LuxI and LuxR in Acetoabcter

相比于完整的LuxI+LuxR結(jié)構(gòu)，LuxI orphan和LuxR orphan的存在則表明相對應(yīng)的配對結(jié)構(gòu)在遺傳進化過程中存在丟失，同時也表明這種結(jié)構(gòu)可能來自于水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。由于醋桿菌基因組不穩(wěn)定且可塑性強，同時在基因組上存在眾多噬菌體區(qū)域和插入序列，因此這種可能性在醋桿菌中是存在的[23-24]。其實，之前已有研究表明，細菌中LuxI和LuxR的分布除兩者同時存在以外，單獨存在也是一種普遍現(xiàn)象，且與生存環(huán)境和遺傳進化相關(guān)[20,25]。相比擁有LuxI和LuxR元件的菌種可自發(fā)合成和感受AHLs，LuxI orphan 則表明該菌株只能合成AHLs，而只含有LuxR orphan結(jié)構(gòu)的菌株自身不能合成AHLs，但能感受環(huán)境中的AHLs，實現(xiàn)群體水平的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明，相比于完整結(jié)構(gòu)中的LuxR，單獨存在的LuxR具有更寬泛的信號分子識別能力和轉(zhuǎn)錄調(diào)控對象[26-27]。因此，巴氏醋桿菌少數(shù)菌株中保留的LuxR orphan仍可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用，而其他巴氏醋桿菌中LuxI和LuxR結(jié)構(gòu)的完全丟失則表明該結(jié)構(gòu)未能適應(yīng)遺傳進化過程中壓力響應(yīng)的變化。

2.6 醋桿菌中LuxI和LuxR在進化過程中存在丟失和水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象

LuxI和LuxR同源序列分析表明，AHLs合成酶LuxI和受體蛋白LuxR在醋桿菌遺傳進化過程中存在丟失和基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(圖4)，具體表現(xiàn)為以下幾個方面：①LuxI和LuxR在種水平并非高度保守，存在不同菌種中的LuxI和LuxR相互聚集在一起的現(xiàn)象，如A.persici、A.malorum和A.tropicalis。②完整結(jié)構(gòu)中的LuxI和LuxI orphan，LuxR和LuxR orphan并未分別歸類到一起，而是相互摻雜，如A.pasteurianus中的LuxI orphan和A.tropicalis中的LuxI(圖4(a))，A.malorum中的LuxR orphan 和A.tropicalis中的LuxR(圖4(b))。③基因組中LuxI和LuxR上下游基因結(jié)構(gòu)分析表明，完整LuxI+LuxR上下游基因結(jié)構(gòu)在同種或不同種中皆高度保守(圖5)，表明其重要的調(diào)控作用。④LuxR orphan上下游基因結(jié)構(gòu)在不同菌種中不保守，且在其附近發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子和噬菌體區(qū)域(圖6)，表明其配對LuxI的丟失受這些結(jié)構(gòu)影響。

2.7 醋桿菌中LuxR關(guān)鍵活性位點存在突變現(xiàn)象

群體感應(yīng)體系中的LuxR含有兩個保守結(jié)構(gòu)域：一個是N端信號結(jié)合區(qū)域ABD；另一個是C端DNA結(jié)合域HTH區(qū)(helix-turn-helix)。LuxR關(guān)鍵活性位點保守性分析如表3所示。LuxR存在著9個關(guān)鍵氨基酸位置，這些位點的氨基酸高度保守，影響著LuxR的活性(氨基酸位點以根癌農(nóng)桿菌TraR為準(zhǔn))[20]。9個位點分別是信號分子結(jié)合域中57位的色氨酸(W)、61位的酪氨酸(Y)、70位的天冬氨酸(D)、71位的脯氨酸(P)、85位的色氨酸(W)、113位的甘氨酸(G)以及HTH結(jié)構(gòu)域中178位的谷氨酸(E)、182位的亮氨酸(L)以及188位的甘氨酸(G)。醋桿菌中LuxR關(guān)鍵氨基酸位點分析顯示這些關(guān)鍵位點在不同菌種中皆存在不同程度的突變，其中主要突變形式包括61位的酪氨酸和70位的天冬氨酸，分別突變?yōu)楫惲涟彼?I)和甘氨酸(G)(表3)、85位的色氨酸突變?yōu)槔野彼?Y)、113位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?A)、178位的谷氨酸突變?yōu)楣劝滨０?Q)以及188位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸(S)。研究表明61位的酪氨酸在信號分子的識別和結(jié)合過程中發(fā)揮直接作用，因此該位點的突變也表明相應(yīng)LuxR蛋白可能失去信號分子識別能力[28]。而其他位點的突變是否會影響醋桿菌識別AHLs需要今后進一步分析?？傊?，醋桿菌中信號分子識別蛋白LuxR關(guān)鍵活性位點發(fā)生不同程度的突變，這間接體現(xiàn)了LuxR不同的進化歷程和速度，而部分可能將最終導(dǎo)致蛋白功能的改變或相關(guān)編碼基因的丟失。

相同顏色圓圈代表同一個種；星號代表該序列為LuxI orphan 或LuxR orphan圖4 醋桿菌LuxI和LuxR聚類分析Fig.4 Cluster analysis of LuxI (a) and LuxR (b) in Acetobacter

相同顏色箭頭代表相同編碼基因，箭頭方向代表基因在染色體上的方向；左側(cè)的菌種簡寫信息參照表2圖5 醋桿菌LuxI+LuxR上下游基因結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Chromosomal synteny analysis of LuxI+LuxR in Acetobacter

圖6 醋桿菌LuxR orphan上下游基因結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Chromosomal synteny analysis of LuxR orphan in Acetobacter

表2 基因線性結(jié)構(gòu)分析菌種簡寫信息Table 2 Abbreviation information of the species used in chromosomal synteny analysis

表3 LuxR關(guān)鍵活性位點保守性分析Table 3 Conservation analysis of the key loci in LuxR

2.8 醋桿菌中不存在AI-2合成體系

AI-2是除AHLs以外第2種微生物常用于交流的信號分子。AI-2主要是以SAM(S-腺苷蛋氨酸)為底物經(jīng)過三步反應(yīng)合成而來(SAM到SAH(S-腺苷高半胱氨酸),然后在Pfs(S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶)催化下轉(zhuǎn)為SRH(S-核糖高半胱氨酸)，SRH在LuxS的催化下生成DPD(4,5-二羥基-2,3-戊二酮)，DPD可隨時變化結(jié)構(gòu)成為AI-2)[29]。受體方面則主要為LuxP和LsrB(圖7)[30-31]。本研究未在醋桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)Pfs、LuxS、LuxP以及LsrB的同源序列，這與研究前期利用哈氏弧菌生物發(fā)光檢測法未檢測到巴氏醋桿菌能合成AI-2信號分子相對應(yīng)，表明巴氏醋桿菌等大部分醋桿菌不存在AI-2合成體系。

圖7 AI-2型群體感應(yīng)系統(tǒng)Fig.7 The AI-2-based quorum sensing system

3 結(jié)論與展望

巴氏醋桿菌Ab3和CICC 20001不能合成AHLs和AI-2類信號分子，與相關(guān)QS編碼基因在遺傳進化過程中的丟失相關(guān)。相比于巴氏醋桿菌，其他醋桿菌中存在AHLs編碼體系但同樣不存AI-2合成體系。醋桿菌中AHLs的分布與生存環(huán)境和基因組穩(wěn)定性有關(guān)，綜合可知，生存環(huán)境引起的菌種生長方式的改變是醋桿菌中QS差異分布的主要原因。AHLs和AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)未能在巴氏醋桿菌響應(yīng)酸脅迫過程中發(fā)揮調(diào)控作用，表明存在其他重要的信號通路調(diào)控體系，這有待今后進一步深入分析。同時，其他醋桿菌中廣泛存在的AHLs介導(dǎo)的QS是否在細胞響應(yīng)環(huán)境壓力中發(fā)揮作用以及發(fā)揮何作用值得深入探索，而本文所獲結(jié)果為研究其他醋桿菌中的QS提供了基礎(chǔ)。