楊亞茹，李婷婷，勵(lì)建榮

(1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600)

群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)作為一種細(xì)菌之間的交流機(jī)制，能夠通過密度依賴的方式對(duì)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信息交流進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過分泌一些小分子自誘導(dǎo)物(autoinducer，AI)相互感知[1]。微生物共培養(yǎng)(co-culture)因其更符合細(xì)菌生長(zhǎng)的自然環(huán)境被認(rèn)為是探究細(xì)菌間相互作用的重要形式，研究發(fā)現(xiàn)與芽孢桿菌共培養(yǎng)，既能促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致嗜水氣單胞菌毒力因子相關(guān)基因的表達(dá)受抑制[2-3]。在共存體系中，細(xì)菌間相互作用相對(duì)復(fù)雜，或互利共生、或相互競(jìng)爭(zhēng)。

殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)最早發(fā)現(xiàn)于1894年，由Emmerich和Weibel從溪鱒中分離所得，革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，可感染虹鱒、大西洋鮭等鮭科魚類，引發(fā)癤瘡病，且寄主范圍廣泛，同時(shí)也是導(dǎo)致鱸魚、大菱鲆及大黃魚等水產(chǎn)品致病、致腐的潛在因素[4-7]。研究表明，殺鮭氣單胞菌自身可分泌C4-HSL、C6-HSL、C10-HSL等不同?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactone，AHLs)類信號(hào)分子，其毒力因子的表達(dá)與細(xì)胞密度緊密相關(guān)，如α-溶血素、?；D(zhuǎn)移酶、蛋白酶等均受QS系統(tǒng)的調(diào)控[8-9]。但目前針對(duì)殺鮭氣單胞菌在水產(chǎn)品致腐的潛在危害及群體感應(yīng)調(diào)控方面更深一步的研究跟探討相對(duì)較少，更多集中于亞種分離、藥敏測(cè)試、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和組織病理學(xué)等方面。

本研究中，筆者從腐敗海鱸魚中分離了1株殺鮭氣單胞菌，并對(duì)其自身生長(zhǎng)、產(chǎn)群體感應(yīng)信號(hào)分子的能力以及與水產(chǎn)品常見特定腐敗菌的共培養(yǎng)情況進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步了解殺鮭氣單胞菌群體感應(yīng)調(diào)控機(jī)制及共培養(yǎng)分析提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鮮活海鱸魚購(gòu)于遼寧省錦州市林西水產(chǎn)市場(chǎng)，平均質(zhì)量(1.50±0.1)kg。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)條件

目標(biāo)菌株：殺鮭氣單胞菌CS12(A.salmonicida，CS12)，腐敗海鱸魚中分離所得；供試菌株為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens，PF03)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，AH11)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria，AS7)、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens，SP01)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens，SM01)、蜂房哈夫尼亞菌(Hafniaalvei，HA14)；報(bào)告菌株為紫色桿菌CV026(Chromobacteriumviolaceum,CV026)。上述菌株均保藏于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。菌株按體積比1∶ 100的比例接種于LB肉湯中，28 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，CV026活化時(shí)需添加20 μg/mL卡那霉素。

1.1.3 試劑與儀器

AHLs信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL)、卡那霉素，Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；色譜級(jí)甲醇、LB肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、鐵瓊脂、生化鑒定管，青島海博生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為市售分析純。

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-X300C型恒溫振蕩器、LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；Quantity One凝膠成像系統(tǒng)、imark酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Agilent 7890N/5975氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)儀，美國(guó)Agilent公司；MS105UD型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Purifier Logic生物安全柜，美國(guó)Labconco公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；精密pH計(jì)，美國(guó)METTLER TOLEDO公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離、鑒定

鮮活海鱸魚碎冰包埋至休克，4 ℃冷藏?zé)o菌包裝至貨架期終點(diǎn)，參照文獻(xiàn)[10]的方法分離，挑取單菌落采用平板劃線純化培養(yǎng)，于LB肉湯中活化并保藏。

16S rDNA測(cè)序：利用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組DNA作為16SrDNA序列擴(kuò)增反應(yīng)模板，PCR采用50 μL的反應(yīng)體系(模板DNA 1 μL，Taq mix 25 μL，引物各2 μL，無菌水20 μL)，引物為27 F(5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′)和1492 R(5′-A￣C￣G￣G￣C￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.1%瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分條帶，后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA 5.0軟件生成系統(tǒng)發(fā)育樹。利用生化鑒定管進(jìn)一步分析分離所得目標(biāo)菌株的生理生化特性[11]。

1.2.2 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

將目標(biāo)菌株過夜活化后接種于LB肉湯中，28 ℃培養(yǎng)至96 h，分別于0、1、4、8、12 h及以后每12 h分別測(cè)定其OD595及pH并記錄，每組3個(gè)平行，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 生物報(bào)告菌法檢測(cè)AHLs活性

報(bào)告平行劃線法：參照文獻(xiàn)[12]的方法，將報(bào)告菌株CV026與目標(biāo)菌株過夜活化后接種培養(yǎng)，在LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上平行劃線，以報(bào)告菌株為陰性對(duì)照，C4-HSL為陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察顏色變化。

報(bào)告平板擴(kuò)散法：參照文獻(xiàn)[13]的方法，將報(bào)告菌株CV026過夜活化后接種培養(yǎng)，加入冷卻至40 ℃的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，混勻并傾倒至已放置好無菌牛津杯的平板中，待平板凝固后取出牛津杯，加入200 μL/孔的菌液，以報(bào)告菌株為陰性對(duì)照，C4-HSL為陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察顏色變化。

1.2.4 GC-MS定性檢測(cè)AHLs種類

AHLs粗提物制備：參照文獻(xiàn)[14]的方法，將目標(biāo)菌株接種培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)期，10 000 r/min離心10 min取上清液，與乙酸乙酯溶液(添加0.1%冰乙酸)等體積混合萃取，收集有機(jī)相(加入適量無水硫酸鈉)，35 ℃ 旋蒸至干后用甲醇溶解，過0.22 μm的無菌濾器，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將6種AHLs標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇中，制備質(zhì)量濃度為200 μg/mL的混合標(biāo)品，-20 ℃保存，與目標(biāo)菌株AHLs粗提液用于GC-MS檢測(cè)[15]。

1.2.5 群體感應(yīng)抑制活性菌篩選

采用接觸共培養(yǎng)法，將目標(biāo)菌株CS12與供試菌株P(guān)F03、AH11、AS7、SP01、SM01、HA14等過夜活化后接種于10 mL/管的LB肉湯中，分別進(jìn)行單菌及與目標(biāo)菌株按數(shù)量比為1∶ 1混合共培養(yǎng)，28 ℃ 培養(yǎng)至168 h，每隔24 h分別測(cè)定每管菌液的OD595并記錄，每組3個(gè)平行，分別繪制目標(biāo)菌株與各供試菌株的生長(zhǎng)曲線。觀察曲線特征進(jìn)行報(bào)告平板擴(kuò)散法，觀察紫色圈直徑的大小，對(duì)應(yīng)AHLs的產(chǎn)生情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel、MEGA5.0、Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與繪圖處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rDNA測(cè)序結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

目標(biāo)菌株CS12的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示，其目的片段在1500 bp左右出現(xiàn)特異性亮帶，擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST系統(tǒng)中已知序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示CS12與殺鮭氣單胞菌B52相似度高達(dá)99%，初步將其命名為A.salmonicidaCS12。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，CS12與其他氣單胞菌屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖2所示。

M—Marker；CS12—A.salmonicida CS12圖1 菌株CS12的16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification of16S rDNA of strain CS12

圖2 菌株CS12與其他氣單胞菌屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationships of strain CS12 and other Aeromonas sp.

2.2 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定及生化鑒定

微生物生長(zhǎng)曲線表明細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下群體生長(zhǎng)與繁殖的規(guī)律。菌株CS12的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線和菌落形態(tài)如圖3所示。由圖3(a)可知，曲線基本呈“S”型，在12 h左右達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；pH呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，分析可能與殺鮭氣單胞菌CS12的生長(zhǎng)代謝有關(guān)，這一結(jié)果與水產(chǎn)品腐敗菌致腐能力的分析基本一致[16-17]。圖3(b)所示，殺鮭氣單胞菌CS12在LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)，菌落表面凸起、邊緣光滑整齊、呈乳白色；在鐵瓊脂上生長(zhǎng)，菌落為圓形、微白色半透明，部分呈現(xiàn)黑色中心。

圖3 菌株CS12的生長(zhǎng)曲線和菌落形態(tài)Fig.3 Growth curve and colony characteristics of strain CS12

菌株CS12生化鑒定結(jié)果見表1。由表1可知：殺鮭氣單胞菌CS12在0～37 ℃條件下均可生長(zhǎng)，不具運(yùn)動(dòng)性，pH≤5.0時(shí)不生長(zhǎng)，與田會(huì)芹等[18]研究發(fā)現(xiàn)酸性條件能明顯抑制殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)結(jié)果一致。

表1 菌株CS12的生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain CS12

注：“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性;ONPG為2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷；TMAO為氧化三甲胺。

2.4 AHLs活性檢測(cè)

利用生物報(bào)告菌法對(duì)殺鮭氣單胞菌CS12的AHLs活性進(jìn)行了初步驗(yàn)證。報(bào)告菌株CV026為C.violaceum：mini-Tn5突變體，具有卡那霉素抗性，其自身不產(chǎn)生AHLs和紫色，當(dāng)外源添加AHLs時(shí)能促使紫色桿菌CV026產(chǎn)生特征性的紫色菌素，其對(duì)?；鶄?cè)鏈長(zhǎng)度為C4～C8的AHLs存在不同程度的敏感[19]。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。圖4中，平板劃線結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照C4-HSL及CS12均能誘導(dǎo)報(bào)告菌株CV026產(chǎn)紫色，在其孔徑周圍也出現(xiàn)紫色圈，且擴(kuò)散明顯，表明殺鮭氣單胞菌CS12具有群體感應(yīng)現(xiàn)象，能夠產(chǎn)生AHLs。

采用GC-MS分析[20]檢測(cè)未知且復(fù)雜的AHLs，如圖5所示。由圖5可見，6種AHLs標(biāo)準(zhǔn)品峰形尖銳且對(duì)稱，各峰分離良好，從左至右依次為C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL，保留時(shí)間分別為4.414、6.166、8.133、10.414、12.994和16.244 min。圖6為離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)下CS12粗提液的GC-MS色譜圖。通過比對(duì)菌株CS12粗提液與AHLs標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌CS12所分泌的AHLs以C6-HSL為主，保留時(shí)間為6.276 min。

圖4 報(bào)告菌法檢測(cè)菌株CS12的AHLs活性Fig.4 Detection of AHLs for strain CS12 by biosensor method

圖5 AHLs混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS色譜圖Fig.5 GC-MS chromatogram of mixture standard AHLs

圖6 菌株CS12粗提液的GC-MS色譜圖Fig.6 GC-MS chromatogram of extract of cell-free supernatant of strain CS12

2.5 群體感應(yīng)抑制活性菌的篩選

采用直接接觸共培養(yǎng)[21]的方式篩選具有抑制殺鮭氣單胞菌CS12群體感應(yīng)活性的拮抗菌株。圖7為單菌及共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況，各菌株菌密度自72 h開始基本趨于穩(wěn)定且情況各異，不影響細(xì)菌指數(shù)期生長(zhǎng)。殺鮭氣單胞菌CS12與溫和氣單胞菌AS7、腐敗希瓦氏菌SP01和粘質(zhì)沙雷氏菌SM01共培養(yǎng)的菌密度與單獨(dú)培養(yǎng)沒有明顯差異；與蜂房哈夫尼亞菌HA14共培養(yǎng)時(shí)，菌密度略高于兩菌株的單獨(dú)培養(yǎng)；與熒光假單胞菌PF03及嗜水氣單胞菌AH11共培養(yǎng)時(shí)，菌密度有所降低，培養(yǎng)至120 h后與PF03共培養(yǎng)的菌密度出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能引起了細(xì)胞衰亡。Zhao等[22]基于QS體外評(píng)估了熒光假單胞菌PF01-CFS對(duì)希瓦氏菌的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)對(duì)延滯期和指數(shù)期的生長(zhǎng)速率沒有影響，而在穩(wěn)定期引起細(xì)胞衰退，且表示CFS的抑制活性可能與PF分泌的AHL和DKP化合物的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)相關(guān)。

通過觀察上述結(jié)果，選取目標(biāo)菌株CS12和PF03、AH11、HA14及分別與CS12共培養(yǎng)生長(zhǎng)至72 h及168 h的菌液，分別進(jìn)行CV026報(bào)告平板擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示。由圖8可見，培養(yǎng)至168 h，紫色圈直徑均有所減小，表示細(xì)菌產(chǎn)信號(hào)分子能力減弱。比較單菌及共培養(yǎng)情況，發(fā)現(xiàn)與PF03共培養(yǎng)紫色圈直徑明顯變?。慌cAH11共培養(yǎng)紫色圈直徑大小與產(chǎn)信號(hào)分子能力較弱者AH11相近；與HA14共培養(yǎng)至72 h紫色圈直徑相較單菌偏小，而培養(yǎng)至168 h時(shí)紫色圈直徑大小介于兩單菌之間。因此筆者認(rèn)為與熒光假單胞菌共培養(yǎng)能有效減弱產(chǎn)信號(hào)分子能力。有研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌是一種重要的植物病害生防菌和根際促生菌，能夠產(chǎn)生多種抗生性次級(jí)代謝產(chǎn)物[23]，因此也可能是存在菌間競(jìng)爭(zhēng)或竊聽行為[24]。

3 結(jié)論

從腐敗海鱸魚中分離得到1株殺鮭氣單胞菌CS12，不耐酸，pH≤5.0不生長(zhǎng)，主要分泌C6-HSL信號(hào)分子，與熒光假單胞菌PF03共培養(yǎng)時(shí)菌密度及產(chǎn)信號(hào)分子能力均有所降低，但不影響指數(shù)期的生長(zhǎng)速率，表明對(duì)殺鮭氣單胞菌CS12產(chǎn)生了群體感應(yīng)抑制作用，自穩(wěn)定期開始出現(xiàn)。

圖7 單菌及共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況Fig.7 Growth curves to cultured alone and co-cultivation with strain CS12

圖8 報(bào)告平板擴(kuò)散法檢測(cè)單菌及共培養(yǎng)菌株的AHLs活性Fig.8 Detection of AHLs to cultured alone and co-cultivation with strain CS12 by biosensor method

熒光假單胞菌是水產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一，同時(shí)也是重要的病害植物生防菌，自身能夠產(chǎn)生多種抗生性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，共存體系中對(duì)沙雷氏菌、希瓦氏菌等具有體外抑制作用，過程受群體感應(yīng)AHLs調(diào)控。目前有關(guān)殺鮭氣單胞菌及致腐方面的研究報(bào)道比較少，熒光假單胞菌的優(yōu)勢(shì)作用也未完全得到解析，基于群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)共培養(yǎng)的探討以及種間群體感應(yīng)的作用機(jī)制研究仍需深入探討。