潘偉平 王伊凡 應(yīng)李民 簡杰亮 楊繼成 葉金云 明建華

(湖州師范學院，湖州 313000)

在集約化和規(guī)?；乃a(chǎn)養(yǎng)殖中，主要通過投喂人工配合飼料來養(yǎng)殖水產(chǎn)動物，其中飼料投飼頻率是影響魚類生長及飼料效率的重要因素之一[1]。有關(guān)魚類投喂頻率的研究表明，適宜的投喂頻率可以增加魚類的生長速度和存活率，縮小體型差異，改善攝食轉(zhuǎn)換率，提高終產(chǎn)量；而不合理的投喂頻率不僅導(dǎo)致魚體參差不齊，還會造成飼料浪費，增加養(yǎng)殖成本，并污染養(yǎng)殖環(huán)境[2-4]。因此，確定適宜的投飼頻率對提高青魚養(yǎng)殖的經(jīng)濟和生態(tài)效益具有重要意義。

目前，有關(guān)黃顙魚(Pelteobaggrusvachelli)幼魚[5]、星斑川鰈(Platichthysstellatus)幼魚[6]等魚類的研究表明，適宜的投飼頻率可改善幼魚的攝食量并增加生長速度；而對鯉魚(Cyprinuscarpio)、長吻鮠(Leiocassislongirostris)的研究表明，適宜的投飼頻率可降低循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)水體氨氮類有毒有害物質(zhì)的含量，改善水質(zhì)，提高魚類的存活率[7]。青魚(MylopharyngodonpiceusRichardson)是我國傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一，據(jù)《2019中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》報道[8]，我國青魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量為69.13萬t，而目前有關(guān)投飼頻率對青魚相關(guān)影響的研究仍鮮見報道。因此，本試驗以青魚為研究對象，探討不同投飼頻率對青魚幼魚生長、生理生化指標以及攝食相關(guān)基因表達水平的影響，以便獲得青魚幼魚生長速度最快和飼料轉(zhuǎn)化率最佳的投飼頻率，為青魚的集約化養(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗青魚及放養(yǎng)

青魚幼魚購于湖州市吳興豐溢現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖場。試驗選擇450尾體質(zhì)健壯，規(guī)格基本一致的青魚幼魚，初始體質(zhì)量(12.29±0.40)g，隨機分成5組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚，飼養(yǎng)于本實驗室室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的15個養(yǎng)殖桶中。每桶水容積450 L，控制水流速為1.6 L/min，并通過氣石持續(xù)充氣增氧。

1.2 飼料制備與投喂

試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，各種原料分別粉碎過60目篩，采用逐級擴大法添加微量成分，使各組分充分混勻后，用小型飼料造粒機制成粒徑2 mm的沉性顆粒飼料，40 ℃烘干后于4 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

注：a表示購于企業(yè)；b為實測值。

飼養(yǎng)試驗中，前期馴化7 d，后期正式飼養(yǎng)60 d。采用人工投飼，日投飼量按魚體質(zhì)量的2～5%來計算，并控制在30 min內(nèi)無剩餌為宜，即表觀飽食。投飼頻率如下：(1)投喂1次/2 d，投喂時間為8:00；(2)投喂1次/d，投喂時間為8:00；(3)投喂2次/d，投喂時間為8:00、17:00；(4)投喂3次/d，投喂時間為8:00、12:30、17:00；(5)投喂4次/d，投喂時間為8:00、11:00、14:00、17:00。飼養(yǎng)期間水溫為26～29 ℃，pH為7.2～7.8，溶解氧>6 mg/L，氨氮<0.01 mg/L。

1.3 采樣與處理

正式飼養(yǎng)60 d后采樣，采樣前禁食24 h，將各桶魚稱重、計數(shù)，然后每桶隨機選取3尾體重相近的青魚，用濃度為100 mg/L的MS-222作快速深度麻醉，經(jīng)稱重和量體長后用一次性醫(yī)用注射器從尾靜脈采血。血樣在4 ℃冰箱中靜置1～2 h后，以4 ℃ 3 000 r/min離心10 min制備血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

魚體采血后立即剖開腹腔，剝離出內(nèi)臟和肝胰臟并稱重，取適量肝臟和腸道用于常規(guī)分析；取部分背鰭下方側(cè)線以上的背部肌肉用于肌肉成分分析；取適量腦組織，用于攝食相關(guān)基因的表達分析，均以-80 ℃保存。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長與形體指標

分別按下式計算增重率(WG)、特定生長率(SGR)、攝食率(FR)、飼料系數(shù)(FCR)、存活率(S)、肝體指數(shù)(HSI)、臟體指數(shù)(VSI)、肥滿度(CF)：

增重率(WG，%) = 100× (Wt-W0) /W0

特定生長率(SGR，%/d) = 100×(lnWt- lnW0) / t

攝食率(FR，%/d) = 100×FI/ [t×(Wt+W0)/2]

飼料系數(shù)(FCR) =FI/ (Wt-W0)

存活率(S，%) = 100 ×Nt/N0

肝體指數(shù)(HIS，%) = 100×Wh/Wb

臟體指數(shù)(VSI，%) = 100×Wv/Wb

式中：W0為魚初體質(zhì)量/g；Wt為魚末體質(zhì)量/g；t為飼喂天數(shù)/ d；FI每尾魚平均攝食飼料總質(zhì)量(風干樣重)/g；N0為初魚尾數(shù)；Nt末魚尾數(shù)；Wh為每尾魚末肝臟質(zhì)量/g；Wv為每尾魚末內(nèi)臟質(zhì)量/g；Wb為每尾魚末體質(zhì)量/g；L為每尾魚末體長/cm。

1.4.2 肌肉成分分析

水分采用105 ℃恒重法(GB 6435—1986)測定；粗蛋白質(zhì)含量采用微量凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定；粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)測定；粗灰分含量采用550 ℃灼燒法(GB/T 6438—1992)測定。

1.4.3 血清生化指標的測定

超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)、堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的活性等用南京建成生物工程研究所試劑盒，按照說明書進行測定。

1.4.4 肝臟抗氧化相關(guān)指標的測定

肝臟樣品解凍后，用冷生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重，肝臟樣品與勻漿介質(zhì)(pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%氯化鈉溶液)按1∶9 (W∶V)的比例冰浴勻漿，然后4 ℃ 3 800 r/min離心10 min，取上清液用于分析。該待測液的蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍法進行測定。SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)的水平等按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行測定。

1.4.5 腸道消化酶活性的測定

試驗采用田間小區(qū)法。2016年設(shè)上年秋季（10月中旬）覆膜、當年早春（4月初）覆膜兩個非生育期覆膜處理和常規(guī)播前（4月下旬）覆膜為對照。小區(qū)面積242 m2，小區(qū)寬11 m，小區(qū)長22 m，3次重復(fù)，隨機排列。專用機械覆膜，采用170 cm寬的黑色地膜。

測定前將腸組織樣品取出，在室溫下自然解凍，剔除脂肪和消化道內(nèi)含物。取全腸稱重，然后加入9倍冷卻的磷酸緩沖液(4 ℃，pH7.3)，冰浴勻漿(8 000 r/min，5 s/次，間隔10 s，連續(xù)4～5次)，取上清液置于4 ℃冰箱中待測(不超過24 h)。檢測腸道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的試劑盒購于南京建成生物工程研究所，按照說明書進行測定。

1.4.6 腦組織攝食相關(guān)基因的表達分析

使用組織/細胞RNA快速提取試劑盒(Aidlab，中國)抽提青魚腦組織總RNA，具體操作按試劑盒說明書進行，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，同時用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific，美國)核酸蛋白測定儀檢測RNA的純度和濃度，RNA樣品應(yīng)具有清晰完整的條帶、OD260/OD280為1.8～2.0。用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank上青魚腦組織攝食相關(guān)基因神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y, NPY)和腦腸肽(Ghrelin, GRL)的核苷酸序列，利用Primer 5.0設(shè)計上述基因及管家基因β-肌動蛋白(β-actin)的特異性引物，引物序列見表2。所有引物均由上海英濰捷基(Invitrogen)公司合成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較，P<0.05表示差異顯著。實驗結(jié)果以平均值±標準差(Means±SD)表示。

表2 實時定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 投飼頻率對青魚生長性能的影響

由表3可知，投飼3次/d的青魚幼魚增重率、特定生長率和攝食率顯著高于1、2次/d和1次/2d組(P<0.05)，而投飼3、4次/d之間的差異不顯著(P>0.05)；投飼4次/d的飼料系數(shù)顯著高于1次/2 d和1次/d(P<0.05)，而與其余各組之間的差異不顯著(P>0.05)；投飼3、4次/d組的青魚存活率顯著高于1次/2d組(P<0.05)，而其余各組間的差異不顯著(P>0.05)；投飼頻率對青魚幼魚的肝體指數(shù)、臟體指數(shù)與肥滿度無顯著影響(P>0.05)。由此可見，青魚幼魚每天投喂3次可顯著提高其增重率、特定生長率、攝食率和存活率，促進青魚幼魚的生長。

表3 投飼頻率對青魚生長及形體指標的影響

注：3個重復(fù)的平均值±標準差(SD)；9個樣本的平均值±SD；同行數(shù)據(jù)中有不同上標字母者表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

表4 投飼頻率對青魚肌肉成分的影響/%

注：表中值為9個樣本的平均值±SD；同一行數(shù)據(jù)中有不同上標字母者表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

表5 投飼頻率對青魚血清生化指標的影響

表6 投飼頻率對青魚肝臟抗氧化相關(guān)指標的影響

2.2 投飼頻率對青魚肌肉成分的影響

由表4可知，青魚幼魚肌肉粗脂肪的含量隨投飼頻率的增加而升高，與投飼1次/2 d相比，投飼4次/d可顯著提高青魚肌肉中粗脂肪的水平(P<0.05)，但投飼頻率對青魚幼魚肌肉的水分、粗蛋白和灰分無顯著影響(P>0.05)。

2.3 投飼頻率對青魚血清生化指標的影響

由表5可知，隨著投飼頻率的增加，血清中超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)和堿性磷酸酶(AKP)的活性呈升高的變化趨勢，而谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)呈下降的變化趨勢(P<0.05)，但對谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的活性無顯著影響(P>0.05)。投飼3次/d的超氧化物歧化酶活性顯著高于1、2次/d與1次/2 d組(P<0.05)，而3次/d與4次/d之間的差異不顯著(P>0.05)；投飼3、4次/d的溶菌酶活性顯著高于1次/2 d組的水平(P<0.05)，而與其他各組間的差異不顯著(P>0.05)；投飼2～4次/d的堿性磷酸酶活性顯著高于1次/d、1次/2 d組(P<0.05)，而投飼2～ 4次/d組之間的差異不顯著(P>0.05)；投飼1次/2 d的GPT活性顯著高于2～4次/d組(P<0.05)，而投飼2～4次/d組之間的差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，青魚幼魚每天投飼3次，可增強其非特異性免疫力。

2.4 投飼頻率對青魚肝臟抗氧化相關(guān)指標的影響

由表6可知，隨著投飼頻率的增加，青魚肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性呈上升的變化趨勢，而丙二醛含量呈現(xiàn)下降的變化趨勢。投飼3、4次/d的SOD活性顯著高于1次/2 d組(P<0.05)；投飼3次/d的谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于1次/d和1次/2 d的水平(P<0.05)；投飼2～ 4次/d組的過氧化氫酶的活性顯著高于1次/d和1次/2 d的水平(P<0.05)；投飼3、4次/d組的丙二醛含量顯著低于1次/d和1次/2 d的含量(P<0.05)。這表明青魚幼魚每天投飼3次，可增強其抗氧化能力。

2.5 投飼頻率對青魚腸道消化酶活性的影響

由表7可知，隨著投飼頻率的增加，腸道胰蛋白酶和脂肪酶的活性均呈下降的變化趨勢，而淀粉酶的活性呈升高的變化趨勢。投飼1次/2 d與1次/d組中胰蛋白酶活性顯著高于2～4次/d組的活性(P<0.05)；投飼1次/2 d組中脂肪酶活性顯著高于4次/d組(P<0.05)，而與其余各組間的差異不顯著(P>0.05)。投飼2～4次/d組中淀粉酶的活性顯著高于1次/d和1次/2 d組的水平(P<0.05)。由此可見，投飼3、4次/d可降低腸道胰蛋白酶和脂肪酶的活性，而增加淀粉酶的活性。

表7 投飼頻率對青魚腸道消化酶活性的影響

2.6 投飼頻率對青魚攝食相關(guān)基因表達的影響

由圖1可知，隨著投飼頻率的增加，青魚腦神經(jīng)肽Y(NPY)mRNA表達水平呈升高的變化趨勢。投飼3、4次/d組的NPY相對表達水平顯著高于投飼1次/2 d和1次/d組的水平(P<0.05)，而二者之間的表達水平無顯著差異(P>0.05)。

注：柱上不同字母表示同一基因在不同投飼頻率下表達水平的差異顯著(P< 0.05)，下同。圖1 投飼頻率對青魚腦神經(jīng)肽Y mRNA表達水平的影響

由圖2可知，隨著投飼頻率的增加，青魚腦腸肽(GRL)表達水平呈升高的變化趨勢。投飼3、4次/d組腦腸肽的表達水平顯著高于投飼1次/2 d、1次/d組的水平(P<0.05)，但這兩組之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 投飼頻率對青魚腦腸肽mRNA表達水平的影響

3 討論

3.1 投飼頻率對青魚生長的影響

研究表明，在適宜范圍內(nèi)，增加投飼頻率可顯著影響?zhàn)B殖魚類的增重率、存活率和飼料利用效率[2-4]。在本試驗中，投飼頻率為3、4次/d時，青魚幼魚的增重率、特定生長率、攝食率和存活率均顯著提高，但飼料系數(shù)也顯著提高。這與投喂頻率對大黃魚(Pseudosciaenacrocea)生長性能的影響的是一致的[10]。以前也有相關(guān)的研究報道，雜交魴幼魚投飼頻率從0.5次/d增加至3次/d時的相應(yīng)增重率顯著提高[11]，但飼料系數(shù)顯著下降，這與本研究不一致；南方鲇(Silurusmeridionalis)特定生長率也隨投飼頻率的增加而顯著提高，但飼料轉(zhuǎn)化率不受投飼頻率的影響[12]；樓寶等[13]發(fā)現(xiàn)，投飼頻率影響黑鯛的生長是由飼料轉(zhuǎn)化率的改變引起的，適宜投飼頻率隨著黑鯛魚體重的增加而提高，黑鯛魚種的適宜飼喂頻率為2次/d，黑鯛成魚的適宜飼喂頻率為4次/d。本試驗中，隨著投飼頻率的增加提高了攝食率，促進了青魚幼魚的生長，但飼料系數(shù)也顯著升高，由此可見，投飼頻率對青魚幼魚生長的影響并非是因為提高了飼料轉(zhuǎn)化率，而攝食率的提高可能才是投飼頻率影響青魚生長的主要因素[12]。

在本試驗中，投飼頻率對青魚幼魚的肝體指數(shù)、臟體指數(shù)和肥滿度等形體指標均沒有顯著影響。崔超等[14]報道，不同投飼頻率對俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedtii)幼魚的肝體指數(shù)和臟體指數(shù)沒有顯著影響，但投飼3、4次/d的肥滿度顯著高于投飼2、6次/d的水平；但紀文秀[15]研究表明，投飼頻率對點帶石斑魚(Epinephelusmalabaricus)的肥滿度沒有顯著影響。

在本研究中，隨著投飼頻率增加，青魚的增重率與飼料系數(shù)均有所提高，但4次/d組相對3次/d組的增重率不顯著，但飼料系數(shù)反而增加，此時其攝食量較高而飼料轉(zhuǎn)化效率較低，造成飼料的浪費。這說明在一定范圍內(nèi)，增加投飼頻率有助于青魚的生長，但過高的投飼頻率效果反而較差。這與崔超等[14]、紀文秀[15]、林艷[16]等的實驗結(jié)果一致。

3.2 投飼頻率對青魚肌肉成分、生理生化指標的影響

投飼頻率的增加使魚類攝食率也增加，而過多的營養(yǎng)物質(zhì)會形成脂肪儲積，魚類體重增加往往伴隨著體成分的改變，如脂肪含量增加[17]。在本試驗中，與投飼1次/2d相比，投飼4次/d可顯著提高青魚肌肉粗脂肪的水平，而其他成分無顯著變化。邱婷婷等[11]對雜交魴的研究中也發(fā)現(xiàn)，青魚肌肉粗脂肪含量受投飼頻率的影響較大，當投飼頻率由1次/2 d上升到4次/d時脂肪含量明顯增加，反映了魚體內(nèi)營養(yǎng)的積蓄量。本實驗結(jié)果也與在南方鲇[12]、鱸魚[18](Lateolabraxjaponicus)、大黃魚[19](Pseudosciaenacrocea)中的報道類似。而在星斑川鰈[6]的研究中，隨著投飼頻率增加，肌肉中粗蛋白和粗脂肪的含量均有所提高，可能與星斑川鰈饑餓時主要利用脂肪而青魚還可適當利用糖類有關(guān)[20]，吸收利用的飼料糖類可部分以體脂的形式儲存于魚體內(nèi)[17]。

超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(AKP)是魚類非特異性免疫的重要因子，在機體免疫防御中發(fā)揮重要作用[21]。溶菌酶是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子之一，它產(chǎn)生于嗜中性粒細胞和巨噬細胞，并被分泌到血液及粘液中發(fā)揮溶菌效應(yīng)，研究表明機體溶菌酶活性提高，其免疫力也相應(yīng)提高[22]。本試驗中，投飼3、4次/d顯著提高了青魚血清SOD、AKP以及溶菌酶的活性。林艷等[16]研究表明，投飼3、5次/d也可提高團頭魴(Megalobramaamblycephala)血漿堿性磷酸酶活性。Li等[23]報道，投飼3次/d可顯著提高團頭魴攻毒后血漿溶菌酶的活性。

動物機體在新陳代謝的過程中，活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生和消除保持著動態(tài)平衡，過多的自由基會引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物的主要成分，具有很強的生物毒性，會破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能[24]。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)可清除過多的自由基，減少脂質(zhì)的過氧化損傷[25]。本研究中，投飼3、4次/d可顯著提高青魚幼魚肝臟SOD、GPx和CAT的活性，增強魚體的抗氧化能力。以前也有類似的報道，投飼5、6次/d可顯著提高團頭魴肝臟GPx和CAT的活性，降低肝臟MDA的水平[23]；投飼6次/d也可顯著提高日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)肝胰腺SOD、GPx和CAT的活性[26]。

3.3 投飼頻率對青魚腸道消化酶活性的影響

不同動物的生態(tài)習性和攝食對象不同，其相應(yīng)的消化酶的性質(zhì)也會有所變化[27]。青魚為肉食性無胃魚類，主要消化部位中腸道蛋白酶的活性相對較高，青魚通過改變消化道內(nèi)各種酶的活性，達到積極利用營養(yǎng)物質(zhì)[28]。研究表明，提高投飼頻率(8次/d)可改善大黃魚幼體腸道消化酶的活性[19]；投飼頻率對瓦氏黃顙魚肝胰腺中的蛋白酶活性無顯著影響，而腸中蛋白酶活性則隨投飼頻率增加而顯著降低[5]；投飼頻率對俄羅斯鱘幼魚肝臟中胰蛋白酶的活性無顯著影響，但其淀粉酶和脂肪酶活性隨投飼頻率的增加而升高[14]。在本實驗中，隨著投飼頻率的增加，青魚腸道胰蛋白酶和脂肪酶活性呈下降的變化趨勢，而淀粉酶活性呈升高的變化趨勢。這可能在于減少投飼次數(shù)，導(dǎo)致適當?shù)酿囸I，有利于促進青魚對飼料營養(yǎng)成分的消化吸收[5]。

3.4 投飼頻率對青魚腦攝食相關(guān)基因表達的影響

神經(jīng)肽(NPY)和腦腸肽(GRL)是重要的攝食調(diào)節(jié)因子，均可促進動物的攝食，并調(diào)控生長激素的分泌，促進生長。馬冠奎[29]研究發(fā)現(xiàn)，向斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)腹部注射NPY可以促進魚體自身NPY及生長激素mRNA的表達。De等[30]向金魚體內(nèi)注射微量NPY，也可有效促進金魚的攝食行為。倪靜[31]對中華倒刺鲃(Barbodessinensis)的研究亦發(fā)現(xiàn)，促攝食物質(zhì)的強度與腦NPY的表達量呈正比。NPY能提高脂肪組織中脂蛋白脂肪酶和乙酰輔酶A羧化酶的活性，促進脂肪生成，引起體重增加，還能抑制動物褐色脂肪中交感神經(jīng)的興奮性，從而使產(chǎn)熱和耗能都減少。GRL是一種具有食欲促進作用的消化道分泌激素，廣泛參與生物體內(nèi)多種生理功能，包括促進攝食、生長激素的釋放等[32]。在本研究中，隨著投飼頻率的增加，青魚幼魚腦中NPY和GRL的表達水平均呈升高的變化趨勢，投飼3、4次/d的青魚腦NPY和GRL的表達水平較高，有助于促進青魚的生長。

4 結(jié)論

投飼3次/d可提高青魚幼魚的攝食率和存活率，促進青魚的生長，增強魚體的非特異性免疫力和抗氧化能力，提高攝食相關(guān)基因的表達水平，因此青魚幼魚的適宜投喂頻率為3次/d。