羅舜菁 胡 迪 黃克愁 吳建永 胡秀婷 郭寶忠 劉成梅

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室 南昌330047）

稻米中約60%的營養(yǎng)成分富集于米糠，包括豐富的膳食纖維、維生素、礦質(zhì)元素、谷維素及多種活性物質(zhì)[1]。然而，米糠中富含脂肪和脂肪酶，在脫糠過程中二者因機(jī)械碾磨作用而發(fā)生接觸，導(dǎo)致快速的酶解酸敗反應(yīng)[2]。米糠酸敗過程中產(chǎn)生多種初級和二級分解產(chǎn)物，包括脂肪酸、過氧化物、短碳鏈化合物和腐敗性氣味物質(zhì)等，使米糠保質(zhì)期僅有14 d 左右[3-4]，嚴(yán)重阻礙米糠的開發(fā)利用。鈍化或抑制米糠中的脂肪酶活性可有效延長米糠貨架期。目前鈍化或抑制米糠脂肪酶的方法主要有擠壓法、微波法、歐姆加熱法、化學(xué)法、蛋白酶法和冷藏法等[5-6]。其中，擠壓法鈍酶效果較好，研究最為普遍，然而，擠壓過程中米糠與氧接觸，使米糠中富含的一些易氧化的活性物質(zhì)如生育酚和谷維素含量均有不同程度的降低[7-8]。

過熱蒸汽（SS）是一種高于飽和溫度或沸點(diǎn)溫度的水蒸汽，其在食品中的應(yīng)用正日益受到關(guān)注，SS 的優(yōu)點(diǎn)包括無氧性、熱效率高和鈍酶速率快等[9]。Head[10]采用110 ℃的SS 處理燕麥10～14 min，能有效鈍化燕麥中的過氧化物酶，鈍酶后的燕麥具有良好的儲藏性。Wu 等[11]也發(fā)現(xiàn)SS 處理能顯著提升輕碾米的儲藏穩(wěn)定性，抑制脂肪酸值、過氧化值和羰基值的升高。本實(shí)驗室研究人員前期研究發(fā)現(xiàn)SS 處理能有效鈍化米糠中的脂肪酶，同時不破壞米糠中易氧化的活性物質(zhì)，而SS 對米糠營養(yǎng)性質(zhì)與儲藏穩(wěn)定性的影響鮮有研究報道。綜上所述，本研究擬采用120～160 ℃的SS 處理米糠1～5 min，以脂肪酶活性為判定指標(biāo)，選取鈍化脂肪酶效果好的米糠樣品，與原米糠為對照，考察SS 處理對米糠的營養(yǎng)性質(zhì)（總酚含量、總抗氧化性、酚酸組成變化、α-生育酚含量、γ-谷維素含量）和儲藏穩(wěn)定性（脂肪酸值、過氧化值、羰基值）的影響，為SS 作為一種新的米糠穩(wěn)定方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻谷：淮稻5 號，購于江蘇省高科種業(yè)科技有限公司。新鮮米糠：稻谷經(jīng)礱谷、碾磨后收集的米糠。

2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）和色譜級甲醇、乙腈及冰乙酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚，北京索萊寶科技有限公司；水溶性維生素E（Trolox）、沒食子酸、α-生育酚、DPPH、ABTS+等標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma 公司；谷維素標(biāo)準(zhǔn)品，大連美侖生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

過熱蒸汽-熱空氣聯(lián)用型實(shí)驗設(shè)備，本實(shí)驗室自主研制；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；紫外-可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀（1260 infinity series），Agilent 公司；氮吹儀，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 過熱蒸汽處理和樣品制備 采用過熱蒸汽-熱空氣聯(lián)用型實(shí)驗設(shè)備對米糠進(jìn)行SS 處理。進(jìn)樣器由若干層金屬網(wǎng)組成，每層金屬網(wǎng)均有氣流通過，將米糠（30 g）單層鋪于金屬網(wǎng)，使米糠均勻受熱。處理溫度分別設(shè)為120，130，140，150，160 ℃，SS 氣體流速設(shè)定為1.00 m/s。進(jìn)樣器插入處理室前先將處理室預(yù)熱至設(shè)定的試驗溫度，達(dá)到設(shè)定溫度后將裝有米糠樣品的進(jìn)樣器插入處理室，立刻開始計時，每個溫度下分別處理1，2，3，4，5 min，處理完畢后測定。經(jīng)過120，130，140，150，160 ℃的SS 處理的米糠分別標(biāo)記為BR-120，BR-130，BR-140，BR-150，BR-160。未經(jīng)過SS 處理的原米糠作為對照組，標(biāo)記為BR。

1.3.2 基礎(chǔ)成分測定 水分：GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定 直接干燥法》[12]；蛋白質(zhì)：GB 5009.5-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定 凱氏定氮法》[13]；脂肪：GB 5009.6-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定 索式抽提法》[14]；淀粉：GB 5009.9-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測定 酶水解法》[15]；膳食纖維：GB 5009.88-2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測定 酶重量法》[16]。

1.3.3 脂肪酶活性的測定 參照GB/T 5523-2008 《糧油檢驗 糧食、油料的脂肪酶活動度的測定》[17]，加入純油脂與樣品中所含的脂肪酶反應(yīng)，通過氫氧化鉀滴定法測定生成的脂肪酸含量，從而間接得出脂肪酶活性。酸堿指示劑為酚酞。

以脂肪酶活性為指標(biāo)，考察過熱蒸汽對米糠脂肪酶活性鈍化的效果。選取鈍化脂肪酶效果好的米糠樣品，與原米糠對照，考察其營養(yǎng)性質(zhì)（總酚含量、總抗氧化性、酚酸組成變化、α-生育酚含量、γ-谷維素含量）和儲藏穩(wěn)定性（脂肪酸值、過氧化值、羰基值）。

1.3.4 總酚含量與體外抗氧化性的測定 游離酚的提取參考Adom 等[18]的方法。取3.00 g 樣品，分別用20 mL 80%乙醇提取兩次，每次磁力攪拌10 min，然后4 500 r/min 離心5 min，合并上清液，在45 ℃下旋蒸至干，用80%乙醇定容于25 mL 容量瓶中，在4 ℃下保存。

結(jié)合酚的提取參考張金宏等[19]的方法。將提取完游離酚后的殘渣烘干，稱取1.00 g，加入15 mL 正己烷混勻后離心，傾去上清液，加入40 mL 2 mol/L NaoH，充入氮?dú)饷芊夂?，?0 ℃搖床上消化4 h，隨后用2 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至2。將酸性上清液轉(zhuǎn)移至干凈的分液漏斗中，殘渣用10 mL 超純水洗滌并離心，將上清液與酸性上清液合并，用10 mL 乙酸乙酯萃取3 次。合并乙酸乙酯層，于40 ℃下旋蒸至干后，用50%甲醇溶解定容于5 mL 容量瓶中，4 ℃下保存。

總酚含量的測定參照Singleton[20]的方法并稍作調(diào)整。于10 mL 比色管中加入1 mL 去離子水，然后加入250 μL 多酚提取液和250 μL 福林酚試劑，室溫下反應(yīng)6 min 后加入2.5 mL 70 mg/mL Na2CO3溶液終止反應(yīng)。隨后加入去離子水至刻度后混合均勻，在室溫下避光放置90 min，于波長760 nm 處測定吸光度?？瞻讟悠窞槿ルx子水。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量用每克樣品（干重）中所含的沒食子酸物質(zhì)的量表示，單位為mg/g。

體外抗氧化的測定參照Xu 等[21]的方法，采用FRAP、DPPH、ABTS+3 種抗氧化方法進(jìn)行測定。

1.3.5 米糠酚酸組成的測定 酚酸組成的測定參照Gong 等[22]方法。將游離酚和結(jié)合酚提取物過0.45 μm 濾膜，采用裝有DAD 檢測器的超高效液相色譜進(jìn)行色譜分析。酚酸在裝有Agilent Eclipse XDB-C18（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）保護(hù)柱的反相Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱上分離。流動相由A（2%乙酸）和B（乙腈）組成，采用以下的洗脫程序：0～2 min，10% B；2～20 min，10%～13% B；20～35 min，13%～20% B；35～45 min，20%～35% B；45～80 min，35%～45%B；80～93 min，45%～100%B；93～98 min，100%～8%B；98～105 min，8%B。設(shè)定流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。紫外檢測器檢測波長設(shè)為280 nm。通過對比標(biāo)準(zhǔn)物的相對保留時間和紫外光譜來鑒定樣品的酚酸種類，采用外標(biāo)法對酚酸定量，結(jié)果用每克樣品（干重）所含的酚酸含量表示，單位為μg/g。

1.3.6 α-生育酚含量的測定 參照王凌云等[23]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1.00 g 米糠試樣于試管中，加入10 mL 1 mg/mL 2，6－二叔丁基對甲酚的乙醇溶液和1 mL 100 mg/mL 抗壞血酸溶液，于超聲波清洗器中提取。10 min 后用2 mL 0.5 g/mL氫氧化鉀皂化，皂化液用乙酸乙酯萃取3 次，收集有機(jī)相，并在有機(jī)相中加入少量無水硫酸鈉，在氮吹儀上吹至近干，復(fù)溶于1 mL 甲醇，過0.45 μm濾膜后上機(jī)測定。色譜柱采用Agilent Eclipse XDB-C18（12.5 mm×4.6 mm，5.6）；流動相為甲醇（色譜級）-水（96/4，V/V），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃；紫外檢測器波長設(shè)為295 nm。

1.3.7 γ-谷維素含量的測定 參照Srisaipet 等[24]的方法測定。稱取1.00 g 米糠，加入4 mL 正庚烷，磁力攪拌30 min，3 000 r/min 離心5 min 后收集上清液，氮吹儀吹干后，用正庚烷定容于5 mL 容量瓶中。測定時取0.2 mL 提取液加入5 mL 比色管中，用正庚烷定容5 mL 刻度線處。于波長313 nm處測定吸光度值，以吸光度值與谷維素含量之間的變化關(guān)系作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8 儲藏試驗方法 將原米糠（BR）和經(jīng)SS 鈍酶后的米糠〔BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）、BR-160（SS）〕自封袋包裝好后放入溫度25 ℃、相對濕度60%的恒溫恒濕箱內(nèi)，分別在0，1，2，3，5，7，9，13，17，21，25 周取樣，測定其脂肪酸值、過氧化值和羰基值。

脂肪酸值的測定：采用GB/T 20569-2006《稻谷儲存品質(zhì)判定規(guī)則》[25]測定。脂肪酸值以中和100 g 干燥試樣物質(zhì)中游離脂肪酸所需氫氧化鉀的質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

過氧化值的測定：參照張玲等[26]方法提取米糠中的油脂。以沸程60～90 ℃的石油醚作為提取劑，液料比16∶1（mL/g），常溫提取6 h。過氧化值的測定參照Shantha 等[27]的方法。準(zhǔn)確稱取0.15 g 樣品于10 mL 比色管中，加入9.8 mL 體積比為7∶3的氯仿-甲醇，搖勻，再加入50 μL 的硫氰酸銨溶液，旋渦2～4 s，加入50 μL 亞鐵溶液，旋渦2～4 s，室溫反應(yīng)5 min 后于波長500 nm 處測定吸光度值?？瞻讟悠窞檎麴s水。過氧化值用meq O2/kg 脂肪表示。過氧化值計算公式：

式中：A1——樣品吸光度；A0——空白吸光度；M——樣品質(zhì)量（g）；ki——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)；55.84——鐵的相對原子量（g/mol）。

羰基值的測定：參照張玲等[26]方法提取米糠中的油脂。以沸程60～90 ℃的石油醚為提取劑，液料比16∶1（mL/g），常溫提取6 h。參照裘漢幸等[28]方法測定樣品的羰基值。準(zhǔn)確稱取樣品0.25 g，加甲苯定容于25 mL 容量瓶中，搖勻。準(zhǔn)確量取5 mL 容量瓶中的樣品，置于25 mL 比色管中，加入4.3%三氯醋酸的甲苯溶液5 mL 及0.05%2，4-二硝基苯肼的甲苯溶液5 mL，搖勻，60 ℃水浴30 min，取出，冷卻，加入10 mL 4%氫氧化鉀-乙醇溶液，加乙醇至25 mL 刻度線，搖勻，室溫放置10 min 后在波長453 nm 處測定吸光度?？瞻讟悠窞檎麴s水。羰基值以每1 kg 油脂中含羰基化合物的毫摩爾數(shù)表示，單位為mmol/kg，計算公式如下：

式中：A——吸光度；M——油脂的質(zhì)量，單位g；854——各種羰基化合物、2，4-二硝基苯肼衍生物的摩爾吸收系數(shù)平均值；V1——稀釋總體積，單位mL；V2——測定用體積，單位mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠成分分析

經(jīng)測定，新鮮米糠的主要成分見表1。

2.2 脂肪酶活性

由圖1可知，隨著SS 處理溫度的升高及處理時間的延長，脂肪酶活性逐漸降低。然而，120～160 ℃的SS 并不能完全鈍化脂肪酶，當(dāng)過熱蒸汽處理時間達(dá)到1 min 之后，繼續(xù)延長處理時間，脂肪酶酶活性下降幅度不大。這是因為脂肪酶包含一族脂溶性酶類，如磷脂酶、糖酶和酯酶等，部分脂肪酶類耐熱性極強(qiáng)，難以鈍化[29]。BR-120、BR-130、BR-140、BR-150 和BR-160 的 脂 肪 酶 活 性分別在SS 處理4，4，3，3 min 和2 min 后不再發(fā)生顯著變化（P＞0.05），即最佳鈍酶時間，稱為最佳鈍酶點(diǎn)米糠，按順序分別用BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）和BR-160（SS）表示。此時BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）和BR-160（SS）的脂肪酶活分別殘留30.99%，19.80%，16.07%，14.45%和13.41%。SS 處理溫度越高，脂肪酶鈍化效果越好。然而，BR-140（SS）、BR-150（SS）和BR-160（SS）的脂肪酶活殘留量相差不大，繼續(xù)升高SS 處理溫度雖可以降低脂肪酶殘留率，但高溫處理會使能耗大幅度增加。

表1 米糠主要成分Table1 The main components of rice bran

圖1 過熱蒸汽處理對米糠脂肪酶活性的影響Fig1 Effect of superheated steam treatment on lipase activity of rice bran

選取最佳鈍酶點(diǎn)米糠（固定排列順序為BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）、BR-160（SS）），與原米糠為對照，分別研究其營養(yǎng)性質(zhì)和儲藏穩(wěn)定性。

2.3 總酚含量和總抗氧化性

SS 處理得到最佳鈍酶點(diǎn)米糠的總酚含量顯著上升（P＜0.05），其上升幅度分別為6.08%，5.57%，3.28%，3.27%，2.93%，其中BR-120（SS）的總酚含量最高（10.41 mg/g），其次為BR-130（SS）（10.34 mg/g）。

本研究中使用ABTS+（圖2b）、DPPH（圖2c）和FRAP（圖2d）3 種方法測定米糠抗氧化性[30]。這些測定方法均表明，BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）、BR-160（SS）與BR 相比其抗氧化性均顯著上升（P＜0.05），其中BR-120（SS）的總抗氧化性最高（ABTS+12.14 mg/g，DPPH 4.26 mg/g，F(xiàn)RAP 11.58 mg/g），其 次 為BR-130（SS）（ABTS+11.93 mg/g，DPPH 4.25 mg/g，F(xiàn)RAP 11.18 mg/g），而原米糠BR 的總抗氧化性最低（ABTS+11.26 mg/g，DPPH 4.04 mg/g，F(xiàn)RAP 10.51 mg/g）。該結(jié)果與總酚含量變化趨勢一致，表明總抗氧化性和總酚含量之間有較強(qiáng)相關(guān)性。

2.4 酚酸組成

表2為鈍酶前、后米糠的自由和結(jié)合酚酸組成。BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）、BR-160（SS）與BR 相比，其總酚酸含量（自由+結(jié)合）分別提高了10.31%，7.86%，4.32%，2.99%，2.31%，其中綠原酸、香草酸、咖啡酸和香豆酸的總量（自由+結(jié)合）沒有顯著變化（P＞0.05），阿魏酸與對羥基苯甲酸的總量（自由+結(jié)合）則有顯著提高（P＞0.05）。140～160 ℃SS 最佳鈍酶點(diǎn)處樣品的總酚酸含量增幅小于120～130 ℃的，這是由于溫度過高，酚酸發(fā)生降解。采用合適的溫度，有利于提高米糠的總酚酸含量。

圖2 原米糠與最佳鈍酶點(diǎn)米糠總酚含量和抗氧化性Fig.2 Total phenol content and antioxidant activity of rice bran and the best passivation lipase point rice bran

表2 原米糠與最佳鈍酶點(diǎn)米糠酚酸組成的變化Table2 Changes of the phenolic acid composition in Rice Bran and the best passivation lipase point rice bran

（續(xù)表2）

2.5 α-生育酚與γ-谷維素含量

如圖3a 和3b 所示，BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）、BR-160（SS）與BR 相比，其α-生育酚和γ-谷維素含量均無顯著性變化（P＞0.05），表明SS 處理不會降低米糠中的α-生育酚和γ-谷維素含量。

加工過程的升溫通常導(dǎo)致α-生育酚和γ-谷維素的氧化，從而大大地降低α-生育酚和γ-谷維素含量。研究表明，采用擠壓等方法處理米糠均使α-生育酚和γ-谷維素含量較大幅度地降低[7-8]。SS處理雖然和紅外、擠壓處理一樣同屬于熱加工，但是SS 無氧特性，米糠在SS 的環(huán)境下處理可避免或抑制其活性成分發(fā)生高溫氧化。以上結(jié)果表明，與其它熱處理方法相比，SS 處理可更有效保留米糠中的α-生育酚和γ-谷維素。

2.6 儲藏試驗

研究表明，脂類在米糠儲存過程中會發(fā)生3類酸敗。第1 類，脂肪酶水解三?；视?，生成游離脂肪酸（水解酸?。?。第2 類，不飽和的脂肪酸被脂肪氧化酶氧化，釋放氫過氧化物（早期氧化酸?。?。第3 類，釋放的氫過氧化物不穩(wěn)定，繼續(xù)分解成羰基化合物、烴、呋喃等，造成米糠腐敗味（晚期氧化酸?。11]。儲存期間米糠的游離脂肪酸、氫過氧化物和羰基化合物的含量變化可分別用來表征米糠的3 類酸敗。

圖3 原米糠與最佳鈍酶點(diǎn)米糠α-生育酚和γ-谷維素含量Fig.3 Contents of α-tocopherol and γ-oryzanol in Rice Bran and the best passivation lipase point rice bran

儲藏25 周，BR 的脂肪酸值以較快的速率從2.3 g/100 g 升至13.6 g/100 g，而BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）、BR-160（SS）的脂肪酸值分別是BR 的36.0%，27.6%，23.6%，22.9%，21.9%（圖4a），表明SS 可以有效抑制米糠的水解酸敗。

圖4 原米糠與最佳鈍酶點(diǎn)米糠儲藏期間脂肪酸值、過氧化值、羰基值Fig.4 Fatty acid value，peroxide value and carbonyl value of rice bran and the best passivation lipase point rice bran during storage

BR 的過氧化值圖呈“M”型，分別在第2 周和第9 周達(dá)到峰值，第2 個峰值后過氧化值逐漸降低。在25 周時，BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）、BR-160（SS）的過氧化值分別是BR 的50.0%，47.1%，46.7%，46.2%，44.3%（圖4b），表明SS 可以有效抑制米糠的早期氧化酸敗。

BR 的羰基值在前2 周略微增加（從11.6 mmol/kg 增至16.9 mmol/kg），在后續(xù)的23 周中顯著增加（從16.9 增至69.4 mmol/kg）。第25 周時，BR-120（SS）、BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）與BR-160（SS）的羰基值只有BR 的30.3%，26.1%，24.6%，22.5%，22.1%（圖4c），表明SS 可以有效抑制米糠的晚期氧化酸敗。

BR-120（SS）的脂肪酸值、過氧化值和羰基值比BR-130（SS）、BR-140（SS）、BR-150（SS）和BR-160（SS）的略高，這可能是由于BR-120（SS）樣品中的脂肪酶殘余活度較高所致（圖1）。

3 結(jié)論

經(jīng)120～160 ℃的SS 處理可使米糠脂肪酶活性降至30.99%～13.41%。與BR 相比，最佳鈍酶點(diǎn)米糠的總酚含量和總抗氧化性顯著提高；總酚酸含量提高10.31%～2.31%，且主要貢獻(xiàn)為阿魏酸和對羥基苯甲酸；α-生育酚和γ-谷維素含量無顯著下降。第25 周時，最佳鈍酶點(diǎn)米糠的脂肪酸值、過氧化值、羰基值分別是BR 的36.0%～21.9%，50.0%～44.3%，30.3%～22.1%，表明SS 處理能有效延長米糠儲藏期。綜合考慮米糠營養(yǎng)性質(zhì)和貯藏穩(wěn)定性，采用130 ℃的SS 處理4 min 的米糠最佳，此時米糠營養(yǎng)性能提高幅度較大，且儲藏性較好。