胡振陽(yáng) 都立輝 楊衛(wèi)民 劉凌平 袁 康 袁 建 鞠興榮

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，南京 210023) (國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量中心2，北京 100037)

我國(guó)每年都會(huì)儲(chǔ)藏和輪換大量糧食[1]，由于糧食生產(chǎn)的地區(qū)不均衡性，我國(guó)“北糧南運(yùn)”，糧食工程可達(dá)2億噸左右[2]。糧食生產(chǎn)中不可避免的攜帶的蟲卵和霉菌孢子，隨著糧食的收獲進(jìn)入儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)，造成了糧食安全隱患。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)估算，全世界因糧食等農(nóng)作物產(chǎn)品受霉菌污染所造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)千億美元，而我國(guó)每年因霉菌污染造成的糧食損失高達(dá)2 100萬(wàn)t，占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的4.2%，同時(shí)產(chǎn)毒霉菌產(chǎn)生的毒素對(duì)全世界25%的糧油作物造成污染[3]，甚至嚴(yán)重威脅人畜健康[4,5]。霉菌由于消耗其營(yíng)養(yǎng)成分, 快速繁殖造成糧食營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、加工工藝品質(zhì)等受到嚴(yán)重影響[6]。因此，糧食中霉菌污染的早期檢測(cè)是預(yù)防和控制糧食中霉菌污染的關(guān)鍵。由于霉菌不斷分解霉變糧食有機(jī)質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一些特征揮發(fā)性物質(zhì)，隨著糧食種類、污染霉菌的種類、污染程度的改變，這些代謝產(chǎn)物會(huì)發(fā)生變化，而這些揮發(fā)性物質(zhì)可作為糧食霉變的指標(biāo)[7,8]。

早期關(guān)于對(duì)不同含水量的小麥霉變檢測(cè)也證實(shí)霉變糧食的揮發(fā)性組分的特征性[9]。目前，多數(shù)研究側(cè)重于稻谷霉菌數(shù)量的定性區(qū)分[10,11]，缺乏對(duì)稻谷中霉菌自身特征性揮發(fā)性成分的研究。本研究利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對(duì)六種稻谷中常見霉菌的揮發(fā)性氣體物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，以期找出不同種類霉菌生長(zhǎng)階段的特異性揮發(fā)性物質(zhì)，來(lái)精確篩選霉菌種類，獲取早期預(yù)防糧食霉變的準(zhǔn)確信息，為糧食中進(jìn)一步霉菌的快速檢測(cè)及早期預(yù)警提供參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、標(biāo)準(zhǔn)菌株灰綠曲霉3.3975以及由南京財(cái)經(jīng)大學(xué)從稻谷中分出并經(jīng)基因鑒定的亮白曲霉菌株、橘灰青霉Pp、產(chǎn)黃青霉M31、尖孢鐮刀菌Pr、有毒鐮刀菌6株。

1.2 主要儀器

GC(7890A)-MS(5975C)氣質(zhì)聯(lián)用分析儀；50/30 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取頭；65 μm-PDMS/DVB固相微萃取頭；手動(dòng)SPME進(jìn)樣手柄； YX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器；WH-2微型旋渦混合儀；BCD-268WSV型冰箱；血球計(jì)數(shù)板；EX30生物顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 霉菌孢子懸浮液的收集與處理

將6種稻谷霉菌接種到經(jīng)120 ℃滅菌20 min的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，取5 mL的滅菌水于培養(yǎng)基表面。輕微振蕩后，移取培養(yǎng)基表面的孢子懸浮液于EP管中。將孢子懸浮液置于WH-2微型旋渦混合儀振蕩混勻20 s，取50 μL混勻的孢子懸浮液于清洗干凈的血球計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。將6種霉菌孢子懸浮液的孢子濃度用無(wú)菌水調(diào)至106個(gè)/mL數(shù)量級(jí)的濃度，置于-20 ℃冰箱中保藏備用。

2.2 霉菌的培養(yǎng)

以灰綠曲霉3.3975為例，分別取10 mL經(jīng)120 ℃滅菌20 min的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)分別置于2個(gè)100 mL的錐形瓶中，搖勻，共計(jì)得到2瓶的PDA培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后，取50 μL稻谷霉菌孢子懸浮液加入到裝有培養(yǎng)基的1個(gè)錐形瓶中，搖勻，剩余1瓶PDA培養(yǎng)基加入50 μL的無(wú)菌水做空白對(duì)照，用錫紙及無(wú)菌膜封住錐形瓶瓶口，28 ℃條件下培養(yǎng)，共培養(yǎng)15 d，每隔1 d進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析，其中每個(gè)樣品均檢測(cè)3次。其余5種稻谷霉菌培養(yǎng)條件同上。

2.3 GC-MS檢測(cè)

分別選取培養(yǎng)1、3、5、7、9、11、13 d和15 d的霉菌樣品及空白樣品進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析，把裝有樣品的錐形瓶置于30 ℃恒溫水浴鍋中平衡1 h，分別使用50/30 μm-PDMS/DVB/CAR和65 μm-PDMS/DVB兩種固相微萃取頭定期檢測(cè)樣品，所有實(shí)驗(yàn)均測(cè)定3次，將固相微萃取頭穿過無(wú)菌膜、錫紙的小孔插入到錐形瓶中，頂空萃取40 min后，將萃取頭迅速插入到GC-MS進(jìn)樣口中，250 ℃不分流模式下解析5 min。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，總流量為34 mL/min，隔墊吹掃流量為3 mL/min,載氣為氦氣，設(shè)定流速為1.0 mL/min，采用不分流的分流方式，GC-MS升溫程序見表1。

質(zhì)譜條件：接口溫度為280 ℃，離子源為EI，離子源溫度為230 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～400 amu，采集模式為全掃描。

表1 GC-MS升溫程序

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，并與NIST 08標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)匹配求得，統(tǒng)計(jì)匹配度大于80的揮發(fā)性成分。采用峰面積歸一化法，以各揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積占總峰面積的比值表示該物質(zhì)的相對(duì)含量。采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及繪圖。

3 結(jié)果與討論

通過對(duì)每個(gè)樣品GC-MS譜圖檢索結(jié)果中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分類，可分成烷類、烯類、醇類、酮類、醛類、酸酯類、雜環(huán)類及其他共七大類，與曹俊等[12]的研究結(jié)果基本一致，并對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)類別的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各個(gè)成分的含量變化趨勢(shì)以柱狀圖展示。

3.1 空白樣品揮發(fā)性物質(zhì)分析

由圖1可知，醛類物質(zhì)含量最高，其次是烷類物質(zhì)，醛類物質(zhì)基本先增加后減少，第7 d含量最多，其他類物質(zhì)變化趨勢(shì)不明顯。這方面兩種固相微萃取頭萃取所得結(jié)果相同，而酸酯類、醇類和酮類物質(zhì)含量在使用50/30 μm固相微萃取頭檢測(cè)時(shí)的結(jié)果比較低，這與65 μm固相微萃取頭萃取所得結(jié)果有些差異，說(shuō)明同樣培養(yǎng)基采用不同固相微萃取頭萃取所得的揮發(fā)性物質(zhì)也會(huì)不同，這應(yīng)主要與固相微萃取頭表面的纖維涂層有關(guān)，不同的纖維涂層可以吸附不同的物質(zhì)。

采用不同的固相微萃取頭可精準(zhǔn)篩選出同一真菌代謝途徑中生物合成的衍生化合物，例如，在同一培養(yǎng)介質(zhì)中始終能被檢測(cè)到的揮發(fā)性成分可作為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并鑒別霉菌污染的指示物。對(duì)典型揮發(fā)性指示物選取合適的傳感裝置，進(jìn)行構(gòu)建糧食中霉菌污染實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的系統(tǒng),并通過結(jié)合模式識(shí)別法可同時(shí)鑒別出霉菌種類，為后期實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供良好的參考價(jià)值。

圖1 空白樣品揮發(fā)性物質(zhì)分析

3.2 灰綠曲霉3.3975的揮發(fā)性物質(zhì)分析

由圖2a可知，第1 d，醛類物質(zhì)含量最高。這與對(duì)應(yīng)的空白樣品相同。第3/5 d，烯類物質(zhì)迅速增加，醛類物質(zhì)含量降至0，雜環(huán)類物質(zhì)有所增加。烷類物質(zhì)在整個(gè)過程中先增加后減少，第9 d含量最高；烯類物質(zhì)在霉菌生長(zhǎng)過程中，先減少后增加。與對(duì)應(yīng)的空白樣品相比較得出特殊性揮發(fā)性成分：1,3-二氯苯，1,4-二氯苯，雙環(huán)辛-1,3,5-三烯，吡嗪，1,3-二嗪。

圖2 灰綠曲霉3.3975的揮發(fā)性物質(zhì)分析

由圖2b可以看出，第1 d，醛類物質(zhì)最多，這同樣與相對(duì)應(yīng)的空白樣品的結(jié)果相似。第3 d，醛類物質(zhì)含量有所下降，雜環(huán)類物質(zhì)增加，與對(duì)應(yīng)的空白樣品相似，不同的是空白樣品醇類物質(zhì)增加，而培養(yǎng)灰綠曲霉3.3975樣品的醇類物質(zhì)幾乎不變，這與霉菌的生長(zhǎng)有關(guān)。第5 d，烷類物質(zhì)和醇類物質(zhì)迅速增加，而醛類物質(zhì)減少至0。此后揮發(fā)性物質(zhì)主要是烷類物質(zhì)，至15 d烯類物質(zhì)迅速增加。2種固相微萃取頭對(duì)灰綠曲霉3.3975的揮發(fā)物質(zhì)分析，同樣存在不可避免的差異性，但1,3-二氯苯、1,4-二氯苯兩種產(chǎn)物幾乎在每次的測(cè)定中均被顯著地穩(wěn)定檢測(cè)出，2種固相微萃取頭檢測(cè)互相佐證將其判定為特殊性揮發(fā)性成分。

3.3 亮白曲霉的揮發(fā)性物質(zhì)分析

由圖3a可知，第1 d醛類物質(zhì)含量最高，第3 d酮類含量為0，而烷類和烯類物質(zhì)含量較高，第5 d烯類物質(zhì)含量最高，此后烯類物質(zhì)減少，而醇類物質(zhì)逐漸增加。其特殊性揮發(fā)性物質(zhì)是十一烷、乙基苯、苯乙烯、檸檬烯、桉油精、1,3-二嗪。

由圖3b可知，第1 d醛類物質(zhì)相對(duì)含量最高，第3 d酮類物質(zhì)迅速增加，這一結(jié)果在2種萃取頭上獲得的結(jié)果差異較大，第5 d雜環(huán)類物質(zhì)和烷類物質(zhì)迅速增加，與用50/30 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取頭檢測(cè)不同的是，第5 d后雜環(huán)類相對(duì)含量減少，而烷類和醇類物質(zhì)含量較高。其特殊性揮發(fā)性成分以其烷類和醇類物質(zhì)為主，分別是十一烷、十二烷、二叔丁基對(duì)甲酚、桉油精，其中桉油精是一種醇類物質(zhì)。

圖3 亮白曲霉的揮發(fā)性物質(zhì)分析

3.4 橘灰青霉Pp的揮發(fā)性物質(zhì)分析

由圖4a可知，第3 d烷類物質(zhì)含量較高。得出的特殊揮發(fā)性物質(zhì)：檸檬烯、羅漢柏烯、1-乙基環(huán)戊烯、倍半水芹烯、2-甲氧基-3-(1-甲基乙基)吡嗪、2-甲氧基-3-(1-甲基丙基)吡嗪、2-甲氧基-3-(2-甲基丙基)吡嗪、十二烷、二十八烷、亞乙基環(huán)戊烷。

由圖4b可知，第1 d醛類物質(zhì)含量最高，此后主要為烯類和雜環(huán)類物質(zhì)，其特殊性揮發(fā)性成分為1-乙基環(huán)戊烯、α-柏木烯、羅漢柏烯、2-甲氧基-3-(2-甲基丙基)-吡嗪、2-甲基異莰醇、1,3-二甲氧基苯。1,3-二甲氧基苯可作為一種曲霉屬中雜色曲霉群特異性揮發(fā)性物質(zhì)的指標(biāo)。較早的研究發(fā)現(xiàn)，其僅在雜色曲霉菌培養(yǎng)過程中檢測(cè)到[13,14]。在本研究中，該化合物在橘灰青霉生長(zhǎng)代謝階段中同樣被檢測(cè)到，與Matysik等[15]在鏈格孢菌、擬青霉和各種青霉菌的頂空固相微萃取中檢測(cè)分析結(jié)果一致。

圖4 橘灰青霉Pp的揮發(fā)性物質(zhì)分析

3.5 產(chǎn)黃青霉M31的揮發(fā)性物質(zhì)分析

由圖5a可知，特殊揮發(fā)性成分有：鄰二甲苯、對(duì)二甲苯、乙苯、1,4-二氯苯、1,3-辛二烯、苯乙烯、雙環(huán)[4.2.0]辛-1,3,5-三烯、3-環(huán)庚烯-1-酮、1,3-二嗪，既有與65 μm固相微萃取頭萃取得到相同的物質(zhì)，也有不同的物質(zhì)?，F(xiàn)今被檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)，例如1-辛烯-3-醇、2-苯乙醇和1,3-二甲氧基苯，大多不同的真菌屬都可揮發(fā)產(chǎn)生[16]。

觀察圖5b可知，第1 d主要為醛類物質(zhì)，第3 d醛類物質(zhì)迅速下降，而烯類和烷類物質(zhì)顯著增加，此后揮發(fā)性物質(zhì)主要為烷類和烯類物質(zhì)。在第11 d烯類物質(zhì)含量很高，而此時(shí)烷類物質(zhì)含量很低。得出的特殊性揮發(fā)性物質(zhì)是：鄰二甲苯、對(duì)二甲苯、1,3-二甲苯、1,3-二氯苯、1,3-辛二烯、5-(1-甲基亞乙基)-1,3-環(huán)戊二烯。

圖5 產(chǎn)黃青霉M31的揮發(fā)性物質(zhì)分析

3.6 尖孢鐮刀菌Pr的揮發(fā)性物質(zhì)分析

觀察圖6a可知，對(duì)比65 μm固相微萃取頭的結(jié)果，物質(zhì)含量變化相似，得出的特殊揮發(fā)性物質(zhì)是檸檬烯、貝殼杉烯、十一烷、十二烷、1,3-二嗪。

由圖6b可知，第1 d醛類和烷類物質(zhì)含量較高，第3 d烯類和酸酯類物質(zhì)顯著增加，此后揮發(fā)性物質(zhì)主要是烯類物質(zhì)。得出的特殊揮發(fā)性成分有檸檬烯、貝殼杉烯、1,8-二甲基-4-(1-甲基乙烯基)螺[4.5]癸-7-烯、三十一烷、十四烷、1,3,5-三氯-2-甲氧基苯。

圖6 尖孢鐮刀菌Pr的揮發(fā)性物質(zhì)分析

3.7 有毒鐮刀菌的揮發(fā)性物質(zhì)分析

觀察圖7a可知，第1 d醛類物質(zhì)含量最高；第3 d主要是醛類和醇類物；第5天烷類、烯類、酸酯類物質(zhì)增多；第7 d雜環(huán)類物質(zhì)含量最高；第9 d主要是烷類、烯類和雜環(huán)類物質(zhì)；此后主要是酮類和醛類物質(zhì)。得到的主要揮發(fā)性物質(zhì)有1,3-二甲苯、乙苯、1-氯-2-甲氧基苯、1,3-二氯-2-甲氧基苯、2,4-二氯-5-氟苯乙酮、3-氯-4-甲氧基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、芐腈、萘。

1,3-二甲苯在Roussel等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)為曲霉屬的特異揮發(fā)性組分。這是首次在有毒鐮刀菌生長(zhǎng)代謝過程中檢測(cè)出1,3-二甲苯的存在，但50/30 μm-PDMS/DVB/CAR固相微萃取頭發(fā)現(xiàn)其作為主要揮發(fā)性成分，由于分析監(jiān)測(cè)的手段日益增多，多種揮發(fā)性組分也日益顯現(xiàn)，為后期實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)途徑提供不同真菌屬代謝組分，為快速定性定量檢測(cè)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

由圖7b可知，第1 d醛類物質(zhì)含量最高，第3 d酸酯類物質(zhì)顯著增加，5～9 d主要為烯類、酸酯類和雜環(huán)類及其他物質(zhì)，11 d后主要為酮類和醛類物質(zhì)，其特殊的揮發(fā)性物質(zhì)是三環(huán)庚烷、3-蒈烯、α-石竹烯、順式-α-紅沒藥烯、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、3-氯-4-甲氧基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、2,4-二氯-5-氟代苯乙酮、甲氧基乙酸，2-十四烷基酯。

圖7 有毒鐮刀菌的揮發(fā)性物質(zhì)分析

3.8 討論

GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，灰綠曲霉的醛類物質(zhì)由高到低，烯類物質(zhì)先減少后增加，烷類物質(zhì)先增加后減少；亮白曲霉醛類物質(zhì)由高到低，烯類物質(zhì)先增加后減少，醇類物質(zhì)含量逐漸增加；橘灰青霉前期醛類物質(zhì)含量最高，中后期主要為烯類和雜環(huán)類物質(zhì)；產(chǎn)黃青霉前期醛類物質(zhì)含量最高，中后期主要為烷類和烯類物質(zhì)；尖孢鐮刀菌前期醛類和烷類物質(zhì)，中期烯類和酸酯類物質(zhì)，后期主要是烯類物質(zhì)；有毒鐮刀菌前期醛類物質(zhì)，中期酸酯類物質(zhì)顯著增加，后期主要為烯類、酸酯類和雜環(huán)類及其他物質(zhì)。同種菌屬間不同生長(zhǎng)代謝階段揮發(fā)性物質(zhì)種類與含量差異顯著，而不同菌屬間的特征揮發(fā)性物質(zhì)差異更加顯著，表明微生物在生長(zhǎng)過程中，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類逐漸增加，相應(yīng)增加其特異性。

對(duì)于微生物產(chǎn)生復(fù)雜的揮發(fā)性組分而言，受關(guān)注度也漸漸顯露，但紛繁復(fù)雜的功能作用仍難以闡釋。本研究初步確定6種稻谷常見霉菌的特征揮發(fā)性物質(zhì)，但這些物質(zhì)在霉菌生長(zhǎng)階段的釋放機(jī)理尚不清楚, 可在今后的研究中進(jìn)行深入探討。揮發(fā)性組分在調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)、發(fā)育、防御以及作物間信號(hào)通路聯(lián)絡(luò)具有豐富的優(yōu)勢(shì)[18]。但報(bào)道稱，現(xiàn)已關(guān)注的10 000種微生物中，僅有400種能夠產(chǎn)生揮發(fā)性化合物[19]。本研究中的6種稻谷優(yōu)勢(shì)真菌在不同的頂空固相微萃取頭被檢測(cè)出的揮發(fā)性成分顯現(xiàn)出良好的特異性，將其對(duì)比研究參考，更有可能鑒定出對(duì)應(yīng)菌屬的生長(zhǎng)狀態(tài)，快速響應(yīng)糧食品質(zhì)的防控方案。此外，其揮發(fā)性組分被農(nóng)業(yè)科學(xué)家視為控制各種植物病原體的生物防治劑及作物生長(zhǎng)的生物肥料，在食品工業(yè)中，其生物防治特性被用于采后作物疾病預(yù)防。而關(guān)于被作為生物燃料的潛在來(lái)源的研究，微生物揮發(fā)性組分的優(yōu)勢(shì)更加突顯[20]。

4 結(jié)論

利用GC-MS技術(shù)，采用兩種不同的萃取頭對(duì)6種糧食儲(chǔ)藏過程中的特征霉菌在純培養(yǎng)基上生長(zhǎng)期間產(chǎn)生的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究。結(jié)果表明，6種常見稻谷霉菌生長(zhǎng)期間產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)主要是烷類、烯類、醇類、酮類、醛類、酸酯類、雜環(huán)類及其他等七大類。篩選出6種霉菌的特異性揮發(fā)性組分，其中，灰綠曲霉：1,3-二氯苯、1,4-二氯苯；亮白曲霉：十一烷、桉油精；橘灰青霉Pp：1-乙基環(huán)戊烯、2-甲氧基-3-(2-甲基丙基)-吡嗪；產(chǎn)黃青霉M31：鄰二甲苯、對(duì)二甲苯、1,3-辛二烯；尖孢鐮刀菌Pr：檸檬烯、貝殼杉烯；有毒鐮刀菌：3-氯-4-甲氧基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛。與僅通過二氧化碳的氣體濃度檢測(cè)霉菌的生長(zhǎng)相比，相應(yīng)霉菌特征成分的檢測(cè)更有可能鑒定到對(duì)應(yīng)霉菌種類的生長(zhǎng)，可通過構(gòu)建糧食中霉菌污染實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的系統(tǒng)鑒別出霉菌種類，尤其是霉菌的早期實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)，為糧食儲(chǔ)藏的精準(zhǔn)安全控制提供參考。