王蕾 趙澤玉 陳明麗 龔達平

摘 ?要：細胞色素P450（CYP450）是一類超基因家族編碼的多功能氧化酶，在生物合成、代謝解毒及植物防御方面具有重要作用。其中CYP71D屬于CYP450的一個亞家族，主要在次生代謝物合成和病蟲害防御方面起作用。為了更好地了解煙草CYP71D亞家族基因特征和功能，本研究利用生物信息學分析手段及煙草轉錄組數(shù)據(jù)，對CYP71D亞家族基因的結構和表達等進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)，在煙草中共有42個CYP71D亞家族成員，各成員在染色體上并非均勻分布，其氨基酸長度和等電點差異較大，但基因結構、保守結構域數(shù)目和分布高度一致;二級結構分析表明，煙草CYP71D亞家族成員具備P450蛋白特征結構域;基因表達模式分析顯示，多數(shù)CYP71D基因在根、葉、花中特異表達，大部分基因參與了IAA激素、黑脛病、溫度等逆境脅迫反應。這為煙草CYP71D亞家族基因功能的深入研究及煙草抗逆品種的培育奠定了基礎。

關鍵詞：煙草;CYP71D亞家族;生物信息學分析

Bioinformatic Analysis of CYP71D Subfamily Genes in Tobacco （Nicotiana tabacum L.）

WANG Lei1，2， ZHAO Zeyu1，2， CHEN Mingli1， GONG Daping1*

（1. Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract： Cytochrome P450 （CYP450） is a supergene family which encodes multifunctional oxidase， playing an important role in biosynthesis， metabolic detoxification， and plant defense. In CYP450 family， the CYP71D subfamily genes mainly function in secondary metabolite synthesis and pest control. In order to better understand the genetic characteristics and functions of tobacco CYP71D subfamily genes， their gene structure and expression pattern were analyzed by bioinformatics tools and transcriptome data. The results showed that there are 42 members in tobacco CYP71D subfamily and they were distributed on the chromosome unevenly. Besides， their amino acid lengths and isoelectric points were quite different， while their gene structure and conserved-domain distribution were highly consistent. The secondary structure analysis showed that CYP71D subfamily members contained the typical conserved domains in P450 proteins. The gene expression pattern analysis showed that most CYP71D genes were specifically expressed in roots， leaves and flowers， and some of them were induced by various elicitors， including phytohormone IAA， temperature and black shank. This study contributes to further researches in the function of CYP71D subfamily genes and breeding for stress-resistant tobacco cultivars.

Keywords： tobacco; CYP71D subfamily; bioinformatics analysis

細胞色素P450（cytochrome P450）是一類以血紅素為輔基的B族細胞色素超家族蛋白酶，經(jīng)過進化擴張形成，廣泛存在于各種動物、植物、真菌和細菌中，是植物代謝中最大的酶家族[1]。1969年FREAR[2]首次在棉花（Gossypium hirsutum L.）發(fā)現(xiàn)P450s，隨后陸續(xù)在其他多種植物中發(fā)現(xiàn)了P450s，如擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）[3]，水稻（Oryza sativa L.）[4]，苜蓿（Medicago sativa L.）[5]，菜豆（Phaseolus vulgaris L.）[6]等。目前已從植物中發(fā)現(xiàn)了127個P450基因家族，分為11個簇，包括單家族簇和多家族簇。CYP71簇（簡稱71 clan）是一個多家族簇，包含CYP71、CYP82、CYP93等多個家族，覆蓋了超過半數(shù)的P450基因[7-8]。CYP71D亞家族則位于CYP71簇的CYP71家族。

植物P450的功能主要歸為兩大類，一類參與植物次生代謝物質的合成，如苯丙烷、萜類、植物激素類、黃酮類、木質素和生物堿等[9];一類參與解毒途徑，催化外源化合物如除草劑、殺蟲劑等變成非毒性物質[10]。CYP71D亞家族在植物中主要參與生物堿類、萜類、黃酮類等抗病原物有關次生代謝物的合成。辣椒CYP71D19 （AF122821）形成的產(chǎn)物在病菌侵染果實表皮時起保護作用[11];煙草CYP71D20能體外催化5-非手性-馬兜鈴烯（5-epi-aristolochene）和1-脫氧衣殼二醇（1-deoxycapsidiol）形成萜類植保素-甜椒素[12];煙草腺毛中的CYP71D16能催化葉面香氣物質西柏三烯二醇的合成[13-16]，但并不受外源MeJA的誘導[17]。

煙草是重要的經(jīng)濟作物，也是重要模式植物之一。解敏敏等[18]從煙草基因組中鑒定了44個P450家族，共263個成員，并分析了P450基因在各個組織的表達情況，但對煙草CYP71D亞家族基因功能的研究還不夠詳細。本研究采用生物信息學的方法從煙草基因組中鑒定了42個CYP71D基因，并分析了CYP71D亞家族成員的基因結構、二級元件及表達模式，以期為煙草CYP71D基因的功能研究及抗病蟲品種的培育提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?煙草CYP71D亞家族成員的鑒定及理化性質分析

從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載P450家族種子序列（Pfam ID： PF00067），用HMMER3.0檢索煙草K326蛋白數(shù)據(jù)庫[19]（https：//solgenomics.net/），獲得候選P450蛋白。將其與番茄P450家族（http：//drnelson.uthsc.edu/ CytochromeP450.html）比對得到候選煙草CYP71D蛋白序列[20]。利用ExPASy ProtParam （http：//web.expasy.org/protparam/）分析煙草CYP71D亞家族成員的氨基酸長度、分子量和等電點等理化性質。

1.2 ?煙草CYP71D亞家族基因結構、保守結構域和二級結構元件分析

利用MEGA 7.0對CYP71D亞家族基因進行多序列比對構建鄰接進化樹。利用基因預測信息分析CYP71D亞家族成員基因結構，利用MEME （http：//meme-suite.org/）預測分析CYP71D亞家族成員蛋白序列的保守結構域，使用TBtools軟件進行可視化。以PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/ pdb/home/home.do）獲得的擬南芥AtAOS （CYP74A）的結構信息為模板分析CYP71D亞家族成員的二級結構。

1.3 ?煙草CYP71D亞家族基因表達模式聚類分析

從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/sra/）下載煙草轉錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，包括TN90各個組織（根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、未成熟花、成熟花、衰老花和果實）;在H2O和IAA中處理24和72 h的南江3號種子;感染黑脛病12、72 h的紅花大金元成熟莖組織;高溫、中溫、低溫脅迫下20、40、60 d云煙87的根和葉組織;4 ℃處理0、4、24、48 h的NC567和臺煙8號葉組織。利用TopHat2[21]和Cufflink程序分析轉錄組數(shù)據(jù)并計算表達量，使用pheatmap程序繪制熱圖。

2 ?結 ?果

2.1 ?煙草CYP71D亞家族成員的鑒定及理化性質分析

應用HMMER3.0軟件檢索煙草K326蛋白數(shù)據(jù)庫，共獲得639條候選P450蛋白序列。將其與番茄每個亞家族P450蛋白序列比對，鑒定了煙草CYP71D亞家族中93個成員。剔除過短片段（氨基酸序列<350）和不包含K螺旋（ExxR）及血紅素結合域（FxxGxxxCxG）的蛋白[22]，最終得到42個煙草CYP71D亞家族成員（表1）。煙草CYP71D基因在17條染色體上并非隨機分布。其中22號染色體上分布數(shù)量最多，有10個基因。在scaffold Nitab4.5_0000390上有4個CYP71D基因串聯(lián)分布，在scaffold Nitab4.5_0001182、Nitab4.5_0001264、Nitab4.5_0004164、Nitab4.5_0006052和Nitab4.5_ 0008401上分別有2個CYP71D基因串聯(lián)分布。對煙草CYP71D亞家族成員理化性質分析發(fā)現(xiàn)，除Nitab4.5_0000163g0260.1外，其他成員氨基酸長度在417～559 aa之間，分子量介于47～63 kD左右，理論等電點在6.39～9.44之間（表1）。

2.2 ?煙草CYP71D亞家族基因結構與保守結構域分析

系統(tǒng)進化分析和基因結構分析顯示（圖1），煙草CYP71D亞家族大部分成員只有一個內含子，小部分成員包含多個內含子，多由較長的2個外顯子和幾個非常短的外顯子組成。CYP71D亞家族成員間基因結構與進化距離存在緊密聯(lián)系，親緣關系

越近則基因結構越相似，內含子大小越接近。利用MEME搜索煙草CYP71D亞家族成員的保守基序顯示，亞家族成員保守基序（motif）的種類、數(shù)目和分布高度一致[23]。其中，31個含有全部10個保守基序，11個存在1～3個保守基序的缺失。

2.3 ?煙草CYP71D亞家族二級結構預測及分析

以擬南芥AtAOS （CYP74A）基因的二級結構為模板，對煙草CYP71D基因的二級結構分析表明（圖2），所有CYP71D家族蛋白序列中都含有P450蛋白典型的保守結構域，包括PERF結構域（PxRx）、K螺旋（ExxR）和C末端的血紅素結合域（FxxGxxxCxG）。血紅素結合域是鑒定P450蛋白的主要特征結構，該結構域中存在與鐵元素形成硫醇鹽離子鍵的絕對保守的半胱氨酸殘基（Cys），K螺旋中的谷氨酸（Glu）和精氨酸（Arg）也絕對保守[24]，參與P450核心結構的穩(wěn)定，與PERF結構域形成鹽橋發(fā)生相互作用。6個底物識別位點（substrate recognition sites，SRS）[25]通過誘導-契合機制識別底物，與底物結合參與隨后的催化反應，這些可變區(qū)域存在較大差異。

2.4 ?煙草CYP71D亞家族基因表達模式分析

煙草不同組織及誘導脅迫下的CYP71D基因表達數(shù)據(jù)聚類分析顯示，煙草CYP71D基因的表達模式大致分為6個不同的類群，如圖3所示。第1類基因，除Nitab4.5_0005698g0010.1受溫度脅迫在根和葉中表達外，其他基因主要在花中表達。第2類基因，部分具有組織特異性表達，如Nitab4.5_0000418g0010.1和Nitab4.5_0001264g0080.1僅在衰老花中特異表達，并且Nitab4.5_ 0000418g0010.1在黑脛病感染的莖組織中表達量上調，Nitab4.5_0001264g0080.1在IAA中吸脹24 h和未經(jīng)處理萌發(fā)72 h的種子中高表達;Nitab4.5_0000977g0140.1在未經(jīng)處理的休眠種子中特異表達，在H2O和IAA中吸脹后萌發(fā)72 h的種子中表達量較高;該類剩余其他基因在所有組織中都幾乎不表達。第3類基因，在根、休眠種子中表達量較高，受IAA、溫度和黑脛病菌脅迫調控。第4類基因可能是參與溫度響應的基因，在根中的表達受溫度脅迫調控。第5類基因主要在葉和根組織中表達，受溫度、黑脛病菌誘導。第6類基因，可能是參與脅迫應答的基因，受IAA、黑脛病菌、溫度等多個因素誘導調控，在休眠種子和根中高表達。

3 ?討 ?論

本研究利用生物信息學方法，從煙草基因組中鑒定得到了42個CYP71D亞家族成員。相比番茄基因組中16個CYP71D基因[26]，煙草CYP71D基因的數(shù)目是番茄的2.6倍，這可能是由于煙草為異源四倍體，大多數(shù)基因包含兩個拷貝。CYP71D基因在染色體上并非均勻分布，一半成員成簇分布，這可能是基因復制的結果[27]。CYP71D亞家族成員間內含子保守情況與進化相關[28]，煙草CYP71D亞家族中大多數(shù)成員只有一個內含子，進化距離越近，內含子長度越接近，基因結構越相似。

P450功能的多樣性是為了適應各種組織不同代謝途徑和環(huán)境脅迫進化的結果。大多數(shù)進化距離較近的CYP71D亞家族成員在表達譜特征上也比較相似，說明他們可能具有類似的功能。大多數(shù)P450基因在植物各組織中表達量較低，特別是一些參與內源信號分子代謝途徑的P450基因，受外界生物與非生物脅迫誘導時才響應表達。煙草CYP71D基因的表達模式分析表明，CYP71D亞家族基因在IAA誘導、黑脛病和溫度脅迫下，表達量發(fā)生不同程度的上調或下調，該CYP71D家族可能主要參與外界脅迫應答反應。

休眠種子和萌發(fā)種子中CYP71D基因的表達模式完全相反。CYP71D基因在生長素響應的種子次生休眠過程中可能參與了黃酮醇生物合成、赤霉素代謝等，在生長素響應的種子萌發(fā)過程中可能參與了脫落酸、生長素、茉莉酸和水楊酸介導的激素信號通路[29]。在黑脛病菌誘導下，煙草CYP71D亞家族有近一半的基因表達量發(fā)生變化。李立芹等[30]、蘇振剛等[31]運用抑制性消減雜交技術（SSH）篩選的黑脛病抗性相關的差異表達基因中也包含了P450基因。此外，在煙草抗黑脛病過程中發(fā)現(xiàn)有5個miRNA的靶基因編碼細胞色素P450[32-33]。這表明P450基因在煙草對黑脛病的抗病過程中起著非常重要的作用。當煙草根和葉受冷熱脅迫時，顯著影響煙草生理特征[34]，本研究中分別有約1/2和1/3的CYP71D基因表達量發(fā)生變化。已有研究表明，在多年生黑麥草和高羊茅中，CYP71家族基因參與溫度脅迫響應[35]。茶樹在冷熱脅迫下，CYP71A26基因表達量下降，而CYP71B34表達量上升[36]。本研究還發(fā)現(xiàn)，煙草部分CYP71D成員受多種逆境脅迫和激素響應均出現(xiàn)表達量明顯變化，這些基因具體的分子調控機理還有待進一步研究。

4 ?結 ?論

本研究通過生物信息學方法從煙草基因組中鑒定出42個CYP71D亞家族基因，這些基因在染色體上并非均勻分布，理化性質差異較大，但基因結構和保守結構域高度一致。表達模式分析表明，CYP71D亞家族大部分基因參與IAA誘導、黑脛病和溫度等脅迫過程，可能在植物防御反應方面具有重要的作用。這為CYP71D亞家族基因功能的深入研究和抗逆煙草品種的培育提供了參考。

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基金項目：中國煙草總公司科技重大專項項目“K326和紅花大金元品種蚜蟲抗性的定向改良”[110201801024（JY-01）]

作者簡介：王 ?蕾（1994-），女，碩士研究生，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：wanglei941220 @163.com

*通信作者，E-mail：gongdaping@caas.cn

收稿日期：2019-10-16 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2020-01-02