王彥淇 郭玉蓉 王永濤 趙 靚 吳曉蒙* 廖小軍

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品非熱加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100083 2 陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院 西安710119）

蘋果是全球消費(fèi)量最高的水果之一[1]，而我國(guó)擁有世界上最大的蘋果及蘋果汁生產(chǎn)量和出口量。目前市場(chǎng)上果汁飲料多是濃縮還原（From Concentrate，F(xiàn)C）果汁，它是在濃縮果汁中還原天然果汁中等量的水后得到的制品[2]，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低，產(chǎn)品附加值不高。近年來(lái)蘋果汁產(chǎn)業(yè)中興起的非濃縮還原（Not From Concentrate，NFC）果汁，是由新鮮原果壓榨后直接殺菌罐裝而成，其未經(jīng)濃縮及復(fù)原工序，具有口感真實(shí)且營(yíng)養(yǎng)成分（特別是抗氧化物質(zhì)酚類等）保留充分等特點(diǎn)。尼爾森《2018年中國(guó)消費(fèi)市場(chǎng)的十大特點(diǎn)和趨勢(shì)》顯示，消費(fèi)者對(duì)于產(chǎn)品的功能性有了更高的追求。中國(guó)銀河證券研究部資料顯示，我國(guó)NFC 果汁的市場(chǎng)規(guī)模將呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)2020年NFC 果汁銷售額將達(dá)120 億元?！?015-2022年中國(guó)果汁飲料行業(yè)全景調(diào)研及投資戰(zhàn)略咨詢報(bào)告》顯示，美國(guó)NFC 果汁消費(fèi)量占100%果汁消費(fèi)結(jié)構(gòu)的60%，已成為市場(chǎng)主流飲品且每年保持著較快的增長(zhǎng)。NFC 果汁作為新興健康果汁，迎合了當(dāng)今消費(fèi)者“健康、天然、美味”的消費(fèi)追求，迅速占據(jù)了果汁市場(chǎng)。

蘋果多酚的抗氧化和自由基清除能力很高[3-4]，具有促進(jìn)致癌物代謝，影響癌細(xì)胞凋亡的作用[1]，這是其能抑制心血管疾病和前列腺癌、肝癌等癌癥[5]的主要原因。前人[7-9]研究表明蘋果的抗氧化能力更多地來(lái)源于多酚組分而非維生素C[6]，抗氧化能力與總酚含量之間存在極大相關(guān)性。而蘋果多酚中僅有少數(shù)酚類，如黃酮類化合物[10]的抗氧化能力受到關(guān)注，黃酮類化合物在蘋果中含量較低且對(duì)總抗氧化能力的貢獻(xiàn)率未知，而其它化合物如原花青素顯示出更強(qiáng)的抗氧化活性[11-13]。這表明蘋果的抗氧化能力不僅與總酚含量有關(guān)，還與單體酚組成密切相關(guān)。具體酚類或單體酚對(duì)總抗氧化能力的作用還需進(jìn)一步研究。

本文旨在通過(guò)超高效液相色譜法和兩種體外抗氧化試驗(yàn)（DPPH 和ABTS 自由基清除試驗(yàn)）評(píng)價(jià)15 種NFC 蘋果汁的單體酚組成和抗氧化能力。通過(guò)相關(guān)性分析綜合分析多酚含量及單體酚組成的抗氧化性，旨在對(duì)蘋果汁企業(yè)原料果品種的選擇提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15 種蘋果（“新紅星”、“玉華早富”、“元帥”、“涼香”、“新世界”、“秦艷”、“紅玉”、“喬納金”、“秋香”、“恩派”、“桔蘋”、“自由”、“富士”、“粉紅女士”和“秦冠”），采自西北農(nóng)林科技大學(xué)白水實(shí)驗(yàn)站（中國(guó)，陜西），所有品種均于各自商業(yè)采收期采摘。

多酚標(biāo)準(zhǔn)品（沒(méi)食子酸、原兒茶酸、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、原花青素B2、綠原酸、4-羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸、槲皮苷和根皮苷），Sigma-Aldrich（中國(guó)）有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、二銨鹽（2，2'-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt，ABTS）、抗壞血酸（食品級(jí)），西安晶博生物科技有限公司；甲醇、乙腈、三氟乙酸（色譜級(jí)），西安永屹生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Thermo Electron 公司；syncronis C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國(guó)Thermo Electron 公司；UV1800 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼克有限公司；HU-780 榨汁機(jī)，韓國(guó)Huron 公司。

1.3 方法

1.3.1 NFC 蘋果汁的制備 工藝流程：蘋果→清洗、去皮去核→護(hù)色（0.6%抗壞血酸溶液，30 s）→榨汁、過(guò)濾→熱殺菌（98 ℃，30 s）→均質(zhì)（300 bar）→二次熱殺菌（98 ℃，50 s）→灌裝→冷卻→儲(chǔ)存（4 ℃）。

1.3.2 多酚成分的測(cè)定 采用UPLC 法[14]。色譜柱：ThermoRsyncronis C18 色譜柱；柱溫：30 ℃。兩相溶劑系統(tǒng)：溶劑A：30%乙腈和70%甲醇；溶劑B：1‰三氟乙酸和5%甲醇；洗脫梯度見(jiàn)表1，共41 min。進(jìn)樣量：4.0 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

表1 流動(dòng)相洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.3.3 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除率測(cè)定[11]將100 μL蘋果汁濾液（以蒸餾水為參比）與0.9 mL 1.5×10-4mol/L DPPH 溶液混合，于18 ℃暗處反應(yīng)30 min，517 nm 處測(cè)定混合物的吸光度。計(jì)算公式如下：

式中：A對(duì)照——對(duì)照組的吸光度；A樣品——蘋果汁濾液的吸光度。

1.3.3.2 ABTS 自由基清除率測(cè)定[11]將7 mmol/L ABTS 溶液與2.45 mmol/L 過(guò)硫酸鉀溶液混合后，于23 ℃暗處反應(yīng)16 h 得到ABTS 自由基正離子（ABTS·+）?；旌衔镫S即用80%乙醇溶液稀釋，于734 nm 處測(cè)定其吸光度為0.700 ± 0.005。將0.1 mL 待測(cè)蘋果汁（以蒸餾水為參比）樣品加入3.9 mL ABTS·+溶液中劇烈震蕩，室溫下暗處反應(yīng)6 min 后于734 nm 處測(cè)定其吸光度。計(jì)算公式如下：

式中：A對(duì)照——對(duì)照組的吸光度；A樣品——蘋果汁濾液的吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本文中所有試驗(yàn)平行測(cè)定3 組，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用origin 8.0 軟件和R 語(yǔ)言3.2.5軟件制圖，SPSS 13.0 軟件處理數(shù)據(jù)。單因素方差分析（ANOVA）采用Duncan 法，選取95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 15 種NFC 蘋果汁中單體酚的定性和定量分析

使用UPLC 對(duì)蘋果汁的單體酚進(jìn)行分析。圖1為16 種單體酚標(biāo)品的混合標(biāo)樣液相圖。選取幾種NFC 蘋果汁多酚的典型圖譜于圖2中顯示。

結(jié)果表明，不同種類的蘋果汁中單體酚組分相似，含量差異顯著。不同單體酚標(biāo)品中，沒(méi)食子酸極性最強(qiáng)，最先出峰；根皮苷極性最弱，最后出峰[15]。標(biāo)準(zhǔn)品中的16 種單體酚中僅槲皮素在15 種蘋果汁中均未檢出。具體每種果汁的單體酚組成見(jiàn)表2。按出峰順序?qū)?6 種單體酚在15 種NFC 果汁中的含量表示成熱圖，見(jiàn)圖3。

圖1 16 種單體酚標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of the 16 individual phenolic standards

圖2 秋香（a）、自由（b）、富士（c）、元帥（d）NFC 蘋果汁的UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of the NFC apple juices from Qiuxiang（a），Ziyou（b），F(xiàn)uji（c）and Delicious（d）

UPLC 結(jié)果表明，除個(gè)別單體酚在某些品種中未檢出外，大部分品種均含有15 種單體酚。為排除不同生長(zhǎng)地區(qū)、氣候、生長(zhǎng)周期、成熟度、加工方式等因素對(duì)不同蘋果中單體酚含量差異的影響[16]，本研究采用同一產(chǎn)地、成熟度一致的蘋果樣品，相同加工方法制汁，控制品種差異為單一變量。

被測(cè)果汁中，含量最高的單體酚是綠原酸，這與前人[17-18]研究結(jié)果一致，其次分別是原花青素B2、表兒茶素和表沒(méi)食子兒茶素，它們?cè)?5 種果汁中均有檢出，含量最低的是表兒茶素沒(méi)食子酸酯和咖啡酸。

圖4顯示15 種NFC 蘋果汁中總酚指數(shù)（Total Phenols Index，TPI）和三大類多酚的含量?？偡又笖?shù)是指用UPLC 方法測(cè)定的所有單體酚含量的總和[5]。在15 種蘋果中總酚指數(shù)差異明顯，其中，“秋香”的總酚指數(shù)最高（400 μg/mL），“自由”和“秦冠”次之，“恩派”最低（173.8 μg/mL），這與Tsao 等[19]對(duì)10 種白肉蘋果中多酚含量的研究結(jié)果相似。

本研究中，15 種NFC 蘋果汁中多酚主要有3類：原花青素、酚酸和黃酮類。Fabio 等[8]在“元帥”蘋果果肉中檢出原花青素等主要多酚的結(jié)果也佐證了本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。蘋果汁中主要的原花青素類物質(zhì)包括表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒(méi)食子酸酯，主要的酚酸類物質(zhì)為沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸、4-羥基苯甲酸、咖啡酸和鞣花酸，黃酮類物質(zhì)主要有蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷和根皮苷。原花青素和酚酸作為蘋果汁中兩類最主要的多酚類物質(zhì)[20]，在本研究中分別占總酚含量的32.4%和64.0%，它們對(duì)蘋果汁的抗氧化性起著重要作用。鮮食蘋果中最豐富的多酚類物質(zhì)是原花青素類[21]，而在本研究中，被測(cè)15 種蘋果汁中的酚酸含量（102～331 μg/mL）顯著高于原花青素含量（24.4～183.6 μg/mL）（P＜0.05）。這是因?yàn)樵ㄇ嗨厮苄缘陀诜铀犷惽夜?、熱不穩(wěn)定[20]，熱殺菌對(duì)其造成較大損耗；其次，酚酸類物質(zhì)水溶性好[22]，在含水量高的果汁體系中溶解度高，且酚酸中綠原酸是蘋果中最主要的單體酚[19，23]。以上因素導(dǎo)致蘋果汁中含量最高的是酚酸大類物質(zhì)。由圖4可以看出，蘋果汁中黃酮類物質(zhì)含量最低，這是因?yàn)樘O果中黃酮類物質(zhì)主要分布在蘋果果皮中，果皮中的含量約為果肉中的2～3 倍[24]。黃酮類物質(zhì)中槲皮苷的含量最高，為1.4～21.2 μg/mL，這與前人[23]研究結(jié)果（0.4～27 μg/mL）相近。

2.2 15 種NFC 蘋果汁的抗氧化性

不同的抗氧化能力評(píng)價(jià)方法的反應(yīng)機(jī)制和特性不同，其結(jié)論往往不同[25]。一種方法不能全面體現(xiàn)果汁系統(tǒng)中復(fù)雜的生化反應(yīng)，需使用至少兩種方法進(jìn)行體外抗氧化能力的測(cè)定。本研究采用DPPH 法和ABTS 法對(duì)15 種蘋果的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，15 種NFC 果汁的抗氧化能力見(jiàn)表3。

2.2.1 DPPH 的自由基清除能力 DPPH 是一種氮族自由基，易與具有氫原子供體的物質(zhì)（本文中為蘋果中的抗氧化成分）發(fā)生電子轉(zhuǎn)移[26]。DPPH通過(guò)與抗氧化劑反應(yīng)，自身被還原成聯(lián)氨，溶液顏色由紫色變?yōu)闇\黃色，結(jié)果可由分光光度計(jì)定量[27]。DPPH 自由基清除試驗(yàn)具有自由基穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好和受環(huán)境影響小的優(yōu)點(diǎn)，在體外測(cè)定果蔬汁及其提取物的抗氧化能力方面具有良好的性能[28]。此外，由于DPPH 在測(cè)定淺色樣品時(shí)具有較高的準(zhǔn)確度，因此很適合測(cè)定本試驗(yàn)中的蘋果汁樣品[26]。

DPPH 試驗(yàn)結(jié)果顯示，15 種蘋果汁對(duì)DPPH自由基均有不同的清除效果，其中 “喬納金”的DPPH 自由基清除能力最高（89.1%），“新世界”的清除能力最低（78.3%）?！靶录t星”、“玉華早富”、“元帥”、“秦艷”、“紅玉”、“喬納金”、“自由”和“富士”對(duì)自由基的清除率都大于85%，屬于DPPH 自由基清除能力較強(qiáng)的品種。

2.2.2 ABTS 的自由基清除能力 ABTS 自由基陽(yáng)離子清除能力試驗(yàn)是利用比色法來(lái)定量樣品中的抗氧化活性物質(zhì)對(duì)ABTS 自由基陽(yáng)離子的清除能力[26]。ABTS 自由基陽(yáng)離子易溶于水，很適合對(duì)果汁體系進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定。此外，果汁體系中多酚種類多且反應(yīng)復(fù)雜，ABTS 試驗(yàn)方法可避免待測(cè)樣品中過(guò)氧化物對(duì)自由基的影響，適用于復(fù)雜混合物體系中不同抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力測(cè)定[28]。

本研究中ABTS 清除能力數(shù)據(jù)略高于DPPH值，不同品種NFC 蘋果汁的ABTS 自由基清除率為80.3%～92.6%，其中，“秋香”的ABTS 自由基清除能力最高，達(dá)92.6%，其次還有“富士”和“桔蘋”。

對(duì)ABTS 和DPPH 測(cè)定結(jié)果顯示，DPPH 自由基清除試驗(yàn)中“喬納金”表現(xiàn)最好，而ABTS 自由基清除試驗(yàn)中“秋香”的清除能力最強(qiáng)。綜合兩種抗氧化能力進(jìn)行分析，“富士”、“元帥”、“玉華早富”3 個(gè)品種在兩個(gè)試驗(yàn)中都表現(xiàn)為較高的自由基清除率（＞85%），“新世界”、“粉紅女士”、“秦冠”和“涼香”品種的抗氧化能力都較低。這一結(jié)果再次說(shuō)明用多種試驗(yàn)方法進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定的必要性。通過(guò)多種試驗(yàn)對(duì)比，可以得到較為全面、可信的試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 15 種NFC 蘋果汁中單體酚與抗氧化能力的相關(guān)性分析

對(duì)不同品種的NFC 蘋果汁中酚類組成與抗氧化能力（DPPH 和ABTS 自由基清除能力）進(jìn)行相關(guān)性分析，確定對(duì)總抗氧化能力起主要作用的單體酚，結(jié)果如圖5所示。相關(guān)系數(shù)（R2）取值范圍在-1～1 之間，相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值越高，該指標(biāo)對(duì)抗氧化能力的貢獻(xiàn)就越大。圖5中的雙標(biāo)圖的橫、縱坐標(biāo)分別代表各酚類成分與DPPH 和ABTS 的相關(guān)系數(shù)，其中內(nèi)圓和外圓代表的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.4 和0.6。本研究中以相關(guān)系數(shù)系數(shù)絕對(duì)值在0.4～0.6 范圍時(shí)，表示該酚類成分與自由基清除能力中等程度相關(guān)；相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值0.6～0.8 范圍時(shí)，表示該酚類成分與自由基清除能力相關(guān)性強(qiáng)；相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值在0.8～1.0 范圍時(shí)，表示該酚類成分與自由基清除能力相關(guān)性極強(qiáng)。

2.3.1 單體酚與DPPH 自由基清除能力的相關(guān)性

圖5 酚類組成與DPPH 和ABTS 值的相關(guān)系數(shù)雙標(biāo)圖Fig.5 Biplots visualising the correlation between polyphenolic constituents and DPPH and ABTS values

蘋果汁的三大類多酚中，原花青素含量和DPPH 值正相關(guān)性強(qiáng)（R2=0.64），說(shuō)明原花青素大類對(duì)DPPH 自由基清除能力貢獻(xiàn)率最大，同時(shí)，其含量高達(dá)總酚的32.4%，居于蘋果汁中的第2 位。原花青素的高相關(guān)性和高含量決定了其對(duì)抗氧化能力的重要作用。原花青素大類中，有3 種單體酚（原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒(méi)食子酸酯）與DPPH 值呈強(qiáng)正相關(guān)，它們對(duì)DPPH 自由基清除能力貢獻(xiàn)較大。在前人[30-31]的研究中也找到類似的結(jié)論。表兒茶素的相關(guān)性顯著大于兒茶素（P＜0.05），說(shuō)明表兒茶素具有更高的DPPH 自由基清除能力，這是由于碳環(huán)上碳3 位的順式羥基集團(tuán)比反式結(jié)構(gòu)更能增強(qiáng)混合物的還原能力[19]。酚酸大類與DPPH 值呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)（R2=-0.6）。通過(guò)分析酚酸大類組成發(fā)現(xiàn)，這是因?yàn)榉铀嶂械膯误w酚綠原酸與DPPH 自由基清除能力呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)（R2=-0.63），且其含量最高，超過(guò)蘋果汁中總酚的一半。然而，這不意味著綠原酸的存在會(huì)降低果汁的抗氧化能力，只是其含量上的增加會(huì)降低抗氧化能力與總酚含量的比值?？偡又笖?shù)與DPPH 值呈負(fù)相關(guān)，這是因?yàn)榉铀岽箢愇镔|(zhì)占蘋果汁比重很高且呈負(fù)相關(guān)。與前人[32]對(duì)“嘎啦”蘋果果肉的總黃酮測(cè)定結(jié)果相似。本試驗(yàn)的蘋果汁中黃酮含量較少，且與抗氧化能力間無(wú)顯著相關(guān)性，其中的單體酚物質(zhì)根皮苷與DPPH 值幾乎沒(méi)有相關(guān)性，說(shuō)明根皮苷含量對(duì)DPPH 自由基清除能力影響可以忽略。前人[19]研究顯示：根皮苷的抗氧化能力很低。也有研究顯示其抗氧化能力很高[33]。本試驗(yàn)未使用高純度根皮苷分析，NFC 蘋果汁中根皮苷含量很低。雖然進(jìn)行了相關(guān)性分析，但結(jié)果并不能代表根皮苷與抗氧化能力之間的關(guān)系。

總結(jié)3 類多酚的抗氧化能力，其抗氧化能力排序是原花青素＞黃酮＞酚酸，其中呈強(qiáng)正相關(guān)的單體酚有原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒(méi)食子酸酯，而綠原酸與DPPH 自由基清除能力呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)。

2.3.2 單體酚與ABTS 自由基清除能力的相關(guān)性

由圖5可知，ABTS 自由基清除能力與單體酚相關(guān)系數(shù)較低，與總酚指數(shù)相關(guān)性較大，這說(shuō)明該抗氧化能力主要與總酚含量有關(guān)，受單體酚種類影響較小。

生物系統(tǒng)包含多種抗氧化系統(tǒng)，它們可能參與復(fù)雜的相互作用，其中包括食物介質(zhì)中的協(xié)同或拮抗反應(yīng)等[34]。目前還沒(méi)有一種通用的方法能夠準(zhǔn)確反映復(fù)雜體系中的所有抗氧化活性[25]，因此很難用某一個(gè)抗氧化試驗(yàn)來(lái)說(shuō)明某物質(zhì)的抗氧化性能。不同抗氧化活性試驗(yàn)方法具有不同的反應(yīng)機(jī)理，這也是本試驗(yàn)中兩種抗氧化試驗(yàn)獲得結(jié)果不完全一致的原因。雖然ABTS 值與DPPH值不完全相同，但是通過(guò)比較不同多酚與ABTS的相關(guān)性，仍能發(fā)現(xiàn)相同的趨勢(shì)：三大類多酚中，原花青素是最主要的一類抗氧化物質(zhì)。在原花青素大類中，對(duì)ABTS 自由基陽(yáng)離子清除能力有主要貢獻(xiàn)的是原花青素B2、表兒茶素和兒茶素單體酚物質(zhì)。此結(jié)果與DPPH 結(jié)果相同，這進(jìn)一步確認(rèn)了蘋果中最重要的抗氧化物質(zhì)。另外，本試驗(yàn)中4-羥基苯甲酸與ABTS 自由基清除能力相關(guān)系數(shù)也較高。

3 結(jié)論

15 種NFC 蘋果汁中多酚組分分析和抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，NFC 蘋果汁中主要的多酚大類為酚酸和原花青素，主要的單體酚物質(zhì)為綠原酸、原花青素B2 和表兒茶素，總酚指數(shù)含量最高的蘋果品種為“秋香”和“自由”?？寡趸芰Ψ治鲈u(píng)定結(jié)果：DPPH 自由基清除能力最高的品種是 “喬納金”，對(duì)ABTS 自由基清除能力最高的品種是“秋香”。單體酚和抗氧化能力的相關(guān)性分析表明，NFC 蘋果汁抗氧化能力的主要來(lái)源是原花青素大類，其中，DPPH 自由基清除能力主要與原花青素B2、表兒茶素和表兒茶素沒(méi)食子酸酯3 種單體酚相關(guān)，而ABTS 自由基清除能力主要與總酚有關(guān)，與多酚組成關(guān)系不大。