張 宇 姜毓君 黨芳芳 潘瑞麗 陳思涵 林官根 張雅碩 滿朝新 張 微

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150030）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，Ⅱ型糖尿病患病人群約占總患病人數(shù)的90%以上，因胰島素抵抗或胰島素相對(duì)不足而造成高血糖，并往往伴有其他并發(fā)癥[1]。研究表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島細(xì)胞受損及外周胰島素抵抗，是產(chǎn)生高血糖的重要原因[2]。氧化應(yīng)激還可以激活相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)控相關(guān)因子表達(dá)，調(diào)節(jié)糖代謝水平[3]。

目前常見的降血糖藥有磺脲類藥物、雙胍類藥物、胰島素增敏劑和α-葡萄糖苷酶抑制劑等藥物。這些藥物在治療疾病的同時(shí)也易引起一些副作用，如：頭暈、頭痛、腹痛、腸脹氣和腹瀉等不良反應(yīng)[4]。近年來有研究表明益生菌具有一定的降糖功效。例如：孟曉等[5]研究表明植物乳桿菌SCS1 可以降低高血糖水平，并顯著提高葡萄糖耐量。Yadav 等[6]證實(shí)嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌有效降低糖尿病大鼠的血脂水平。

本試驗(yàn)中采用的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，L.paracasei）TD062 是由實(shí)驗(yàn)室工作人員分離自西藏地區(qū)的乳制品中。通過灌胃不同濃度的副干酪乳桿菌TD062，研究其對(duì)Ⅱ型糖尿病模型小鼠的體重、臟器指數(shù)、血糖水平、葡萄糖耐受性和抗氧化指標(biāo)的影響。通過測(cè)定胰島素信號(hào)通路中的相關(guān)基因表達(dá)水平，探究其降血糖機(jī)制，為副干酪乳桿菌應(yīng)用于保健食品研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌TD062，從西藏地區(qū)發(fā)酵乳制品中篩選、分離、保存；3 周齡C57BL/6J 雄性小鼠及高脂高糖飼料，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ），美國(guó)Sigma 公司；MRS 培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；肝糖原、超氧化物歧化酶（superoxide diamutase，SOD）、丙 二 醛（malonyldialdehyde，MDA）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit 和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒，寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀及試紙，艾科生物技術(shù)有限公司；ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)Applied Biosystems 公司；DHP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)菌種制備 將保存于-80 ℃的副干酪乳桿菌TD062 按3%接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化3 代后，在4 ℃條件下6 000×g 離心5 min，棄上清，將菌泥用滅菌的生理鹽水洗滌兩次，然后懸浮于pH 7.4 的0.01 mmol/L 生理鹽水中，調(diào)整菌含量為109，108CFU/mL 和107CFU/mL，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高血糖模型小鼠誘導(dǎo)和分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用40 只雄性C57BL/6J，鼠齡3 周左右，隨機(jī)分為5 組（每組8 只）：正常組（N）、模型組（DM）、高劑量組（H）、中劑量組（M）和低劑量組（L）。鼠房溫度（22 ± 2）℃，濕度（55±5）%，12 h 晝夜交替，基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。從第2 周開始，DM、H、M和L 組喂養(yǎng)高脂高糖飼料。3 周后，DM、H、M 和L 組腹腔注射STZ 100 mg/kg，建立糖尿病模型，N組注射相同劑量的檸檬酸緩沖液作為對(duì)照。造模1 周后，測(cè)定小鼠隨機(jī)血糖，以血糖值高于11.1 mmol/L 的為模型成功小鼠。以10 ml/kg 的劑量分別灌胃H、M 和L 組109，108CFU/mL 和107CFU/mL 副干酪乳桿菌TD062，N 組和DM 組灌胃相同劑量的生理鹽水。

1.3.3 小鼠體重的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第1 周開始至結(jié)束期間每周測(cè)定小鼠體重。

1.3.4 小鼠血糖值及糖耐量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第1 周開始至結(jié)束期間每周測(cè)定小鼠血糖值。實(shí)驗(yàn)第13 周時(shí)，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，以2 g/kg 的劑量灌胃葡萄糖溶液，分別測(cè)定0，15，、30，60，90 min 和120 min 時(shí)小鼠血糖值，計(jì)算葡萄糖曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.3.5 動(dòng)物血液及組織采集和處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，5 組小鼠均隔夜禁食12 h，稱重，眼球取血，將血液樣品在4 ℃條件下3 000×g 離心10 min，收集血清置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)小鼠眼球取血后，斷頸處死。解剖并迅速取出肝臟、脾臟和腎臟于冰冷的生理鹽水中沖洗，用濾紙吸干后稱重，按下列公式計(jì)算小鼠的臟器指數(shù)：

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體重（100 g）。

1.3.6 血清中糖尿病相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 采用酶標(biāo)儀測(cè)定小鼠血清中糖基化血紅蛋白和胰島素的含量，具體方法參見相應(yīng)的試劑盒說明書。

1.3.7 肝臟中相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 按照Sadi 等[7]的方法制備肝勻漿。肝臟組織與0.1 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液按質(zhì)量比1∶10 的比例混勻，用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，10 000×g 離心10 min，收集上清液，測(cè)定SOD、MDA、GSH-Px 和肝糖原的含量。

1.3.8 糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）基因表達(dá)量的測(cè)定 按照動(dòng)物組織RNA 提取試劑盒說明書提取小鼠肝臟中RNA，用核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA 濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR 分析，引物序列為：β-actin-F：5’-CGTGAAAAGATGACCCAGA-3’；β-actin-R：5’-GTCCATCACAATGCCTGT-3’；GSK-3β-F：5’-GCCAATGCAGAGGTCCTAAA-3’；GSK-3β-R：5’-CGAAAGGGAAGAGAAGGTAACA-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為顯著差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)小鼠體重的影響

副干酪乳桿菌TD062 對(duì)小鼠體重的影響見圖1。實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠體重先增加后趨于平緩。在1～4 周時(shí)，喂食高脂高糖飼料的小鼠體重不斷增加，且始終高于正常飲食的小鼠體重。第5 周時(shí)，小鼠腹腔注射STZ 誘導(dǎo)糖尿病模型，結(jié)果糖尿病小鼠體重連續(xù)3 周出現(xiàn)下降趨勢(shì)，推測(cè)可能是STZ 藥效發(fā)揮的時(shí)間較長(zhǎng)，小鼠耐受性較差所致。從第8 周開始，糖尿病小鼠體重開始持續(xù)性上升，灌胃高劑量副干酪乳桿菌TD062 的小鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯高于低劑量組、中劑量組和模型組，且具有顯著性差異（P＜0.05）。初步推測(cè)副干酪乳桿菌TD062 對(duì)糖尿病癥狀具有良好的改善作用。

2.2 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)小鼠血糖值的影響

由圖2可以看出，腹腔注射STZ 后，小鼠血糖值迅速增加且遠(yuǎn)高于正常水平，說明糖尿病小鼠模型誘導(dǎo)成功。在灌胃1～2 周（實(shí)驗(yàn)第6～7 周）時(shí)，小鼠血糖值變化不明顯，推測(cè)是由于注射STZ 對(duì)小鼠的影響遠(yuǎn)大于副干酪乳桿菌TD062 的改善作用或者是因?yàn)楣辔笗r(shí)間較短，所以效果不明顯。從灌胃第3 周（實(shí)驗(yàn)第8 周）開始，小鼠血糖值出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，且灌胃高劑量副干酪乳桿菌TD062 組的血糖值顯著低于中劑量和低劑量組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，灌胃高劑量組的小鼠血糖值降至11.7 mmol/L，而模型組小鼠血糖值高達(dá)20.3 mmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明副干酪乳桿菌TD062可在一定程度上降低高血糖水平，延緩糖尿病的發(fā)生。這與Manaer 等[8]研究的雙峰駝駝乳可以改善糖尿病小鼠血糖值的結(jié)果一致。

圖1 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)小鼠體重的影響Fig.1 Effect of L.paracasei TD062 on body weight of diabetic mice

圖2 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)小鼠血糖值的影響Fig.2 Effect of L.paracasei TD062 on glucose of diabetic mice

2.3 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)小鼠糖耐量的影響

通過口服糖耐量實(shí)驗(yàn)了解胰島β 細(xì)胞功能和機(jī)體對(duì)葡萄糖的調(diào)節(jié)能力[9]，該方法被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。從圖3a 可以看出，正常組小鼠在灌胃葡萄糖15 min 時(shí)血糖值達(dá)到頂峰值（10.7 mmol/L），然后迅速下降并恢復(fù)至正常值。其它4組的血糖均在30 min 時(shí)達(dá)到最大值，且和正常組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。灌胃葡萄糖30 min 后，血糖開始呈緩慢下降趨勢(shì)，2 h 后血糖值仍未恢復(fù)至原始狀態(tài)。AUC 葡萄糖代表葡萄糖曲線下面積，可以直觀地判斷機(jī)體對(duì)葡萄糖的耐受性。從圖3b 可以看出，糖尿病小鼠的AUC 葡萄糖明顯高于正常組。與模型組相比，高劑量和中劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），低劑量組雖在一定程度上可以增強(qiáng)葡萄糖耐受能力，但變化不明顯。試驗(yàn)結(jié)果表明副干酪乳桿菌TD062 可以改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐受性，且這種作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖3 副干酪乳桿菌TD062 小鼠糖耐量的影響Fig.3 Effect of L.paracasei TD062 on glucose tolerance of diabetic mice

2.4 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

肝臟是糖代謝發(fā)生的主要器官，在機(jī)體血糖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮很重要的作用[10]。與正常組相比，患病組中的肝臟指數(shù)增加，說明糖尿病小鼠出現(xiàn)明顯的肝臟腫脹現(xiàn)象，導(dǎo)致肝臟功能異常。由表1可知，副干酪乳桿菌TD062 灌胃8 周后，患病組小鼠肝臟指數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中灌胃高劑量組中肝臟指數(shù)下降趨勢(shì)最明顯（P＜0.05），中劑量組次之。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，是細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。由表1可以看出，患病組中出現(xiàn)脾臟增大現(xiàn)象，可能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低。經(jīng)副干酪乳桿菌TD062 干預(yù)后，高、中、低劑量組可顯著性降低脾臟指數(shù)（P＜0.05），增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。同時(shí)，副干酪乳桿菌TD062 也可抑制腎臟指數(shù)的增加，與模型組相比，治療組不具有顯著性差異（P＞0.05）。綜上，副干酪乳桿菌TD062 可在一定程度上抑制臟器指數(shù)的增加，對(duì)器官具有一定的保護(hù)作用，減少糖尿病并發(fā)癥。

2.5 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)糖尿病相關(guān)指標(biāo)的影響

胰島素是由胰島β 細(xì)胞分泌而來，主要作用在肝臟、肌肉和脂肪中，控制著體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)、脂肪的合成和代謝。胰島素具有促進(jìn)肝糖原合成，降低血糖的功能。圖4a 顯示，患病組中胰島素含量明顯高于正常組，這可能是由于體內(nèi)存在胰島素抵抗，造成胰島素不能被機(jī)體組織有效利用，因此發(fā)生胰島素代償性增加的現(xiàn)象。副干酪乳桿菌TD062 灌胃8 周后，小鼠體內(nèi)胰島素含量降低，可能是胰島素抵抗減輕，機(jī)體組織對(duì)胰島素的利用增加，因此胰島素的合成與分泌減少。Tabuchi等[11]研究表明鼠李糖乳桿菌可以顯著降低Ⅱ型糖尿病小鼠中的胰島素水平，這與本研究結(jié)果一致。

表1 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響Table1 Effect of L.paracasei TD062 on organ coefficient of diabetic mice

糖基化血紅蛋白可反映一段時(shí)間內(nèi)的平均血糖濃度。從圖4b 可以看出，與正常組相比，患病組中的糖基化血紅蛋白水平明顯增加（P＜0.05），灌胃副干酪乳桿菌TD062 后，糖基化血紅蛋白水平呈下降趨勢(shì)，其中高劑量組中的下降趨勢(shì)最明顯，中、低劑量組次之，說明副干酪乳桿菌TD062 具有降低血糖的作用并表現(xiàn)為劑量依賴性。

圖4 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)胰島素和糖基化血紅蛋白含量的影響Fig.4 Effect of L.paracasei TD062 on the levels of glycosylated hemoglobin and insulin

2.6 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)肝臟指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激可以損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 等大分子物質(zhì)，是疾病和衰老的重要因素[6]。氧化應(yīng)激易導(dǎo)致自由基產(chǎn)生和抵御機(jī)制之間的不平衡，直接損傷胰島β 細(xì)胞[12]。同時(shí)，由高血糖引起的活性氧簇活化與破壞胰島素信號(hào)通路導(dǎo)致胰島素抵抗，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[13-14]。Li 等[15]研究表明植物乳桿菌X1 能夠提高糖尿病小鼠的抗氧化能力，改善胰腺受損情況。由表2可知，模型組中SOD 和GSH-Px 的含量明顯下降，自由基清除能力降低。MDA 是脂質(zhì)過氧化物的重要產(chǎn)物，可以反映機(jī)體組織受到自由基攻擊的程度。與正常組相比，模型組中的MDA 含量高于正常水平。副干酪乳桿菌TD062 干預(yù)8 周后，SOD 和GSH-Px 的含量顯著提高，MDA 含量明顯下降。結(jié)果表明，副干酪乳桿菌TD062 可以提高肝臟抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化程度，保護(hù)機(jī)體免受自由基的攻擊。

肝糖原的主要合成部位為肝臟，胰島素抵抗抑制肝糖原的生物合成，造成機(jī)體外周葡萄糖水平升高，外周葡萄糖水平的升高又會(huì)加劇胰島素抵抗，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。由表2可知，經(jīng)副干酪乳桿菌TD062 干預(yù)后，糖尿病小鼠中的肝糖原含量增加，這可能是由于胰島素抵抗減輕，機(jī)體對(duì)胰島素的利用增強(qiáng)，同時(shí)肝臟指數(shù)降低，肝臟腫脹現(xiàn)象減弱，肝功能增強(qiáng)，從而使肝糖原含量增加。

表2 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)糖尿病小鼠肝臟中抗氧化指標(biāo)和肝糖原含量的影響Table2 Effect of L.paracasei TD062 on liver antioxidant index and glycogen levels

2.7 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)GSK-3β 表達(dá)量的影響

GSK-3β 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在糖代謝和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用。胰島素與細(xì)胞表面的胰島素受體結(jié)合后，促使胰島素信號(hào)通路發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使PI3K 和Akt 發(fā)生磷酸化，活化PI3K/Akt 信號(hào)通路[16-17]。研究表明，活化的Akt 可以磷酸化GSK-3β 并使之失活，肝糖原合成酶因此發(fā)生去磷酸化，恢復(fù)催化肝糖原合成的能力，增加肝糖原含量，降低血糖水平[18]。糖原合成酶是糖原合成過程中的限速酶，其上游信號(hào)分子GSK-3β 通過調(diào)控糖原合成酶的磷酸化狀態(tài)，從而改變合成肝糖原的能力。由圖5可知，患病組中的GSK-3β 相對(duì)表達(dá)量增加，副干酪乳桿菌TD062 干預(yù)8 周后，小鼠肝臟中GSK-3β 的相對(duì)表達(dá)量下降，說明副干酪乳桿菌TD062 可能通過調(diào)控胰島素信號(hào)通路改善胰島素抵抗，從而使糖原合成酶的活性提高，調(diào)節(jié)糖代謝水平，增加肝糖原含量。這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

3 結(jié)論

圖5 副干酪乳桿菌TD062 對(duì)肝臟中GSK-3β表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of L.paracasei TD062 on relative expression of GSK-3β in liver

本研究表明，副干酪乳桿菌TD062 可在一定程度上改善Ⅱ型糖尿病癥狀和相關(guān)指標(biāo)。初步推測(cè)是由于副干酪乳桿菌TD062 通過調(diào)控胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)相關(guān)因子的表達(dá)，從而改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)糖代謝。同時(shí)通過提高Ⅱ型糖尿病中的氧化應(yīng)激水平，可有效預(yù)防Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。