鄒文莉 牛文利 楊華應(yīng) 巫升鑫 周應(yīng)兵 余文 張興偉 吳新儒 丁安明 代常波 劉貫山 孫玉合 王衛(wèi)鋒

摘 ?要：煙草青枯病是一種典型的維管束細(xì)菌性病害，嚴(yán)重影響我國(guó)煙葉生產(chǎn)。為了解煙草青枯病抗性突變體的遺傳規(guī)律和開(kāi)發(fā)抗性相關(guān)分子標(biāo)記，本研究選用EMS誘變烤煙品種翠碧一號(hào)獲得的煙草青枯病抗性突變體486-K和117-K為研究對(duì)象，以翠碧一號(hào)和2個(gè)突變體為親本，構(gòu)建了兩個(gè)不同的雜交組合，采用卡方檢驗(yàn)和植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型分析方法，進(jìn)行群體遺傳效應(yīng)分析。結(jié)果表明，卡方檢驗(yàn)顯示突變體486-K和117-K的F2代各病級(jí)株數(shù)呈正態(tài)分布，存在一定性狀分離。“主基因+多基因”混合模型分析發(fā)現(xiàn)突變體117-K的最優(yōu)抗性遺傳模型為2MG-A，即2對(duì)主基因?yàn)榧有孕?yīng)控制遺傳，無(wú)顯性效應(yīng)和上位性效應(yīng)，主基因的遺傳效率為78.57%;突變體486-K的最優(yōu)抗性遺傳模型為2MG-ADI，即2對(duì)加性-顯性-上位性主基因模型，上位性效應(yīng)中以顯性×顯性互作和顯性×加性互作效應(yīng)較大，主基因遺傳效率為88.34%。表明煙草青枯病抗性突變體的遺傳方式以主基因效應(yīng)為主，受環(huán)境影響較小。

關(guān)鍵詞：煙草;青枯病;突變體;主基因+多基因;遺傳分析

Genetic Analysis of Bacterial Wilt Resistance Mutants 486-K and 117-K

in Tobacco

ZOU Wenli1，2， NIU Wenli1，2， YANG Huaying3， WU Shengxin4， ZHOU Yingbing3， YU Wen4， ZHANG Xingwei1， WU Xinru1， DING Anming1， DAI Changbo1， LIU Guanshan1， SUN Yuhe1*， WANG Weifeng1*

（1. Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China; 3. Tobacco Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230001， China; 4. Tobacco Science Research Institute， Fujian Tobacco Monopoly Administration， Fuzhou 350024， China）

Abstract： Tobacco bacterial wilt is a typical vascular bundle bacterial disease that seriously affects tobacco production in China. In order to understand the genetic basis of tobacco bacterial wilt resistance mutants and develop molecular markers related to resistance， and to provide theoretical basis for breeding high quality resistant varieties， in this study， tobacco bacterial wilt resistance mutants 486-K and 117-K obtained by EMS mutagenesis of flue-cured tobacco variety Cuibi 1 were selected as research objects， and Cubi 1 and the two mutants were used as parents to construct two different hybrid combinations. The analysis method of population genetic effect was carried out by using the analysis method of Chi-square test and "major-gene + polygene" mixed genetic model of plant quantitative traits. The results showed that， based on the Chi-square test， the number of disease-level strains of F2 generation of mutants 486-K and 117-K showed a normal distribution， and showed some trait separation. Analysis of the "major-gene + polygene" mixed model showed that 2MG-A was the optimal genetic model for resistance in mutant 117-K， with two pairs of major genes showing additive effects without dominant or epistatic effect， and the genetic efficiency of major genes being 78.57%. The optimal resistance genetic model for mutant 486-K was 2MG-ADI， or the two pairs of additive-dominant-epigenetic master gene model. Among the epistatic effects， the dominant × dominant interaction and dominant × additive interaction effects were larger， and the genetic efficiency of the main genes was 88.34%. It was indicated that the inheritance of tobacco bacterial wilt resistance mutants was dominated by main gene effect and less affected by the environment.

Keywords： tobacco; bacterial wilt; mutant; major-gene+polygene; genetic analysis

煙草青枯病作為一種細(xì)菌性病害，是由青枯雷爾式菌（Ralstonia solanancearum）引起的土傳病害，在煙草苗期和大田期均可發(fā)生。該菌寄主范圍廣，可侵染54個(gè)科近450余種作物，如花生、番茄、辣椒等，嚴(yán)重影響了許多重要經(jīng)濟(jì)作物的生長(zhǎng)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。在我國(guó)，煙草青枯病主要發(fā)生在長(zhǎng)江以南地區(qū)，近年來(lái)逐步向北方地區(qū)蔓延。目前煙草青枯病的防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治等，這些方法仍存在較多問(wèn)題，不能有效抑制青枯病[3-5]。培育抗病品種是防治青枯病最根本、有效的途徑。而培育抗病品種，首先需要選擇高抗青枯病的材料作抗源，同時(shí)掌握抗性基因的遺傳規(guī)律。

近年來(lái)關(guān)于煙草青枯病抗性遺傳的研究較多，但在研究材料、環(huán)境、方法等方面存在差異，因此青枯病的抗性遺傳機(jī)理還沒(méi)有統(tǒng)一的定論。高加明等[6]對(duì)香料煙品種Xanthi進(jìn)行青枯病抗性遺傳分析，發(fā)現(xiàn)該品種的抗性是受2對(duì)加性-顯性-上位主基因+加性-顯性多基因控制;而MATSUDA等[7]認(rèn)為Xanthi中存在的抗性是受到局部顯性基因Rxa影響。QIAN等[8]根據(jù)次要基因座對(duì)青枯病發(fā)生率和指數(shù)的累加效應(yīng)，認(rèn)為云煙85、DB101等品種的抗性以加性效應(yīng)遺傳為主。張振臣等[9-10]利用“主基因+多基因”混合遺傳模型聯(lián)合分析方法對(duì)廣東地方曬煙品種GDSY-1和“大葉密合”進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)GDSY-1抗性遺傳的顯性程度高，符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性-上位性多基因模型，主基因遺傳率高;而另一曬煙品種“大葉密合”為部分隱性遺傳，符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型。由于前人研究發(fā)現(xiàn)不同品種的抗性遺傳規(guī)律存在較大差異，不利于抗性品種的選育，因此煙草青枯病的優(yōu)質(zhì)抗源有待深入研究和挖掘。

本研究選取的煙草青枯病抗性突變體486-K和117-K在田間表現(xiàn)為抗性較高，可探究其抗性基因的遺傳規(guī)律。利用翠碧一號(hào)×突變體為親本（組合），構(gòu)建F1和F2群體，根據(jù)各世代在田間的抗病性表現(xiàn)進(jìn)行抗性基因的遺傳規(guī)律分析，為培育煙草抗青枯病新品種提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理烤煙品種翠碧一號(hào)（CB）獲得的抗青枯病突變體：486-K、117-K（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草所突變體庫(kù)提供）。

以烤煙品種翠碧一號(hào)為母本P1，突變體486-K和117-K為父本P2，形成CB×486-K和CB×117-K組合，雜交獲得F1代，F(xiàn)1代自交收種獲得F2群體，最終形成P1、P2、F1、F2世代。

1.2 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年在安徽省宣城市寒亭鎮(zhèn)（N30°55′3.12″，E118°32′58.29″）進(jìn)行。田間種植行距為1.2 m，株距為0.5 m。P1、P2、F1代采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每次重復(fù)分別種植15株。F2代不設(shè)置重復(fù)，CB×117-K F2代調(diào)查植株309株，CB×486-K F2代調(diào)查植株340株。

1.3 ?病情調(diào)查

按照煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法YC/T 39—1996行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的調(diào)查方法，以株為單位詳細(xì)調(diào)查發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)。

病情指數(shù)=[Σ（各級(jí)病株或葉數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)或葉數(shù)×最高級(jí)值）]×100

1.4 ?數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。采用卡方檢驗(yàn)和植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型分析方法[11-12]進(jìn)行遺傳分析。根據(jù)本研究中的田間煙草青枯病抗性調(diào)查數(shù)據(jù)，計(jì)算2個(gè)組合的極大似然函數(shù)值和AIC（Akaike's Information Criterion）值。通過(guò)IECM算法[12-13]得到5類24種模型，依據(jù)AIC值最小的準(zhǔn)則選擇最佳候選模型，同時(shí)進(jìn)行5個(gè)統(tǒng)計(jì)量、、、Smirnov（nW2）和Kolmogorov（Dn）適合性檢驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果選擇最優(yōu)遺傳模型。采用最小二乘法從最優(yōu)遺傳模型的各成分分布參數(shù)估計(jì)各基因效應(yīng)值，分析各組合的遺傳效應(yīng)。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?病圃青枯病發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)

2個(gè)組合各世代青枯病單株病級(jí)分布情況如表1，2個(gè)組合中P2代的病級(jí)大多集中在0級(jí)和1級(jí)，其中CB×117-K P2代的病情指數(shù)為19.6，CB×486-K P2代的病情指數(shù)為23.8，均表現(xiàn)為抗病。P1代的病級(jí)分布主要集中在3級(jí)和4級(jí)，2個(gè)組合中P1代的病情指數(shù)均為95.6，表現(xiàn)為高感青枯病。CB×117-K F1和CB×486-K F1的病情指數(shù)分別為93.8和96.2，均接近P1代的病情指數(shù)，且無(wú)0級(jí)

完全抗病植株存在，說(shuō)明F1代表現(xiàn)為感病。2個(gè)組合F2代病情指數(shù)分別為51.8和46.2，以CB×486-K組合為例（圖1），通過(guò)SPSS 20.0軟件對(duì)F2代各病級(jí)株數(shù)進(jìn)行正態(tài)分布分析（卡方檢驗(yàn)），發(fā)現(xiàn)直方圖中頻數(shù)分布有明顯的波峰，且偏度≈0，說(shuō)明F2代各病級(jí)株數(shù)呈正態(tài)分布;Q-Q圖檢驗(yàn)看出各頻數(shù)基本分布在直線附近，則進(jìn)一步驗(yàn)證服從正態(tài)分布。CB×117-K F2代的卡方檢驗(yàn)結(jié)果同CB×486-K。該結(jié)果表明2個(gè)組合的F2代均存在一定性狀分離，可以進(jìn)行下一步遺傳規(guī)律分析。

2.2 ?“主基因+多基因”混合模型遺傳分析

利用“主基因+多基因”混合模型[13]分別對(duì)2個(gè)組合的單株病級(jí)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各個(gè)組合5類24種模型的AIC值（表2）。根據(jù)AIC值較小原則選擇最佳模型。組合CB×117-K中，AIC值較低的有MX2-AD-AD、2MG-ADI和2MG-A模型;組合CB×486-K中，AIC值較低的有MX1-AD-ADI、MX2-ADI-ADI、MX2-ADI-AD和2MG-ADI模型。將以上模型分別作為各抗源抗性的備選模型。

參考文獻(xiàn)

[1]劉勇，范江，李永平. 煙草抗青枯病育種研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2012，18（6）：93-99.

LIU Y， FAN J， LI Y P. Research progress in breeding of tobacco resistant to bacterial wilt[J]. Chinese Tobacco Journal， 2012， 18（6）： 93-99.

[2]徐樹德，尚志強(qiáng)，秦西云. 煙草青枯病研究進(jìn)展[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，16（4）：49-53.

XU S D， SHANG Z Q， QIN X Y. Research progress of tobacco Ralstonia solanaeearum[J]. Tianjin Agricultural Sciences， 2010， 16（4）： 49-53.

[3]LI Y， FENG J， LIU H L， et al. Genetic diversity and pathogenicity of Ralstonia solanacearum causing tobacco bacterial wilt in China[J]. Plant Disease， 2016， 100（7）： 1288-1296.

[4]MA L， ZHANG H Y， ZHOU X K， et al. Biological control tobacco bacterial wilt and black shank and root colonization by bio-organic fertilizer containing bacterium Pseudomonas aeruginosa NXHG29[J]. Applied Soil Ecology， 2018， 129（5）： 136-134.

[5]YI Y N， LIU R S， YIN H Q， et al. Isolation， identification and field control efficacy of an endophytic strain against tobacco bacterial wilt （Ralstonia solanacarum）[J]. Chinese Journal of Applied Ecology， 2007， 18（3）： 554-558.

[6]高加明，王志德，張興偉，等. 香料煙青枯病抗性基因的遺傳分析[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2010，31（1）：1-4.

GAO J M， WANG Z D， ZHANG X W， et al. Genetic analysis on resistance to bacterial wilt in oriental tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2010， 31（1）： 1-4.

[7]MATSUDA T， OHASH I Y. Inheritance of resistance to bacterial wilt resistant varieties in tobacco[J]. Jap Jour Breeding， 1973， 23： 175-180.

[8]QIAN Y L， CHEN J， DONG J J， et al. Genetic analysis of the major and minor locus groups of bacterial wilt resistance in tobacco using a diallel cross design[J]. Genetics and Molecular Research， 2016， 15（1）： 255-262.

[9]張振臣，袁清華，馬柱文，等. 煙草品種GDSY-1的青枯病抗性與遺傳分析[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2017，38（4）：9-16.

ZHANG Z C， YUAN Q H， MA Z W， et al. Inheritance of resistance to bacterial wilt in Chinese domestic tobacco cultivar GDSY-1[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（4）： 9-16.

[10]張振臣，呂永華，馬柱文，等. 煙草品種“大葉密合”青枯病抗性遺傳分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2015，21（3）：57-64.

ZHANG Z C， LYU Y H， MA Z W， et al. Genetic analysis of resistance to bacterial wilt in tobacco cultivar dayemihe[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2015， 21（3）： 57-64.

[11]THANO P， AKARAPISAN A. Phylotype and sequevar of Ralstonia solanacearum which causes bacterial wilt in Curcuma alismatifolia gagnep[J]. Letters in Applied Microbiology， 2018， 66（5）： 384-393.

[12]王建康，蓋鈞鎰. 利用雜種F2世代鑒定數(shù)量性狀主基因-多基因混合遺傳模型并估計(jì)其遺傳效應(yīng)[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，1997（5）：432-440.

WANG J K， GAI J Y. Identification of major-gene-polygene hybrid genetic models of quantitative traits using hybrid F2 generation and estimating their genetic effects[J]. Acta Genetica Sinica， 1997（5）： 432-440.

[13]章元明，蓋鈞鎰. 數(shù)量性狀分離分析中分布參數(shù)估計(jì)的IECM算法[J]. 作物學(xué)報(bào)，2000（6）：699-706.

ZHANG Y M， GAI J Y. The IECM algorithm for estimation of component distribution parameters in segregating analysis of quantitative traits[J]. Acta Agronomica Sinica， 2000（6）： 699-706.

[14]程亞增，馬冰，蔣彩虹，等. 烤煙不同黃瓜花葉病毒?。–MV）抗源的抗性遺傳分析[J]. 煙草科技，2016，49（6）：8-14.

CHENG Y Z， MA B， JIANG C H， et al. Genetic analysis of CMV resistance in different flue-cured tobacco germplasms[J]. Tobacco Science & Technology， 2016， 49（6）： 8-14.

[15]代帥帥，任民，蔣彩虹，等. 煙草骨干親本主要病毒病抗性鑒定及遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（6）：1228-1239.

DAI S S， REN M， JIANG C H， et al. Identification of resistance to main virus diseases and genetic diversity study of tobacco foundation parents[J]. Scientia Angricultura Sinica， 2015， 48（6）： 1228-1239.

[16]馮瑩，蔣彩虹，程立銳，等. 兩個(gè)煙草赤星病抗源的遺傳分析[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2015，36（5）：1-7.

FENG Y， JIANG C H， CHENG L R， et al. Genetic analysis of resistance to brown spot disease in tobacco cultivars Jingyehuang and Beinhart1000-1[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 36（5）： 1-7.

[17]郭璇，閆杏杏，蔣彩虹，等. 雪茄煙Beinhart1000-1對(duì)黑脛病0號(hào)生理小種的抗性遺傳分析[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2017，38（2）：56-62.

GUO X， YAN X X， JIANG C H， et al. Genetic analysis of Beinhart1000-1 resistance to black shank in tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（2）： 56-62.

[18]張興偉，王志德，劉艷華，等. 植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型及其在煙草上的應(yīng)用[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2013，19（3）：41-44.

ZHANG X W， WANG Z D， LIU Y H， et al. “Major-gene + polygene” mixed genetic model in quantitative characters and its application in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2013， 19（3）： 41-44.

[19]范江. 煙草種質(zhì)青枯病抗性鑒定與分子標(biāo)記篩選[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

FAN J. Tobacco germplasm bacterial wilt resistance identification and molecular marker screening[D]. Changsha： Hunan Agricultural University， 2012.

[20]楊友才，周清明，朱列書. 煙草青枯病抗性基因的遺傳分析及RAPD標(biāo)記[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2006（2）：38-42.

YANG Y C， ZHOU Q M， ZHU L S. Heredity and RAPD markers analysis of resistance gene to tobacco bacterial wilt[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2006（2）： 38-42.

[21]孫學(xué)永，王新勝，張麗娜，等. 煙草青枯病抗性的遺傳分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（34）：56-60.

SUN X Y， WANG X S， ZHANG L N， et al. Genetic analysis of resistant to tobacco bacterial wilt[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2013， 29（34）： 56-60.

[22]耿銳梅，程立銳，劉旦，等. 煙草青枯病抗性遺傳效應(yīng)分析[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2019，40（4）：7-13.

GEN R M， CHENG L R， LIU D， et al. Genetic analysis of resistance to bacterial wilt in tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（4）： 7-13.

[23]孫學(xué)永，周應(yīng)兵，楊華應(yīng)，等. 煙草種質(zhì)抗青枯病鑒定及其抗性分類[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2011，17（3）：61-66，88.

SUN X Y， ZHOU Y B， YANG H Y， et al. Identification and classification of tobacco germplasm resistant to bacterial wilt[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2011， 17（3）： 61-66， 88.

[24]王新，吳新儒，王衛(wèi)鋒，等. 煙草抗青枯病突變體的室內(nèi)接種鑒定[J]. 分子植物育種，2018，16（19）：6468-6475.

WANG X， WU X R， WANG W F， et al. Indoor inoculation identification of tobacco mutant resistant to bacterial wilt[J]. Molecular Plant Breeding， 2018， 16（19）： 6468-6475.

[25]臧輝，任衛(wèi)波. EMS誘變?cè)谥参镉N中的研究與應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2018，16（17）：5782-5788.

ZANG H， REN W B. Research and application of EMS mutation in plant breeding[J]. Molecular Plant Breeding， 2018， 16（17）： 5782-5788.

[26]劉曉蓓，吳賡，張芊，等. 煙草突變體庫(kù)的創(chuàng)建策略及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010，12（6）：28-35.

LIU X B， WU G， ZHANG Q， et al. Strategy and application for constructing tobacco mutant library[J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 2010， 12（6）： 28-35.

[27]劉翔. EMS誘變技術(shù)在植物育種中的研究進(jìn)展[J]. 激光生物學(xué)報(bào)，2014，23（3）：197-201.

LIU X. Progresses on EMS mutagenesis in plant breeding[J]. Acta Laser Biology Sinica， 2014， 23（3）： 197-201.

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目“煙草青枯病抗性基因定位及翠碧一號(hào)新品系培育”（110201601030）;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRI02）

作者簡(jiǎn)介：鄒文莉（1995-），女，在讀碩士生，主要研究方向?yàn)榉肿舆z傳育種。E-mail：zouwenli950806@163.com

*通信作者，E-mail：sunyuhe@caas.cn;wangweifeng@caas.cn

收稿日期：2019-12-11 ? ? ? ? ? ? ? ? ?修回日期：2020-03-25