朱雨辰 張單單 王少甲 袁英髦 曹雁平*

（1 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué) 北京100048 2 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京工商大學(xué) 北京100048 3 北京工商大學(xué) 北京100048）

明膠是動(dòng)物膠原蛋白在酸、堿、酶或高溫等條件下形成的變性產(chǎn)物，因具有優(yōu)良的持水性、分散穩(wěn)定性和成膜性[1]，故可以作為增稠劑、澄清劑等添加于食品中改善食品品質(zhì)。此外，明膠還具有凝膠性，可以作為包埋風(fēng)味劑、糖及其它配合物的載體，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[2-3]。隨著明膠應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，其缺點(diǎn)逐漸顯現(xiàn)。由于明膠的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此存在機(jī)械強(qiáng)度小，易受細(xì)菌污染變質(zhì)，易被蛋白酶酶解等缺點(diǎn)，這極大地限制了明膠的使用范圍[4]。

通過(guò)對(duì)明膠的活性側(cè)鏈進(jìn)行修飾，獲得改性明膠，可以明顯改善明膠的理化性質(zhì)。常見(jiàn)的改性方式主要有物理改性、化學(xué)改性和酶法改性[5-6]。然而，物理改性的改性速度慢，均一性差，實(shí)施較困難，導(dǎo)致其實(shí)際應(yīng)用受到很大限制[7]；而化學(xué)改性的成本高，部分交聯(lián)劑有毒性，不能用于食品工業(yè)中[8]。酶法改性因具有安全性高、可食用等優(yōu)點(diǎn)，故成為研究的重點(diǎn)。常用酶主要有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、過(guò)氧化酶、酪氨酸酶、多酚氧化酶等，其作用機(jī)制為催化蛋白質(zhì)形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)[9]，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性。其中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的來(lái)源豐富，價(jià)格便宜，被廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[10-11]。丁克毅等[12-14]對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性明膠的物理性質(zhì)做了系統(tǒng)性研究，研究發(fā)現(xiàn)改性明膠薄膜的抗張強(qiáng)度和韌性顯著提高，水溶性和吸水性則顯著降低。姜燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)，改性明膠膜的抗拉強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和表面疏水性都得到顯著提高，總可溶性物和水分含量顯著降低，而透光率變化不大?，F(xiàn)階段的研究主要關(guān)注改性明膠的物理性質(zhì)，對(duì)其耐酶解性關(guān)注較少。

本研究以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性明膠的耐酶解性為關(guān)注點(diǎn)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究不同改性條件對(duì)改性明膠耐酶解性的影響，并利用偏最小二乘法建立改性明膠耐酶解性預(yù)測(cè)模型，確定改性明膠的最優(yōu)制備條件，為明膠材料控制釋放理論研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明膠、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、乙酸丁酯、甘氨酸和磷酸二氫鉀均為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（食品級(jí)），泰興市一鳴生物制品有限公司；木瓜蛋白酶（活力4.96×105U/g），美國(guó)Sigma 公司；茚三酮（分析純），西隴化工有限公司；D-果糖（分析純），北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙醇（分析純），北京化工廠。

CP-214 電子分析天平，上海市奧豪斯儀器有限公司；FE20 型pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UVmini-1240 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；Kjeltec 8400 半自動(dòng)凱氏定氮儀，德國(guó)福斯公司；DC-2006 型低溫恒溫水浴鍋，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省鞏義市予華有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 改性明膠球的制備 本課題組前期研究[4]表明，明膠溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，制得的明膠球黏度和硬度均適中，成球性好。本試驗(yàn)中明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。具體制備方法如下：將一定量明膠在60°C 下完全溶解于不同pH 值的磷酸緩沖溶液中，使明膠溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。在不同反應(yīng)溫度下，向明膠溶液中緩慢滴加不同濃度的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液（1 mL），反應(yīng)不同時(shí)間，反應(yīng)后冷卻到室溫，獲得明膠-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶混合溶液。將該混合溶液緩慢滴加到經(jīng)磁力攪拌器不斷攪拌的冷藏的醋酸丁酯溶液中，獲得凝膠球，通過(guò)調(diào)節(jié)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速，使凝膠球大小為（4±1）mm。制得的改性明膠球經(jīng)超純水清洗后，儲(chǔ)存于4°C 下，待測(cè)。經(jīng)相同處理的未改性明膠球作為對(duì)照組。

1.2.2 改性明膠耐酶解性單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以木瓜蛋白酶處理改性明膠的水解度為耐酶解性指標(biāo)，分別研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶質(zhì)量濃度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 g/L）、改性pH 值（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）、改性溫度（40，45，50，55，60 ℃）和改性時(shí)間（10，20，30，40，50 min）對(duì)改性明膠耐酶解性的影響。

1.2.3 改性明膠耐酶解性均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度、改性pH 值、改性溫度和改性時(shí)間為影響因素，做4 因素5 水平的均勻試驗(yàn)，分析各改性因素對(duì)改性明膠水解度的影響。利用偏最小二乘回歸法處理數(shù)據(jù)，得到改性明膠水解度的預(yù)測(cè)模型，確定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性明膠的最佳制備條件。采用DPSv15.10（杭州睿豐信息技術(shù)有限公司）軟件進(jìn)行均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 Uniform experimental design

1.2.4 改性明膠水解度的測(cè)定 取200 mL 磷酸緩沖溶液（pH 7.0），加入2 g 木瓜蛋白酶，完全溶解后加入明膠球5 g，置于恒溫振蕩器中40°C 下加熱，每30 min 取樣1 次，共取樣5 次。取樣后立刻用沸水浴加熱5 min，使木瓜蛋白酶失活。采用茚三酮法測(cè)定樣品中的氨基氮的含量，凱氏定氮法測(cè)定樣品中總氮的含量。明膠的水解度計(jì)算公式如下：

式中，Ah——樣品中氨基氮含量（μg）；A0——明膠中固有的氨基氮含量（μg）；Az——明膠中總氮含量（μg）。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度對(duì)改性明膠耐酶解性的影響

在改性pH 6，改性溫度40°C，改性時(shí)間30 min 條件下，考察轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度對(duì)改性明膠耐酶解性的影響。

圖1結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶質(zhì)量濃度小于0.20 g/L 時(shí)，改性明膠的水解度隨著轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度的增加而降低，與未改性明膠相比，改性明膠的耐酶解能力顯著提高。這可能是由于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與明膠蛋白的賴氨酸和谷氨酰胺共價(jià)交聯(lián)，導(dǎo)致大分子鏈段數(shù)目增多，從而阻礙木瓜蛋白酶對(duì)改性明膠的水解，導(dǎo)致水解度降低。當(dāng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶質(zhì)量濃度大于0.20 g/L 后，隨著轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度的增加，水解度反而有升高的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槊笣舛容^高時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)速率瞬間加快，蛋白質(zhì)分子表面的作用位點(diǎn)被迅速占據(jù)，降低了其與周圍其它蛋白質(zhì)分子進(jìn)行交聯(lián)的幾率，從而導(dǎo)致分子間交聯(lián)要少[16]。當(dāng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶質(zhì)量濃度為0.20 g/L 時(shí)，改性明膠的耐酶解性最好。

2.2 改性pH 值對(duì)改性明膠耐酶解性的影響

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性受反應(yīng)環(huán)境pH 值的影響，而酶活又直接影響轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)明膠的改性程度。本研究在改性溫度50°C，改性時(shí)間30 min 條件下，考察不同改性pH 值對(duì)改性明膠耐酶解性的影響。

圖2結(jié)果顯示，隨著改性pH 值的增大，改性明膠的水解度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，在pH6.0 和7.0 時(shí)水解度較低。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適pH 值為6.0，在適宜pH 值附近，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分子鏈充分舒展，與明膠的接觸面積增大，有利于其對(duì)明膠進(jìn)行改性，導(dǎo)致改性明膠的水解度降低，耐酶解性升高[17]；然而，pH 值過(guò)高或過(guò)低時(shí)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性基團(tuán)變性致酶失活，不利于對(duì)明膠的改性，導(dǎo)致改性明膠的水解度增加，耐酶解性降低[18]。此外，pH 值還通過(guò)影響明膠的溶解度，影響轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與明膠的接觸機(jī)會(huì)，從而影響改性明膠的水解度[19]。在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適pH值，即pH 6 時(shí)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)明膠的改性最完全，改性明膠的耐酶解性最好。

圖1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度對(duì)改性明膠耐酶解性的影響Fig.1 The effect of transglutaminase concentration on hydrolysis ratio of modified gelatin

圖2 改性pH 值對(duì)改性明膠耐酶解性的影響Fig.2 The effect of pH value on hydrolysis ratio of modified gelatin

2.3 改性溫度對(duì)改性明膠耐酶解性影響

除pH 值外，酶的活性還受溫度的影響。在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶質(zhì)量濃度0.20 g/L、改性pH 值6.0、改性時(shí)間30 min 條件下考察不同改性溫度對(duì)改性明膠耐酶解性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，改性明膠的水解度隨著改性溫度的增加而降低。其中，當(dāng)改性溫度為45°C 時(shí)，改性明膠的水解度最低，隨后水解度逐漸升高。然而，這一溫度與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適溫度（40°C）間存在一定的差距。這可能是因?yàn)?5°C 不是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適溫度，此時(shí)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)明膠的改性更有利于其耐酶解性；隨著反應(yīng)溫度的持續(xù)升高，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶活逐漸降低，對(duì)明膠的改性不完全，導(dǎo)致水解度逐漸增大[20]。改性溫度為45°C 時(shí)，改性明膠的耐酶解性最好。

2.4 改性時(shí)間對(duì)改性明膠耐酶解性的影響

在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶質(zhì)量濃度0.20 g/L、改性pH值6.0、改性溫度50°C 條件下，考察不同改性時(shí)間對(duì)改性明膠耐酶解性的影響，其結(jié)果如圖4所示。

圖3 改性溫度對(duì)改性明膠耐酶解性影響Fig.3 The effect of temperature on hydrolysis ratio of modified gelatin

由圖4可知，隨著改性時(shí)間的延長(zhǎng)水解度先降低再升高，改性時(shí)間30 min 時(shí)水解度達(dá)到最低。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間有利于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與底物充分接觸，使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與明膠的賴氨酸和谷氨酰胺發(fā)生交聯(lián)[21-22]，說(shuō)明增加改性時(shí)間有利于降低改性明膠的水解度，提高改性明膠的耐酶解性。然而，持續(xù)增加改性時(shí)間，導(dǎo)致水解度升高，這可能與長(zhǎng)時(shí)間高溫處理導(dǎo)致轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶變性有關(guān)。改性時(shí)間為30 min 時(shí)，改性明膠的耐酶解性最好。

圖4 改性時(shí)間對(duì)改性明膠耐酶解性影響Fig.4 The effect of time on hydrolysis ratio of modified gelatin

2.5 均勻試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度、改性pH 值、改性溫度和改性時(shí)間做4 因素5 水平的均勻試驗(yàn)。不同條件下水解度的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 均勻試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of uniform experimental design

采用偏最小二乘回歸分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度、改性pH 值、改性溫度和改性時(shí)間為自變量，水解度為因變量，利用DPSv15.10 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件建立改性明膠水解度預(yù)測(cè)模型：

y=9.9007241+190.453407x1-0.093988x2-0.623217 x3+ 0.008483 x4- 67343.284524 x12+0.001863 x22+0.108433x32-0.000006x42+3.276903x1x2-10.521066x1x3- 2.454853x1x4- 0.014831x2x3-0.000078x2x4-0.000671x3x4

所建立模型的R2為0.9505，說(shuō)明該模型擬合度較好，方程在給定的試驗(yàn)范圍內(nèi)有較高的可信度。根據(jù)偏最小二乘法回歸系數(shù)分析各因素對(duì)水解度的影響程度為：x1（轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度）＞x4（改性時(shí)間）＞x2（改性pH 值）＞x3（改性溫度）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可信度，根據(jù)模型給出的最優(yōu)制備條件（轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的質(zhì)量濃度0.20 g/L、改性pH 值6.0、改性溫度44°C，改性時(shí)間35 min），對(duì)模型預(yù)測(cè)的水解度與實(shí)際測(cè)得的水解度進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。模型預(yù)測(cè)的水解度和實(shí)際獲得的水解度之間相對(duì)誤差較小，說(shuō)明通過(guò)偏最小二乘法回歸所建立的模型可信度高。

表3 最優(yōu)制備條件下預(yù)測(cè)水解度與實(shí)測(cè)水解度Table3 Predicted and experimental hydrolysis ratios under the optimal indexes

3 結(jié)論

采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性明膠可以顯著提高明膠的耐酶解性。改性明膠的耐酶解性受轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度、改性pH 值、改性溫度、改性時(shí)間等多種因素的影響。通過(guò)均勻試驗(yàn)優(yōu)化得到最優(yōu)的改性條件為：轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶質(zhì)量濃度為0.20 g/L，改性pH 6.0，改性溫度44°C，改性時(shí)間35 min。所建立的模型預(yù)測(cè)改性明膠在經(jīng)木瓜蛋白酶處理60 min 后預(yù)測(cè)水解度為4.89%，實(shí)測(cè)水解度為5.08%，相對(duì)誤差為3.74%，說(shuō)明所建立模型可信度高。本研究結(jié)果表明通過(guò)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性可以顯著提高明膠的耐酶解性，然而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與明膠之間的作用機(jī)理及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)仍不明確，需進(jìn)一步研究。