王東 李晶潔 呂書(shū)勤

[摘要] 目的 采用代謝組學(xué)探究脾虛濕盛證肝癌患者發(fā)病機(jī)制及健脾化濕法干預(yù)的分子生物學(xué)效應(yīng)。 方法 選取2017年6月～2019年6月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）體檢中心體檢的50名平和質(zhì)者作為空白組，選取我院收治的50例脾虛濕盛證肝癌患者作為對(duì)照組，50例服用四君子湯干預(yù)1個(gè)月的肝癌患者作為觀察組。采用超高效液相色譜-高清質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)三組入選者血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析。 結(jié)果 在入選對(duì)象血液樣品中共鑒定出谷胱甘肽、左旋谷氨酸等19個(gè)潛在生物標(biāo)志物。與空白組比較，對(duì)照組中有6個(gè)表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，13個(gè)表現(xiàn)為下降趨勢(shì)（P < 0.05或P < 0.01）。經(jīng)四君子湯干預(yù)后，其中17個(gè)具有回調(diào)作用，調(diào)整差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;根據(jù)這17個(gè)回調(diào)生物標(biāo)志物找到D-谷氨酰胺和谷氨酸代謝、?；撬岷团；撬岽x等6條相關(guān)代謝通路。 結(jié)論 脾虛濕盛證肝癌患者體內(nèi)存在氨基酸代謝、花生四稀酸代謝、脂肪酸代謝、谷胱甘肽代謝等紊亂，四君子湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)以上相關(guān)代謝通路對(duì)脾虛濕盛證肝癌患者具有調(diào)節(jié)作用。

[關(guān)鍵詞] 肝癌;脾虛濕盛證;超高效液相色譜-高清質(zhì)譜;血漿代謝組學(xué)

[中圖分類號(hào)] R246.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）04（c）-0145-04

Study on plasma metabolomics of liver cancer patients with syndrome of dampness excessiveness due to spleen deficiency based on UPLC-HDMS

WANG Dong ? LI Jingjie ? LYU Shuqin

VIP Ward， Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi ? 830000， China

[Abstract] Objective To study the pathogenesis of liver cancer with syndrome of dampness excessiveness due to spleen deficiency by metabonomics and the molecular biological effect of the intervention of invigorating spleen for eliminating dampness. Methods Fifty persons with peace quality of blank group were selected from the physical examination center of Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University （hereinafter referred to as “our hospital”） from June 2017 to June 2019. 50 cases of liver cancer patients with spleen deficiency and dampness syndrome in our hospital were taken as control group and 50 cases of liver cancer patients taking Sijunzi Decoction for one month were taken as observation group. Metabonomics analysis of plasma samples from three groups of participants was carried out by using the technology of ultra-high performance liquid chromatography-high definition mass spectrometry. Results Nineteen potential biomarkers such as glutathione and L-glutamic acid were identified in the blood samples of the selected subjects. Compared with blank group， 6 of control group showed an upward trend and 13 showed a downward trend （P < 0.05 or P < 0.01）. After intervention of Sijunzi Decoction， 17 of them had callback effect， and the adjustment difference was statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. According to these 17 callback biomarkers， 6 related metabolic pathways including D-glutamine and glutamate metabolism， taurine and taurine metabolism were found. Conclusion There are disorders of amino acid metabolism， arachidonic acid metabolism， fatty acid metabolism and glutathione metabolism in liver cancer of syndrome of dampness excessiveness due to spleen deficiency. Sijunzi Decoction may regulate the disorders by above metabolic pathways in liver cancer of syndrome of dampness excessiveness due to spleen deficiency.

[Key words] Liver cancer; Syndrome of dampness excessiveness due to spleen deficiency; Ultra-high performance liquid chromatography-high definition mass spectrometry; Plasma metabolomics

中醫(yī)體系是一個(gè)復(fù)合體系，其整體觀及辨證論治是中醫(yī)藥治療思路的兩大特色，而中藥方劑成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)眾多，使傳統(tǒng)的分析方法難以系統(tǒng)評(píng)價(jià)這種復(fù)雜的作用機(jī)制。代謝組學(xué)可以定性和定量分析生理病理刺激或遺傳變異誘導(dǎo)等產(chǎn)生的小分子生物代謝應(yīng)答產(chǎn)物，再通過(guò)整合高通量信息提取技術(shù)和多元變量分析技術(shù)，以尋找相關(guān)的代謝產(chǎn)物及相應(yīng)的代謝途徑[1]。代謝組學(xué)符合中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多層次作用的特點(diǎn)，對(duì)揭示中醫(yī)藥治療的生物學(xué)基礎(chǔ)及中醫(yī)藥的現(xiàn)代科學(xué)研究起到有力推動(dòng)作用，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要研究方法[2]。本研究使用超高效液相色譜-高清質(zhì)譜（UPLC-HDMS）聯(lián)用技術(shù)觀察脾虛濕盛證肝癌患者的血漿代謝學(xué)差異及健脾化濕法對(duì)其的干預(yù)作用，以探究其分子生物學(xué)效應(yīng)，為肝癌脾虛濕盛證的早期診斷、預(yù)后評(píng)估、藥物干預(yù)治療等方面提供一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月～2019年6月于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）體檢中心體驗(yàn)的50名平和質(zhì)健康體檢者作為空白組，于我院住院的50例脾虛濕盛證肝癌患者作為對(duì)照組，50例給予以四君子湯為主方干預(yù)1個(gè)月后的脾虛濕盛證肝癌患者作為觀察組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

原發(fā)性肝癌符合《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[3]，所有患者均經(jīng)組織學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性肝癌。中醫(yī)脾虛濕盛證診斷參照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]及《中醫(yī)證候辨治軌范（修訂版）》[5]，癥狀：①大便溏泄;②食欲減退;③食后或下午腹脹、喜按;④面色萎黃;⑤肌瘦無(wú)力。五項(xiàng)中具備三項(xiàng)以上便可確診為脾虛濕盛證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合以上原發(fā)性肝癌西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)脾虛濕盛證證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，且以原發(fā)性肝癌為第一診斷;②年齡18歲以上;③所有納入對(duì)象均自愿參加研究，并簽署知情同意書(shū)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并有活動(dòng)性結(jié)核或嚴(yán)重感染性疾病;②有精神障礙或嚴(yán)重心腦血管疾病;③妊娠期或哺乳期婦女。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 血液樣品采集與處理 ?抽取入選者清晨空腹靜脈血10 mL，于漩渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司，中國(guó)）內(nèi)進(jìn)行渦旋15 min，于KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司，中國(guó)）離心15 min（4℃，轉(zhuǎn)速14 000 r/min，離心半徑7 cm），取上清液400 μL進(jìn)行真空干燥，再用100 μL的80%甲醇復(fù)溶，再離心15 min（4℃，轉(zhuǎn)速14 000 r/min，離心半徑7 cm），取上清液200 μL進(jìn)行UPLC-HDMS分析。

1.5.2 UPLC-HDMS檢測(cè) ?UPLC：采用UPLC液相色譜儀（Waters集團(tuán)公司生產(chǎn)，美國(guó)），樣品檢測(cè)使用Acqiuty UPLCTMBEHC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）及UPLC C18保護(hù)柱（2.1 mm×5.0 mm），流速0.4 mL/min，柱溫40℃，樣品倉(cāng)溫4℃。正離子（ESI+）模式：流動(dòng)相A為蒸餾水+0.1%甲酸（北京迪馬科技?xì)W泰科技發(fā)展中心，中國(guó)），B為乙腈（賽默飛世爾公司，美國(guó)）+0.1%甲酸;負(fù)離子（ESI-）模式：流動(dòng)相A為蒸餾水，B為乙腈。血漿樣品梯度洗脫程序按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。質(zhì)譜條件：樣品經(jīng)UPLC分離后用Waters LCT Premier XE TOF質(zhì)譜儀（Waters集團(tuán)公司，美國(guó)）進(jìn)行分析。離子源：加熱型電噴霧，采用電噴霧正離子（ESI+）和負(fù)離子（ESI-）掃描模式進(jìn)行檢測(cè)，離子源溫度110℃，ESI+和ESI-模式噴霧電壓分別為1.3、1.5 kV，脫溶劑氣體流速750 L/h;錐孔氣體流速20 L/h;傳輸毛細(xì)管溫度350℃。全掃描方式，掃描質(zhì)量范圍為100～1500 m/z。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用UPLC-HDMS技術(shù)進(jìn)行血液代謝輪廓分析，結(jié)合Progenesis QI2.1軟件（Waters集團(tuán)公司，美國(guó)）進(jìn)行色譜峰識(shí)別和峰值匹配，同時(shí)使用MassLynx V4.1軟件在HMDB及KEGG等檢索數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行數(shù)據(jù)降維及質(zhì)譜矩陣信息獲取，以尋找潛在標(biāo)志物。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中潛在生物標(biāo)志物信息分析

在入選對(duì)象血液樣品中，共鑒定出19個(gè)潛在生物標(biāo)志物。與空白組比較，對(duì)照組中有6個(gè)生物標(biāo)志物表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，13個(gè)表現(xiàn)為下降趨勢(shì)（P < 0.05或P < 0.01）。比較對(duì)照組及觀察組，四君子湯對(duì)其中17個(gè)具有回調(diào)作用，調(diào)整差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 生物標(biāo)志物相關(guān)代謝通路

將檢測(cè)具有調(diào)整作用的17個(gè)血液樣品中的生物標(biāo)志物進(jìn)行MetPA識(shí)別顯著代謝物富集通路分析。共找到6條相關(guān)代謝通路。見(jiàn)表2。

3 討論

肝癌作為目前死亡率居世界第三位的常見(jiàn)惡性腫瘤，筆者在臨床上對(duì)大量肝癌患者的診治中，發(fā)現(xiàn)很多肝癌患者表現(xiàn)為脾虛濕盛型，運(yùn)用以四君子湯為主方進(jìn)行健脾利濕治療，往往取得良好的療效。四君子湯是出自于宋代《太平惠民和劑局方》，是古今治療脾胃氣虛證的經(jīng)典方劑[6]。本方由人參、茯苓、白術(shù)、炙甘草組成，其中君藥人參性甘溫，可以補(bǔ)中益氣，配合能健脾燥濕的白術(shù)，幫助脾胃運(yùn)化去濕;同時(shí)佐以茯苓健脾滲濕，合炙甘草養(yǎng)陰益氣，調(diào)和諸藥，四味共奏補(bǔ)中益氣、健脾化濕之功。藥理發(fā)現(xiàn)四君子湯可調(diào)節(jié)患者的胃腸功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，還能抗衰老，抗腫瘤等。李杏英等[7]使用黃芪四君子湯治療老年原發(fā)性肝癌放療患者，發(fā)現(xiàn)其可提高患者的免疫功能，且對(duì)放射具有明顯增敏效果。趙華[8]使用四君子湯治療晚期肝癌患者，發(fā)現(xiàn)其可降低患者胃腸道反應(yīng)及白細(xì)胞低、發(fā)熱、貧血的發(fā)生率。吳正平等[9]發(fā)現(xiàn)四君子湯可提高大鼠的T、B淋巴細(xì)胞增殖能力，表明四君子湯可改善免疫系統(tǒng)功能。

本研究使用UPLC-HDMS方法共鑒定出19個(gè)潛在生物標(biāo)志物，包括谷胱甘肽、左旋谷氨酸等。與健康者比較，脾虛濕盛證肝癌患者中有6個(gè)生物標(biāo)志物表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，13個(gè)表現(xiàn)為下降，表明脾虛濕盛證肝癌患者存在相關(guān)代謝紊亂。其中谷胱甘肽具有抗氧化和整合解毒作用，能保護(hù)受毒害的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在機(jī)體生命活動(dòng)中至關(guān)重要[10]。左旋谷氨酸經(jīng)酶催化后，與血中過(guò)多的氨結(jié)合成無(wú)害的谷氨酰胺，防止氨中毒[11]。鳥(niǎo)氨酸參與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移，有研究表明鳥(niǎo)氨酸的含量與腫瘤惡性程度分級(jí)呈負(fù)相關(guān)[12]。脯氨酸作為細(xì)胞膜及活性酶的保護(hù)物質(zhì)，能夠抑制異常細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[13]。酪氨酸是身體的天然止痛藥，具有抗刺激和抗抑郁的作用，而酪氨酸在癌癥患者中含量明顯降低[14]。本研究發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)氨酸、脯氨酸等氨基酸在肝癌患者血漿內(nèi)的生物合成明顯降低，估計(jì)與腫瘤微環(huán)境的改變密切相關(guān)。另外，?；撬?、?；切苋パ跄懰岬饶懼嵩谥敬x中起著重要作用，可促進(jìn)腸道及肝臟中脂肪和膽固醇的運(yùn)輸與排泄，是吸收膳食脂肪和維生素的基礎(chǔ)[15]?；ㄉ南┧峥甚セ懝檀?，增加血管彈性，降低血液黏度，對(duì)預(yù)防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要功效[16]。泛酸是輔酶A的組成部分，而輔酶A主要參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖代謝有關(guān)的三羧酸循環(huán)，故泛酸及輔酶A是機(jī)體代謝必不可缺少的物質(zhì)[17-19]。甲基丙二酸在輔酶作用下轉(zhuǎn)化為琥珀酸，甲基丙二酸排泄障礙會(huì)使琥珀酸脫氫酶活性下降，導(dǎo)致神經(jīng)及多臟器受損[20]。維生素K2主要作用是維持機(jī)體的正常凝血功能，日本大阪市立大學(xué)Habu等的一項(xiàng)初步研究顯示，維生素K2可預(yù)防肝硬化進(jìn)展為肝癌[21]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2可抑制白血病、骨髓增生異常綜合征等疾病代謝，具有明顯的抗腫瘤作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者中的?；撬帷⑴；侨パ跄懰岬饶懼峤档?，花生四烯酸、泛酸、維生素K2升高，輔酶A、甲基丙二酸降低，由此可見(jiàn)，肝癌患者存在脂類代謝、花生四稀酸代謝、三羧酸循環(huán)障礙等紊亂。

經(jīng)使用四君子湯加減健脾化濕后，本研究發(fā)現(xiàn)脾虛濕盛證肝癌患者中17個(gè)生物標(biāo)志物具有回調(diào)作用，提示四君子湯對(duì)其有效調(diào)整，可改善患者相關(guān)代謝紊亂。且經(jīng)過(guò)這些代謝物富集通路分析，發(fā)現(xiàn)D-谷氨酰胺和谷氨酸代謝等6條代謝通路，提示脾虛濕盛證肝癌的形成、發(fā)展與這6條代謝路徑紊亂密切相關(guān)。通過(guò)四君子湯干預(yù)后，可經(jīng)過(guò)以上代謝通路使得部分潛在生物標(biāo)志物回調(diào)，從而改善脾虛濕盛證肝癌造成的氨基酸代謝、脂類代謝、花生四稀酸代謝等紊亂，對(duì)相關(guān)機(jī)體功能紊亂起到保護(hù)和調(diào)節(jié)作用，改善脾虛濕盛證肝癌患者的疾病狀態(tài)。

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（收稿日期：2019-11-12 ?本文編輯：李亞聰）