閆東科,宮艷超,呂 平*,許鳳霞,李 冬,馬素靜

1.天津職業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,天津 300350

2.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化工學(xué)院,天津 300402

變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，包括很多病原菌如β變形菌（綱）奈瑟菌屬腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟球菌分別是引起人類疾病細(xì)菌性腦膜炎和淋病的病原菌。系列多聚磷酸激酶ppk2基因的突變研究證實(shí)PPK2 與病原菌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。例如，下調(diào)ppk2基因可減慢結(jié)核分枝桿菌對巨噬細(xì)胞的侵入，敲除ppk2基因則可降低結(jié)核分枝桿菌在熱、酸和低氧應(yīng)激下的存活[1]；經(jīng)結(jié)核分枝桿菌ppk2突變株感染的豚鼠其組織病理學(xué)特征和細(xì)菌負(fù)荷均減少[2]；土拉熱弗朗西斯菌ppk2突變株對抗生素的敏感性升高且在巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出生長缺陷[3]。

ppk2基因在原核微生物體內(nèi)廣泛存在。例如，在腦膜炎奈瑟菌血清B 群[4]、淋病奈瑟球菌、肺炎克雷伯菌、約氏不動(dòng)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、銅綠假單胞菌和霍亂弧菌等病原菌中均存在PPK2 同源物。但尚未在植物和后生動(dòng)物（包括人類）中發(fā)現(xiàn)ppk2基因[5]。因而，靶向病原菌中多聚磷酸激酶PPK2 的新型抗生素開發(fā)被認(rèn)為是一個(gè)理想的策略[2]。

本研究將圍繞β變形菌CB[6]中PPK2 同工酶（Gi_505233881，WP_015420983.1，以下簡稱：ΔPPK2）展開。首先，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測ΔPPK2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)和基本理化性質(zhì)；其次，利用物理轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體ΔPPK2/pET30a 轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，IPTG 誘導(dǎo)ΔPPK2 蛋白試表達(dá)；最后，放大培養(yǎng)獲得的ΔPPK2 蛋白依次進(jìn)行Ni-IDA 親和色譜柱、陰離子交換色譜柱和凝膠過濾色譜柱分離純化，以期獲得滿足蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究要求的ΔPPK2 蛋白，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)、功能研究和靶向ΔPPK2 蛋白的抗生素開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與材料 限制性核酸內(nèi)切酶（NdeI、HindⅢ和ApaI）、SDS-PAGE Marker 和DNA Marker均購自美國Thermo 公司；Western blot Marker 購自德泰生物科技（南京）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)（上海）有限公司。另外，實(shí)驗(yàn)以質(zhì)粒pET30a 作為表達(dá)載體（卡那抗性，ΔPPK2 蛋白N 端僅含有6×His 標(biāo)簽，純化過程中未切除），Δppk2目的基因由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備AKTA 蛋白純化儀、凝膠過濾色譜柱Superdex200 Increase10/300 GL、Ni-IDA親和柱和陰離子交換柱HitrapQ HP 1 mL 均購自美國GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測 利用PSIPRED 網(wǎng)站（http://web.expasy.org/protparam）預(yù)測ΔPPK2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用ExPASy 網(wǎng)站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測ΔPPK2 基本理化性質(zhì)。

1.2.2 全質(zhì)粒酶切和測序 利用限制性核酸內(nèi)切酶ApaI和HindⅢ對重組表達(dá)質(zhì)粒ΔPPK2/pET30a 進(jìn)行全質(zhì)粒酶切鑒定；目的基因Δppk2的測序工作由金維智生物科技有限公司完成。

1.2.3 ΔPPK2 蛋白試表達(dá)與鑒定 物理法轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒ΔPPK2/pET30a 進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3），接種篩選出的單克隆到5 mL LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1卡那）中培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.8 時(shí)，加入IPTG 使其終濃度為0.2 mM·L-1，并分別置于16 ℃、25 ℃、37 ℃條件下誘導(dǎo)ΔPPK2 蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析?；陔娪窘Y(jié)果，通過Western blot 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析鑒定ΔPPK2 蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 ΔPPK2 蛋白的放大培養(yǎng) 根據(jù)上述試表達(dá)結(jié)果確定出最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)ΔPPK2 蛋白的溫度，采用培養(yǎng)3 L 菌液進(jìn)行放大培養(yǎng)，誘導(dǎo)ΔPPK2 蛋白表達(dá)的時(shí)間一般為16～18 h。

1.2.5 Ni-IDA 親和層析純化 全菌采用50 mM·L-1Tris-HCl（pH8.5）、300 mM·L-1NaCl、20 mM·L-1咪唑含1%TritonX-100、1 mM·L-1PMSF 超聲裂解，采用咪唑緩沖液濃度梯度洗脫ΔPPK2，并收集每個(gè)洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。

1.2.6 陰離子交換色譜和凝膠過濾色譜純化 首先，使用陰離子交換柱（HitrapQ HP）進(jìn)行分離純化，根據(jù)出峰位置進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析；然后，利用凝膠過濾色譜柱（Superdex200）進(jìn)一步純化，根據(jù)出峰位置進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。ΔPPK2 蛋白經(jīng)濃縮測定濃度后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔPPK2 蛋白生物信息學(xué)預(yù)測

利用網(wǎng)站ExPASy 統(tǒng)計(jì)、分析ΔPPK2 蛋白的基本理化性質(zhì)（如表1）。由ΔPPK2 的pI 值為5.69可知：在后續(xù)的分離純化過程中可選用pH8.5，50 mM·L-1Tris-HCl 緩沖液進(jìn)行陰離子交換色譜分離純化；利用PSIPRED 網(wǎng)站預(yù)測ΔPPK2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，ΔPPK2 不存在跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，應(yīng)為胞內(nèi)可溶性蛋白，且α螺旋和β折疊片層的分布較為均勻。

表1 ΔPPK2 基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physicochemical properties of ΔPPK2

2.2 ΔPPK2/pET30a 全質(zhì)粒酶切鑒定

ΔPPK2/pET30a 重組表達(dá)載體全長6180 bp，其中，Δppk2基因長903 bp。利用限制性核酸內(nèi)切酶ApaI和HindⅢ進(jìn)行全質(zhì)粒酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在同一泳道上應(yīng)有一個(gè)4216 bp 的條帶和一個(gè)1964 bp 的條帶。如圖1 與上述預(yù)期相符。

圖1 ΔPPK2/pET30a 重組表達(dá)載體的全質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant expression vector PPK2/pET30a by restriction enzyme digestion

2.3 ΔPPK2 蛋白試表達(dá)與鑒定

試表達(dá)產(chǎn)生的ΔPPK2 蛋白N 端僅含有6×His 標(biāo)簽，根據(jù)表1 中ΔPPK2 蛋白分子量預(yù)測結(jié)果，ΔPPK2 蛋白在SDS-PAGE 電泳時(shí)的分子量應(yīng)約為35 ku。如圖2 與預(yù)期大小相一致，且16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)的ΔPPK2 蛋白表達(dá)量與狀態(tài)更為理想，后續(xù)放大培養(yǎng)階段選擇在16 ℃下進(jìn)行。為進(jìn)一步確定上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對16 ℃下的試表達(dá)菌液進(jìn)行western blot 分析，結(jié)果顯示，抗ΔPPK2 蛋白N 端6×His標(biāo)簽的抗體曝光位置同樣位于35 ku 處（如圖3）。

圖2 SDS-PAGE 分析ΔPPK2 蛋白試表達(dá)情況Fig.2 SDS-PAGE analysis of ΔPPK2 trial expression

圖3 Western blot 鑒定ΔPPK2 蛋白16 ℃下表達(dá)情況Fig.3 Western blot analysis of ΔPPK2 expression under 16 ℃

2.4 Ni-IDA 親和層析分離ΔPPK2 蛋白

將3 L 用于放大培養(yǎng)的表達(dá)菌液經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)、超聲破碎、離心后過Ni-IDA 親和色譜柱，SDS-PAGE 電泳分析不同濃度咪唑洗脫ΔPPK2 蛋白情況。如圖4，ΔPPK2 蛋白存在于全菌破菌離心后上清，蛋白可溶性良好，300 mM·L-1咪唑可充分洗脫ΔPPK2 蛋白，基本未發(fā)生“黏柱子現(xiàn)象”且蛋白純度較高。

圖4 ΔPPK2 過Ni-IDA 親和柱純化結(jié)果Fig.4 The purification result of ΔPPK2 via Ni-IDA affinity column

2.5 ΔPPK2 蛋白的純化

親和色譜洗脫下來的ΔPPK2 蛋白首先利用HitrapQ HP 陰離子交換柱進(jìn)行純化，陰離子交換色譜圖（如圖5）呈現(xiàn)較對稱的單峰，說明ΔPPK2 蛋白帶電性質(zhì)較為均一。吸取Q21-Q24 管洗脫液5 μL進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析（如圖6）。ΔPPK2 蛋白在凝膠過濾色譜柱上的色譜圖呈現(xiàn)對稱單峰（如圖7），洗脫峰值出現(xiàn)在14.24 mL，說明ΔPPK2 蛋白在溶液中以單體形式存在。吸取D18-D23 管洗脫液5 μL 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析（如圖8），ΔPPK2 蛋白純度較高。將D18-D23 管洗脫液混勻濃縮至60 μL，測定蛋白濃度為12 mg·L-1，純度為95%。

圖5 ΔPPK2 蛋白的陰離子交換色譜純化Fig.5 The purification result of ΔPPK2 by anion exchange chromatography

圖6 SDS-PAGE 分析陰離子交換色譜純化ΔPPK2 蛋白Fig.6 SDS-PAGE result of ΔPPK2 purification by anion exchange chromatography

圖7 ΔPPK2 蛋白的凝膠色譜純化Fig.7 The purification result of ΔPPK2 by gel filtration chromatography

圖8 SDS-PAGE 分析凝膠色譜純化ΔPPK2 蛋白Fig.8 SDS-PAGE result of ΔPPK2 purification by gel filtration chromatography

3 討論

PPK2 在不同的微生物中以不同的寡（多）聚體（二聚體、四聚體和八聚體）存在，但具有相似的基本結(jié)構(gòu)，均含有保守的分別與NTP 的β和γ位磷酸基團(tuán)結(jié)合的Walker A 和Walker B 基序，而蓋子模序促進(jìn)這些結(jié)合作用，并與Walker A/B 基序組成P-環(huán)NTP 水解酶結(jié)構(gòu)域[7]。目前，針對病原菌中PPK2 活性的抑制劑（抗生素）研究主要基于PPK2 的寡（多）聚化進(jìn)行。例如，G-四鏈體對結(jié)核分枝桿菌PPK2的八聚體復(fù)合物具有顯著抑制作用，且通過對霍亂弧菌PPK2和香港海鷗型菌PPK2的有效抑制表現(xiàn)出廣譜活性[8]。值得一提的是，紅色亞棲熱菌PPK2 和土拉熱弗朗西斯菌PPK2 與不同核苷酸底物的晶體結(jié)構(gòu)表明[9]，對酶活性中心的阻礙作用或?qū)Πl(fā)生底物轉(zhuǎn)移的蓋子區(qū)域的阻礙作用被認(rèn)為是PPK2 靶向研究的新方向[10]，這就對PPK2 激酶的立體空間結(jié)構(gòu)解析工作提出了要求。

本研究利用ΔPPK2/pET30a 重組表達(dá)載體，通過16 ℃，終濃度為0.2 mM·L-1IPTG 誘導(dǎo)ΔPPK2蛋白在E.coliBL21（DE3）中高效可溶性表達(dá)，依次通過Ni-IDA 親和色譜柱、陰離子交換色譜柱和凝膠過濾色譜柱進(jìn)行分離純化，獲得了濃度為12 mg·mL-1，純度為95%的且具有高度均一性的ΔPPK2 蛋白。純化出的ΔPPK2 蛋白既可用于多聚磷酸激酶活性檢測和宿主細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白的篩選，又可用于蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)和X 射線蛋白晶體三維立體空間結(jié)構(gòu)解析的科學(xué)研究，從而使靶向ΔPPK2 蛋白的新型致病菌抑制劑（抗生素）的開發(fā)成為可能。因此，本研究為深入研究ΔPPK2 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。