解長遠，王中江，郭增旺，翟宇玉，滕 飛*，李 楊*

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白營養(yǎng)價值高，有著良好的功能特性[1]。根據(jù)沉降系數(shù)，大豆中的蛋白質(zhì)可分為2S、7S、11S和15S蛋白。7S與11S球蛋白占大豆蛋白質(zhì)量70%左右，對大豆蛋白營養(yǎng)價值與功能特性的影響起決定作用[2]。11S球蛋白中含有豐富的含硫氨基酸，其含量遠高于7S球蛋白，人體自身無法合成的蛋氨酸可以通過攝入含硫氨基酸來補充。相較于7S球蛋白，11S球蛋白中的疏水性氨基酸也更多，對其乳化性影響更大[3]。此外，11S球蛋白能促進凝膠的形成，對凝膠咀嚼性、硬度和持水性的影響更為明顯[4]。目前，各國學者對大豆蛋白的功能性質(zhì)研究很多，但對11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系研究卻鮮見報道。

近年來，通過高壓、空化、射流、高溫等手段對蛋白改性的技術(shù)受到廣泛關(guān)注[5]。呂博等[6-7]發(fā)現(xiàn)利用高壓均質(zhì)可改變大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)，改善蛋白的凝膠特性。李楊等[8]發(fā)現(xiàn)利用超聲形成的空化效應可改善大豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性。許艷華等[9]研究表明利用微射流技術(shù)可提高大豆蛋白的起泡穩(wěn)定性、溶解度和吸油性。曾劍華等[10]研究表明大豆蛋白的溶解性與乳化性可通過熱處理來改善。射流空化技術(shù)作為一種高新技術(shù)，在食品領(lǐng)域開始受到關(guān)注，射流空化形成的空化效應以及在其流道內(nèi)產(chǎn)生的高速湍流剪切、瞬間流道高壓力差、分子對沖撞擊效應，使射流空化腔體內(nèi)形成空化場、高壓場、射流場、高溫場等多重物理場效應，將超聲、高壓均質(zhì)、射流、熱處理等技術(shù)的優(yōu)勢集為一體[11-14];因此利用射流空化技術(shù)可對大豆蛋白產(chǎn)生強烈的沖擊作用，但目前還鮮見應用于改性大豆蛋白領(lǐng)域。

本實驗通過分析在不同處理時間和蛋白質(zhì)量濃度下，射流空化技術(shù)對大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響，探究大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性之間的構(gòu)效關(guān)系，為射流空化技術(shù)在蛋白改性方面的應用提供理論參考，并為高功能性大豆蛋白產(chǎn)品的開發(fā)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粉（蛋白干基質(zhì)量分數(shù)55%） 哈高科大豆食品有限責任公司;8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海譜振生物科技有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS） 北京索萊寶科技有限公司;Lowry法蛋白定量檢測試劑盒 上海荔達生物科技有限公司;2,4-二硝基苯肼、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）美國Sigma-Aldrich公司;亞硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1C型冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;FJ-200型高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠;DFS-Dairy-001型均質(zhì)機 帝斯曼（中國）有限公司;LGR20-W型臺式高速冷凍離心機 北京京立離心機有限公司;PALS型激光粒度分析儀 美國布魯克海文儀器公司;F-4500熒光分光光度計 日本日立公司;MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力公司;2L實驗室小型射流空化機 北京中森匯嘉科技發(fā)展有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 11S球蛋白提取及樣品制備

參考Nagano等[15]的方法，脫脂大豆粉與去離子水以料液比1∶15混合，用氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至7.5，攪拌1 h后10 000 r/min離心15 min，取上清液加入亞硫酸鈉使其終質(zhì)量濃度為0.98 g/L，攪拌1 h后用鹽酸溶液將pH值調(diào)至6.4，于4 ℃環(huán)境下靜置過夜，12 000 r/min離心20 min，將所得沉淀物冷凍干燥，所得即為大豆11S球蛋白（純度為93.27%）。

用超純水配制質(zhì)量濃度分別為2 g/100 mL與5 g/100 mL的大豆11S球蛋白溶液，用1 mol/L鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液將溶液pH值調(diào)至7.0后，置于射流空化機內(nèi)處理0、2、4、6、8、10、15、20 min后，冷凍干燥得大豆11S球蛋白樣品。

1.3.2 熒光光譜測定

參照王中江等[16]的方法。將蛋白樣品溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的蛋白溶液，測定條件為激發(fā)光譜290 nm，發(fā)射波長300～450 nm，夾縫寬度均為5.0 nm。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜測定

參照Surewicz等[17]的方法。稱取樣品2 mg，加入100 mg溴化鉀，壓片后測定。測定條件：環(huán)境溫度25 ℃，掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64 次。

1.3.4 表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法[18]。將蛋白樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的蛋白溶液，充分混合后10 000 r/min離心30 min，用相同濃度的磷酸鹽緩沖液，稀釋上清液至質(zhì)量濃度為0.07～0.67 mg/mL（用Lowry法測定溶液中蛋白質(zhì)量濃度[19]）。取不同質(zhì)量濃度的蛋白溶液4 mL，加入40 μL 8 mmol/L ANS溶液，混勻后靜置3 min，測定樣品的熒光強度。測定條件為激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長490 nm，夾縫寬度均為5 nm。以熒光強度對蛋白質(zhì)量濃度作曲線，曲線的初始斜率即為蛋白的表面疏水性。

1.3.5 巰基和二硫鍵含量的測定

參考Shimada等[20]的方法。游離巰基含量：用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液將樣品配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的蛋白溶液，取2 mL蛋白溶液，加入5 mL Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、4 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，pH 8.0）中，再加入0.10 mL 0.01 mol/L Ellman試劑，混勻后在25 ℃下反應15 min，測定其在412 nm波長處的吸光度?？値€基含量：取2 mL 20 mg/mL蛋白溶液，加入5 mL Tris-Gly緩沖液（含8 mol/L尿素和質(zhì)量分數(shù)0.5% SDS），再加入0.10 mL 0.01 mol/L Ellman試劑，混勻后在25℃下反應15 min，測定其在412 nm波長處的吸光度。兩種測定方法均以不加Ellman試劑的溶液作為空白對照。巰基與二硫鍵含量分別按式（1）、（2）計算。

式中：1.36×104為Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））;A412nm為樣品溶液在412 nm波長處的吸光度;n為稀釋倍數(shù);ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 羰基含量測定

參考Lertittikul等[21]的方法。取0.2 mL 5 mg/mL蛋白溶液，加入0.5 mL含10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼的HCl溶液（2 mol/L）混合，于30 ℃水浴鍋中反應1 h。在各樣品中加入0.5 mL質(zhì)量分數(shù)40%的三氯乙酸溶液，混勻后靜置10 min，10 000 r/min離心20 min，所得沉淀用1 mL的乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗滌3 次，將蛋白懸浮于0.6 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中，于37 ℃水浴鍋中保溫30 min。以不含2,4-二硝基苯肼的溶液為空白對照，用分光光度計測定其在350～390 nm范圍內(nèi)的最大吸光度，摩爾消光系數(shù)為22 000/（L/（mol·cm）），用最大吸光度計算羰基含量，以每克蛋白質(zhì)所含羰基物質(zhì)的量表示（μmol/g）。

1.3.7 溶解度測定

將蛋白樣品溶于去離子水中，配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的蛋白溶液，攪拌1 h后于12 000 r/min下離心20 min，上清液經(jīng)適度稀釋后，采用Lowry法測定其蛋白質(zhì)量[19]。溶解度按式（3）計算。

1.3.8 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

參照Tang等[22]的方法。將蛋白樣品配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，與大豆油以體積比3∶1混合，以10 000 r/min乳化1 min后，取50 μL加入到5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1% SDS溶液中混勻。在500 nm波長處分別測定0 min和30 min時乳液的吸光度。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）及乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）分別按式（4）、（5）計算。

式中：T為反應速率常數(shù)（2.303）;A0為0 min時乳液吸光度;A30為靜止30 min后的乳液吸光度;n為稀釋倍數(shù)（100）;ρ為乳化液形成前蛋白水溶液中的蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）;φ為乳化液中油體積分數(shù)/%。

1.3.9 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定

參考Watanabe等[23]的方法，將100 mL 1 g/100 mL的蛋白溶液以17 500 r/min均質(zhì)2 min，記錄均質(zhì)后泡沫體積與靜置30 min后泡沫體積。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別按式（6）、（7）計算。

式中：V0為均質(zhì)后泡沫體積/mL;V1為蛋白溶液體積（100 mL）;V30為靜置30 min后泡沫體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用OriginPro 8.5軟件制圖，使用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析和方差分析，P＜0.05為差異顯著。每個實驗重復3 次，結(jié)果表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白的最大吸收波長與熒光強度的影響

表 1 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白的最大吸收波長（λmax）與熒光強度的影響Table 1 Effect of jet cavitation treatment time on maximum absorption wavelength (λmax) and fluorescence intensity of 11S globulin at different concentrations

如表1所示，隨著射流空化處理時間的延長，2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白的熒光λmax均呈先紅移后藍移的趨勢，熒光強度呈先升高后降低的趨勢，且在處理時間為6 min時紅移距離和熒光強度均達到最大;在不同射流空化處理時間下，5 g/100 mL大豆11S球蛋白λmax均大于2 g/100 mL。這可能是因為隨著處理時間的延長，射流空化產(chǎn)生的高速湍流剪切、分子對沖撞擊效應以及流道內(nèi)部的高壓力差，使蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸展開，部分處于分子內(nèi)部疏水環(huán)境的色氨酸殘基暴露在外部親水環(huán)境中，使熒光強度增大并出現(xiàn)λmax紅移現(xiàn)象[24]。但繼續(xù)延長處理時間，大豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)進一步展開，蛋白分子間的次級鍵、共價鍵以及疏水相互作用等使蛋白發(fā)生聚集，部分色氨酸殘基被包埋，生色基團轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境中，使熒光強度下降，λmax藍移。而5 g/100 mL大豆11S球蛋白的亞基或多肽鏈之間相互接觸機率比2 g/100 mL時大，高質(zhì)量濃度的蛋白溶液更易在射流空化腔體內(nèi)發(fā)生有效碰撞，使5 g/100 mL大豆11S球蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露程度更大，并隨著處理時間的延長，聚集也更加明顯。這表明射流空化技術(shù)可以調(diào)控蛋白分子的解聚和聚集，且與射流空化處理時間及蛋白質(zhì)量濃度有關(guān)。

2.2 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖 1 射流空化處理時間對2 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effect of jet cavitation treatment time on secondary structure of 2 g/100 mL 11S globulin

圖 2 射流空化處理時間對5 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effect of jet cavitation treatment time on secondary structure of 5 g/100 mL 11S globulin

表 2 射流空化處理時間對2 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 2 Effect of jet cavitation treatment time on secondary structure content of 2 g/100 mL 11S globulin

表 3 射流空化處理時間對5 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 3 Effect of jet cavitation treatment time on secondary structure content of 5 g/100 mL 11S globulin

對傅里葉變換紅外光譜圖（圖1、2）中的酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）進行去卷積、二階導數(shù)以及擬合處理，定量分析大豆11S球蛋白中的二級結(jié)構(gòu)含量，其結(jié)果如表2、3所示。隨射流空化處理時間的延長，2 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)變化規(guī)律為α-螺旋相對含量呈先下降后上升趨勢，β-折疊相對含量整體呈下降趨勢，β-轉(zhuǎn)角相對含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，無規(guī)卷曲相對含量變化不明顯;5 g/100 mL大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)變化規(guī)律為α-螺旋相對含量呈先下降后上升趨勢，β-折疊與β-轉(zhuǎn)角相對含量整體均呈下降趨勢，無規(guī)卷曲相對含量呈上升趨勢。這可能是由于在射流空化處理下，射流空化腔體內(nèi)的高剪切力、高壓力差以及空化效應等導致蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。由于α-螺旋與β-折疊相較于β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)卷曲呈現(xiàn)更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[25]，由此可以推測11S球蛋白在射流空化技術(shù)的處理下，結(jié)構(gòu)逐漸展開，分子間作用力受到破壞，從有序的結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦邮杷傻臓顟B(tài)，無序結(jié)構(gòu)增加，蛋白發(fā)生了解聚行為。5 g/100 mL大豆11S球蛋白的無規(guī)卷曲相對含量在射流空化處理下顯著升高（P＜0.05），由此可知高質(zhì)量濃度的蛋白溶液經(jīng)射流空化處理后，蛋白的二級結(jié)構(gòu)更加疏松，這是由于高質(zhì)量濃度蛋白溶液中蛋白分子之間的相互碰撞更劇烈，射流空化腔體內(nèi)的極端環(huán)境使蛋白結(jié)構(gòu)的打開程度更大，產(chǎn)生了更多的無序結(jié)構(gòu)，導致不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白的二級結(jié)構(gòu)在射流空化處理下出現(xiàn)差異。這表明射流空化技術(shù)可以改變大豆11S球蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

2.3 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白表面疏水性的影響

圖 3 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of jet cavitation treatment time on hydrophobicity of 11S globulin at different concentrations

如圖3所示，隨射流空化處理時間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白表面疏水性均呈先升高后降低的趨勢，且在處理時間為6 min時表面疏水性達到最高。這可能是因為隨射流空化處理時間的延長，11S球蛋白受射流空化腔體內(nèi)的空化場、射流場、高壓場、高溫場等多重物理場的作用，導致蛋白結(jié)構(gòu)打開，內(nèi)部包裹的疏水性基團暴露，表面疏水性提高;隨著射流空化處理時間的進一步延長，11S球蛋白在疏水相互作用下重新聚集，疏水基團的掩埋使蛋白的表面疏水性下降[26]。這與熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜的分析結(jié)果一致。而5 g/100 mL大豆11S球蛋白亞基或多肽鏈之間的有效碰撞比2 g/100 mL大豆11S球蛋白多，使高質(zhì)量濃度的蛋白溶液在射流空化處理過程中，蛋白內(nèi)部疏水區(qū)域的暴露程度更大，導致表面疏水性更高，使不同質(zhì)量濃度11S球蛋白的表面疏水性在射流空化處理下存在差異。這表明射流空化技術(shù)可以通過改變處理時間與蛋白質(zhì)量濃度影響大豆11S球蛋白的表面疏水性。

2.4 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白羰基含量的影響

圖 4 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白羰基含量的影響Fig. 4 Effect of jet cavitation treatment time on carbonyl content of 11S globulin at different concentrations

羰基含量的變化可反映出蛋白結(jié)構(gòu)中的羰基以及易被外界環(huán)境氧化成羰基的氨基酸側(cè)鏈（精氨酸、脯氨酸與賴氨酸等）的包埋和暴露情況[27]。因此，羰基含量可以反映蛋白的氧化程度和蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化。如圖4所示，隨射流空化處理時間的延長，2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白羰基含量呈先上升后下降趨勢。這可能是在射流空化處理初期，腔體內(nèi)的高溫、高壓力、高剪切力等極端環(huán)境使蛋白分子內(nèi)部的羰基，以及易被氧化生成羰基的氨基酸側(cè)鏈暴露，使羰基含量升高;延長處理時間，蛋白發(fā)生聚集，11S球蛋白的羰基與氨基酸側(cè)鏈被包埋，羰基含量下降。這表明射流空化處理可使11S球蛋白的結(jié)構(gòu)展開，其羰基以及易被氧化成羰基的氨基酸側(cè)鏈暴露。由于蛋白質(zhì)量濃度高，在射流空化處理過程中分子之間碰撞的機率更大，導致蛋白結(jié)構(gòu)的展開程度更大，使更多的羰基暴露出來，隨著處理時間的延長，已暴露的疏水基團使蛋白更易發(fā)生聚集，而這種聚集作用將蛋白分子的羰基與已被氧化成羰基的氨基酸側(cè)鏈包埋在聚集體內(nèi)部，導致在不同處理時間和不同質(zhì)量濃度下大豆11S球蛋白的羰基含量存在差異。

2.5 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響

蛋白中巰基含量對其結(jié)構(gòu)的影響較大，巰基形成的二硫鍵是維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的重要化學鍵。如圖5、6所示，隨射流空化處理時間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白中游離巰基含量呈先上升后下降的趨勢，二硫鍵含量呈先下降后上升的趨勢，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白經(jīng)射流空化處理后的游離巰基含量比2 g/100 mL大豆11S球蛋白高，二硫鍵含量比2 g/100 mL大豆11S球蛋白低。這表明射流空化產(chǎn)生的空化效應、高速剪切以及湍流作用使11S球蛋白分子伸展，維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的二硫鍵斷裂，內(nèi)部巰基暴露到蛋白分子表面，游離巰基的含量升高使蛋白表面疏水性升高，提高了蛋白的表面活性，使蛋白的乳化特性與起泡特性得到改善;繼續(xù)射流空化處理，蛋白發(fā)生聚集，蛋白分子暴露的游離巰基形成了二硫鍵[28]。高質(zhì)量濃度11S球蛋白溶液在射流空化腔體內(nèi)發(fā)生有效碰撞的機率高，在射流空化處理下，高質(zhì)量濃度蛋白溶液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露程度更大，因此經(jīng)射流空化處理后的5 g/100 mL大豆11S球蛋白的游離巰基含量更高，二硫鍵含量更低。

圖 5 射流空化處理時間對2 g/100 mL大豆11S球蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響Fig. 5 Effect of jet cavitation treatment time on the contents of free sulfhydryl groups and disulfide bonds in 2 g/100 mL 11S globulin

圖 6 射流空化處理時間對5 g/100 mL大豆11S球蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響Fig. 6 Effect of jet cavitation treatment time on the contents of free sulfhydryl groups and disulfide bonds in 5 g/100 mL 11S globulin

2.6 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度11S球蛋白溶解度的影響

如圖7所示，隨射流空化處理時間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白溶解度呈先升高后下降的趨勢，在處理時間為4 min時溶解度達到最大，且此時5 g/100 mL大豆11S球蛋白的溶解度高于2 g/100 mL大豆11S球蛋白，隨著處理時間的延長，溶解度略有下降，處理8～20 min時，2 g/100 mL大豆11S球蛋白的溶解度高于5 g/100 mL大豆11S球蛋白。蛋白的溶解度與其二級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)打開程度、親水基團暴露和分子間作用力有關(guān)。Zhao Yingying等[29]研究表明，蛋白中α-螺旋含量的減少可能導致分子間的相互作用發(fā)生變化，使蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序的狀態(tài)，提高其溶解性;任為聰?shù)萚30]認為超聲空化效應提高了蛋白質(zhì)溶解性，可能是由于空化作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，肽鍵斷裂，蛋白分子質(zhì)量減小，更多的親水性氨基酸處于外層;Chanasattru等[31]研究表明，空化效應可使球狀蛋白分子之間的相互作用力下降，使蛋白質(zhì)在溶劑中的可壓縮性增強，從而更易分散在溶劑中，增強其溶解性。這和本實驗上述蛋白結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果一致。這表明適當?shù)纳淞骺栈幚砜梢愿淖兊鞍椎亩壗Y(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，導致蛋白的無序結(jié)構(gòu)增多和親水基團相對增多，增強了蛋白與水的親和力，并降低了球狀蛋白分子之間的相互作用力，使蛋白更易分散在溶劑中，進而使蛋白的溶解性得到改善。但在長時間射流空化處理下腔體內(nèi)的剪切和撞擊作用增強了蛋白之間產(chǎn)生的分子間作用力，使蛋白發(fā)生聚集現(xiàn)象，導致蛋白的溶解度下降。由熒光光譜分析結(jié)果可知，在射流空化處理時間為4 min時，5 g/100 mL大豆11S球蛋白的展開程度比2 g/100 mL大豆11S球蛋白更大，與水的接觸面積也更大，使其溶解度更高，隨著處理時間的延長，11S球蛋白的聚集降低了其水合作用，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白更容易發(fā)生聚集，蛋白的水合作用降低程度也更大，因此在處理末期，2 g/100 mL大豆11S球蛋白表現(xiàn)出更好的溶解度。

圖 7 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度11S球蛋白溶解度的影響Fig. 7 Effect of jet cavitation treatment time on solubility of 11S globulin at different concentrations

2.7 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白乳化特性的影響

圖 8 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白EAI（A）和ESI（B）的影響Fig. 8 Effect of jet cavitation treatment time on emulsifying ability index (A)and emulsion stability index (B) of 11S globulin at different concentrations

由圖8可知，隨射流空化處理時間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白EAI與ESI均呈先升高后下降的趨勢，在處理6 min時達到最大，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白EAI與ESI均高于2 g/100 mL大豆11S球蛋白。研究表明，蛋白的乳化特性與其聚集狀態(tài)、表面疏水性以及巰基含量有關(guān);蛋白的解聚與二硫鍵的斷裂導致游離巰基含量升高，表面疏水性提高，使蛋白分子向油-水界面移動與重排的速率加快，提高了蛋白質(zhì)的界面活性[32-33]。這與上述熒光光譜、表面疏水性以及巰基含量的分析結(jié)果一致。這表明射流空化處理使蛋白發(fā)生解折疊行為，游離巰基含量升高，進而提高其表面疏水性，使蛋白在油-水界面更好地展開，改善其乳化特性。但處理時間進一步延長，蛋白之間產(chǎn)生分子間作用力，熒光光譜中λmax發(fā)生藍移，二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋相對含量上升，β-轉(zhuǎn)角相對含量下降，游離巰基交聯(lián)形成二硫鍵，處理末期蛋白發(fā)生聚集，疏水基團內(nèi)卷，其EAI和ESI也隨之下降。射流空化處理過程中，5 g/100 mL大豆11S球蛋白的乳化特性始終優(yōu)于2 g/100 mL大豆11S球蛋白，這是由于蛋白質(zhì)的乳化特性主要與其表面疏水性有關(guān)[34]。上述結(jié)果表明，經(jīng)射流空化處理大豆11S球蛋白，高質(zhì)量濃度蛋白溶液的表面疏水性更高，導致5 g/100 mL 11S球蛋白的EAI及ESI均高于2 g/100 mL 11S球蛋白。

2.8 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白起泡特性的影響

由圖9可知，隨射流空化處理時間的延長，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白起泡性呈先升高后下降的趨勢，且在處理6 min時起泡性達到最高，兩種質(zhì)量濃度11S球蛋白的泡沫穩(wěn)定性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。蛋白質(zhì)的起泡性與其巰基含量、兩親性以及蛋白的聚集狀態(tài)有關(guān)。蛋白中游離巰基含量的增加使其表面疏水性增強，導致蛋白在氣-液界面的表面張力降低，且蛋白分子的展開促進了蛋白在氣-液界面重排，形成具有黏彈性的薄膜，進而改善了蛋白的起泡性[35-36]。由上述結(jié)果可知，射流空化處理可使蛋白中二硫鍵斷裂，游離巰基含量上升，內(nèi)部疏水基團暴露在分子表面，使蛋白分子在氣-液界面的定向排列更加有序;由熒光光譜與傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果可知，射流空化使蛋白發(fā)生解聚，從有序的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)楦邮杷傻臓顟B(tài)，伸展的蛋白分子間相互作用形成更穩(wěn)定的二維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和界面膜，使泡沫更好地形成并進一步穩(wěn)定[37-38]。延長射流空化處理時間，大豆11S球蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，射流空化的過度處理使蛋白發(fā)生聚集，導致蛋白移動到氣-液界面的遷移速率降低，造成了起泡性降低。

圖 9 射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 9 Effect of jet cavitation treatment time on foaming capacity (A)and foam stability (B) of 11S globulin at different concentrations

在射流空化處理過程中，2 g/100 mL和5 g/100 mL大豆11S球蛋白泡沫穩(wěn)定性呈逐漸升高的趨勢，可能是由于射流空化的高強度處理使其結(jié)構(gòu)更具柔性，阻止了泡沫的破裂。有研究表明，在高壓環(huán)境下，肽鏈可形成網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，能夠有效地提高泡沫穩(wěn)定性[39]。隨處理時間的延長，蛋白逐漸聚集，內(nèi)部疏水基團內(nèi)卷，降低了表面張力，起泡性下降，但泡沫穩(wěn)定性幾乎不變。熒光光譜分析結(jié)果表明，在射流空化處理末期蛋白的λmax發(fā)生藍移，蛋白發(fā)生聚集，提高了其黏性和柔韌性，形成的氣-液界面更致密，可有效防止因外部形變而導致界面膜破裂的現(xiàn)象，提高泡沫穩(wěn)定性。Guo Fengxian等[40]的研究也發(fā)現(xiàn)了蛋白聚集體能夠提高蛋白的泡沫穩(wěn)定性。

在射流空化處理過程中，5 g/100 mL大豆11S球蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性總體高于2 g/100 mL，這可能是因為高質(zhì)量濃度蛋白的亞基或多肽鏈之間相互接觸機率更大，更易在射流空化腔體內(nèi)發(fā)生有效碰撞，導致蛋白結(jié)構(gòu)的打開程度更大，表面張力的降低使其更易在溶液界面相互作用成膜;延長處理時間，蛋白遷移到氣-液界面的速率降低，起泡性下降，而蛋白的聚集現(xiàn)象使蛋白在氣-液界面形成致密的界面膜，導致泡沫穩(wěn)定性升高，5 g/100 mL大豆11S球蛋白的聚集更加明顯，因此，不同質(zhì)量濃度11S球蛋白的起泡特性在射流空化處理下出現(xiàn)了差異。

3 結(jié) 論

以大豆11S球蛋白為研究對象，探究不同射流空化處理時間對不同質(zhì)量濃度的大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響。熒光光譜結(jié)果表明，2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白的熒光λmax呈先紅移后藍移的趨勢，熒光強度呈先升高后降低的趨勢，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白λmax均大于2 g/100 mL;傅里葉變換紅外光譜分析表明，2 g/100 mL大豆11S球蛋白的α-螺旋相對含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢、β-折疊相對含量呈現(xiàn)下降趨勢，β-轉(zhuǎn)角相對含量呈先上升后下降的趨勢，無規(guī)卷曲相對含量變化不明顯;5 g/100 mL大豆11S球蛋白的α-螺旋相對含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢、β-折疊與β-轉(zhuǎn)角相對含量呈下降趨勢，無規(guī)卷曲相對含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白表面疏水性、羰基與游離巰基含量均呈先升高后下降的趨勢，二硫鍵含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;以上結(jié)果表明，射流空化可使蛋白結(jié)構(gòu)展開，延長處理時間，蛋白逐漸聚集，質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的大豆11S球蛋白與2 g/100 mL相比，暴露程度更大，在蛋白發(fā)生聚集時也更加明顯。射流空化處理后2 g/100 mL與5 g/100 mL大豆11S球蛋白的溶解度、乳化特性與起泡特性均得到明顯改善，且5 g/100 mL大豆11S球蛋白的功能特性更佳，本實驗為深入了解射流空化改性大豆蛋白的作用機理提供了理論依據(jù)和參考。