陳中偉 夏 清 黃清清 孫 俊 徐 斌 姜 松

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鎮(zhèn)江 212013)

(江蘇大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究院2，鎮(zhèn)江 212013)

我國是小麥生產(chǎn)和消費(fèi)大國，小麥的年產(chǎn)量和年消費(fèi)量約達(dá)1.26億t和1.2億t[1, 2]。然而，國內(nèi)全麥粉及全麥?zhǔn)称芳庸I(yè)發(fā)展緩慢。目前，回填法加工全麥粉由于能耗低、與現(xiàn)有裝備銜接性好，是國內(nèi)加工全麥粉的主流方法。麥麩是小麥粉加工的主要副產(chǎn)物，富含膳食纖維、酚類、B族維生素和礦物質(zhì)等，具有促進(jìn)平衡膳食、益生腸道、調(diào)脂降糖等功能[3-5]，是回填法加工全麥粉的主要原料之一。然而，由于缺乏相應(yīng)的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和量化測定手段，麥麩添加量無法準(zhǔn)確測定，市場上的全麥粉質(zhì)量層次不齊，難以得到消費(fèi)者認(rèn)可。

目前，已有關(guān)于麥麩結(jié)構(gòu)層的標(biāo)示成分的研究。法國農(nóng)科院團(tuán)隊(duì)對歐美小麥的麥麩結(jié)構(gòu)層標(biāo)示成分的研究結(jié)果表明，阿魏酸脫氫三聚體、烷基間苯二酚(ARs)、p-香豆酸、植酸分別富集在外果皮、中間層、糊粉層細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)容物中，可定量標(biāo)示外果皮、中間層、糊粉細(xì)胞壁、糊粉細(xì)胞質(zhì)的含量[6-8]。然而，小麥的生化組成及含量受品種和種植地域的影響很大[9-11]。因此，國內(nèi)小麥產(chǎn)品的判定不能套用國外品種的數(shù)據(jù)，需要建立以國產(chǎn)小麥品種為基礎(chǔ)的測定數(shù)據(jù)。然而，目前針對國內(nèi)小麥品種麩皮結(jié)構(gòu)層標(biāo)示物的研究缺乏，難以為國內(nèi)全麥粉及全麥?zhǔn)称返恼鎮(zhèn)闻卸ㄌ峁┲巍?/p>

本研究選取具有代表性的6種國產(chǎn)小麥品種(2種紅麥和4種白麥)，手工剝離獲取麥麩結(jié)構(gòu)層，然后通過微觀染色、顯微觀察，獲取小麥結(jié)構(gòu)層的微觀結(jié)構(gòu)特征；并利用HPLC、顯色法等方法分別定量測定麥麩結(jié)構(gòu)層中的酚酸、酚脂和磷等生化成分的含量，得出各結(jié)構(gòu)層中相關(guān)標(biāo)示物的組成及含量，并對其準(zhǔn)確性進(jìn)行定量驗(yàn)證，以期為全麥粉及全麥?zhǔn)称返亩ㄐ院投颗卸ㄌ峁﹨⒖肌?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅麥(云麥42、云麥59)、白麥(鄭麥9023、濟(jì)麥22、川麥107、煙農(nóng)21)：購于小麥種站；麥麩；p-香豆酸(色譜純)、3,4,5-三甲氧基肉桂酸(色譜純)、橄欖醇(色譜純)；阿魏酸(98%)、乙酸乙酯(分析純)；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外分光光度計(jì)；SBA-40C葡萄糖分析儀；Aglient1260高效液相色譜儀、色譜柱：Eclipse Plus Phenyl-Hexyl column(5 μm, 250 mm×4.6 mm)、ZORBAX C18 column (5 μm，250 mm×4.6 mm)、 CX-31顯微鏡和CX-51熒光顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小麥麩皮結(jié)構(gòu)層的手工剝離制備

取小麥籽粒10 g，在4 ℃條件下用水浸泡24 h。利用鑷子從麥芒一端剝離外果皮，同時(shí)去除胚芽。然后，將剝離外果皮后的小麥籽粒繼續(xù)浸泡至松軟，將小麥籽?？v向切成兩半，刮盡胚乳，得到中間層和糊粉層。最后，將糊粉層輕輕刮下，剩余的結(jié)構(gòu)層為中間層。將樣品干燥至12%含水量后，稱量獲得麥麩各結(jié)構(gòu)層的質(zhì)量比例[12]。

1.3.2 麥麩結(jié)構(gòu)層的顯微結(jié)構(gòu)觀測方法

表面顯微結(jié)構(gòu)觀測：將麥麩各結(jié)構(gòu)層樣品置于蓋玻片上，滴加去離子水后加蓋玻片，置于顯微鏡下觀測，選取具有代表性的圖片。截面顯微結(jié)構(gòu)觀測：切片的制備、染色過程及觀測方法參考文獻(xiàn)[13, 14]。截面結(jié)構(gòu)切片的制備：取15 mL去離子水于25 mL燒杯中，加入1 g瓊脂后置于沸水浴中溶解。添加0.5 g麥麩結(jié)構(gòu)層粉末，攪拌均勻，利用超聲脫氣(脫氣期間溫度不低于45 ℃)。脫氣后迅速將燒杯置于-18 ℃，待瓊脂凝固后切成1 cm小塊。將瓊脂塊置于1%戊二醛溶液中12 h，然后利用冷凍切片機(jī)切出厚度為8 μm薄片，置于載玻片上，晾干后，分別用1%酸性品紅-乙醇溶液和0.01%熒光增白劑-水溶液染色2 min，洗去多余染色液，晾干封片。利用熒光顯微鏡(400～410 nm)進(jìn)行觀測，選取代表性的樣品圖片。

1.3.3 酚酸含量測定

稱取麥麩各結(jié)構(gòu)層(過150目篩)20 mg，加入10 mL的2.0 mol/L的NaOH溶液，充氮后置于恒溫?fù)u床中，在35 ℃，120 r/min的黑暗條件下水解2 h。然后，加入50 μL的1 mg/mL的3,4,5-三甲氧基肉桂酸的50%甲醇水溶液作為內(nèi)標(biāo)物，并用6 moL/L鹽酸中和至pH=2。用20 mL乙酸乙酯分萃取兩次，合并萃取液并濃縮至2 mL。利用氮?dú)獯蹈珊螅尤?.8 mL的50%甲醇復(fù)溶。最后，用0.45 μm有機(jī)相微濾膜過濾后，用于HPLC測定，并根據(jù)文獻(xiàn)方法計(jì)算含量[15]。酚酸的高效液相色譜測定方法：檢測器：紫外檢測器；波長：325 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：A：1 mmol/L三氟乙酸水溶液；B：乙腈/1 mmol/L三氟乙酸水溶液(90∶10，V/V)；流速：1 mL/min；柱溫：45 ℃；流動相梯度：0～15 min：85% A；15～20 min：82% A；20～25 min：80% A；25～55 min：72% A；55～58 min：55% A；58～60 min：85% A。

1.3.4 烷基間苯二酚含量測定

稱量0.2 g待測樣品，加入50 μL的1 mg/mL橄欖醇-甲醇溶液作為內(nèi)標(biāo)物，加入20 mL乙酸乙酯，在25 ℃避光條件下振蕩提取24 h。然后，在4 000×g條件下離心15 min，取4 mL上清液用氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶于1 mL甲醇中。最后，用0.45 μm有機(jī)相微濾膜過濾，密封后供HPLC分析，液相測定條件：Angilent 1260；ZORBAX C18 column色譜柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；熒光檢測器，激發(fā)波長276 nm；發(fā)射波長306 nm；流速：1 mL/min；柱溫：59 ℃；流動相A：甲醇/水(89∶11，V/V)；流動相B：甲醇/水(99∶1，V/V)；流動相梯度：0 min，A∶B (100∶0)；6 min，A∶B (75∶25)；18 min，A∶B (0∶100)；20 min，A∶B (100∶0)；22 min，A∶B (100∶0)[16]。

1.3.5 總磷含量測定

參照GB/T 6437—2002測定總磷含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 國產(chǎn)小麥品種麩皮結(jié)構(gòu)層的比例及顯微結(jié)構(gòu)

2.1.1 國產(chǎn)小麥品種中麩皮結(jié)構(gòu)層的比例

圖1為手工剝離所得小麥麩皮結(jié)構(gòu)層。中間層的色澤最深，呈棕黃色；糊粉層的色澤最淺，呈乳白色。由于糊粉層是胚乳最外層，其色澤接近于胚乳細(xì)胞；外果皮呈淺黃色，具有半透明性。

圖1 手工剝離所獲小麥麩皮結(jié)構(gòu)層(云麥59)

表1列出了6種國產(chǎn)小麥的麥麩結(jié)構(gòu)層相對比例。麩皮所占麥粒的比例約為18%，其中白麥總體略高于紅麥；麥麩中外果皮所占比例最小，其次為中間層，糊粉層所占比例最大，約占50%。紅麥外果皮比例略高于白麥，而糊粉層在白麥中所占比例略高于紅麥。6種小麥中，糊粉層和中間層所占比例的品種間極差較小(<10%)，外果皮的極差較大(20%)，同時(shí)國內(nèi)小麥品種與國外品種也有一定差異[17]。

表1 6種中國小麥中麥麩及其結(jié)構(gòu)層的相對比例

注：同列中相同字母代表在P<0.05水平無顯著差異，不同字母代表有顯著性差異。

2.1.2 小麥麩皮結(jié)構(gòu)層的表面顯微結(jié)構(gòu)

圖2為小麥麩皮結(jié)構(gòu)層的顯微結(jié)構(gòu)，分別選取了具有代表性的白麥(濟(jì)麥22)和紅麥(云麥59)。如圖2所示，外果皮由狹長的纖維狀細(xì)胞交替構(gòu)成，細(xì)胞大小約為80 μm×40 μm(圖2a1)。中間層由內(nèi)果皮、種皮和透明層組成(圖2b1)。紅麥的中間層(圖2b2)色澤較深，種皮中呈現(xiàn)棕色斑點(diǎn)，白麥的中間層中未呈現(xiàn)色素斑點(diǎn)。糊粉層(圖2c1和圖2c2)由大小約為50 μm的不規(guī)則的細(xì)胞組成，與外果皮的纖維狀細(xì)胞不同，糊粉層細(xì)胞厚大，透光率低。小麥麩皮結(jié)構(gòu)層的顯微結(jié)構(gòu)具有明顯不同，可以通過顯微觀測輕易分辨。

注：a1、b1和c1為白麥(濟(jì)麥22)的外果皮、中間層(Tc：種皮；Nu：珠心層；Cc：橫狀細(xì)胞)及糊粉層；a2、b2和c2為紅麥(云麥59)的外果皮、中間層及糊粉層；圖中標(biāo)尺為200 μm。圖2 小麥麩皮結(jié)構(gòu)層的表面顯微結(jié)構(gòu)

2.1.3 小麥麩皮結(jié)構(gòu)層的截面顯微結(jié)構(gòu)

圖3為剝離前后小麥麩皮的橫截面顯微結(jié)構(gòu)。經(jīng)酸性品紅和熒光增白劑染色后，麥麩糊粉層為粉紅色(圖3a)，主要是由于麥麩糊粉層中的蛋白質(zhì)與酸性品紅結(jié)合造成。圖3b為熒光下麥麩結(jié)構(gòu)層的微觀結(jié)構(gòu)。在紫外光激發(fā)下，糊粉層的細(xì)胞壁呈亮藍(lán)色，其內(nèi)容物則呈暗紅色；而外果皮和中間層由于自發(fā)熒光呈黃綠色。圖3c～圖3e為剝離后麥麩結(jié)構(gòu)層的熒光顯微結(jié)構(gòu)。圖3c和3d為外果皮和中間層的截面顯微結(jié)構(gòu)，均呈現(xiàn)黃綠色，分別為長、短兩類纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)。由圖3e可知，糊粉層為單層厚細(xì)胞，經(jīng)熒光增白劑染色后，細(xì)胞壁呈亮藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)容物呈暗紅色。

經(jīng)酸性品種和熒光增白劑染色后，外果皮和中間層因自發(fā)熒光呈現(xiàn)黃綠色，糊粉層細(xì)胞壁和內(nèi)容物則呈亮藍(lán)色和暗紅色。通過觀察熒光激發(fā)條件下的麥麩截面顯微結(jié)構(gòu)，可以確定麥麩結(jié)構(gòu)層的剝離和富集情況。

注：a和b分別為光學(xué)和熒光顯微鏡下的麩皮結(jié)構(gòu)；c～e為剝離后的外果皮、中間層和糊粉層。圖3 麥麩截面顯微結(jié)構(gòu)

2.2 國產(chǎn)小麥品種麩皮結(jié)構(gòu)層的標(biāo)示物成分

通過顯微觀測可以確定麥麩結(jié)構(gòu)層的分離和富集情況，但要定量麥麩結(jié)構(gòu)層的添加比例，還需要采用標(biāo)示物法，即通過分析麥麩結(jié)構(gòu)層中的特有成分或含量差異懸殊的組分含量，然后計(jì)算結(jié)構(gòu)層在樣品中添加比例。研究表明，外果皮、中間層和糊粉層分別富含阿魏酸脫氫三聚體、烷基間苯二酚(ARs)和植酸[6-8]。因此，此部分對中國小麥麩皮結(jié)構(gòu)層中此類成分的含量進(jìn)行分析。

2.2.1 國產(chǎn)小麥品種麩皮結(jié)構(gòu)層中酚酸含量

如表2所示，外果皮、中間層和糊粉層中均含對位香豆酸和阿魏酸。其中，中間層的對位香豆酸含量最低，外果皮的平均含量最高，其次為糊粉層，這與文獻(xiàn)[6-8]結(jié)果有較大差異。在6種國產(chǎn)小麥的麩皮結(jié)構(gòu)層中，糊粉層中阿魏酸的含量均最高，中間層次之，約為外果皮中含量的2～3倍。已有結(jié)果表明，透明層的阿魏酸含量較高[17]。由于中間層包含透明層，因此，中間層中阿魏酸含量也較高。然而，阿魏酸只能粗略定性糊粉層和外果皮的富集程度，不足以作為麥麩結(jié)構(gòu)層的定量標(biāo)示物。

表3中為不同麥麩結(jié)構(gòu)層中阿魏酸二、三聚體的含量。由表3可知，外果皮中阿魏酸脫氫二聚體(DFA)的含量最高，分別是糊粉層和中間層中含量的3倍和4倍。6種小麥中，外果皮中DFA的含量隨品種變化的極差較大，而中間層和糊粉層中DFA的含量極差較小。有學(xué)者研究表明，阿魏酸脫氫三聚體主要分布在外果皮中[6, 7]，其中5-5’,8-O-4’阿魏酸脫氫三聚體(TriFA)可以作為外果皮的標(biāo)示物。而在本研究中，外果皮中5-5’,8-O-4’TriFA的含量很低，8-8’,8-O-4’TriFA的含量最高，分別是糊粉層和中間層含量的4.3倍和3.5倍。因此， 8-8’,8-O-4’TriFA可以作為大致定量外果皮的標(biāo)示物，但由于其在麥麩結(jié)構(gòu)層中差異性相對較小，不足以作為精確定量標(biāo)示物。

表2 不同小麥品種麩皮結(jié)構(gòu)層中主要酚酸單體的含量

表3 不同小麥品種的麩皮結(jié)構(gòu)層中阿魏酸脫氫聚體含量/mg/g

2.2.2 國產(chǎn)小麥品種麩皮結(jié)構(gòu)層中的烷基間苯二酚含量

麥麩中烷基間苯二酚主要由C17∶0、C19∶1、C19∶0、C21∶1、C21∶0、C23∶0、C23∶1和C25∶0八種同系物組成，其中C19∶0，C21∶0和C23∶0含量較高，見圖4。在麥麩結(jié)構(gòu)層中，中間層所含ARs最高，分別約為外果皮和糊粉層中含量的110倍和230倍，與國外小麥品種相似[18]，且ARs的含量在6種小麥品種間的極差較小，見表4。因此，ARs可作為定量中間層含量的標(biāo)示物。根據(jù)測定結(jié)果，中間層占小麥麩皮比重為30%，麥麩占小麥籽粒18%。根據(jù)AACC標(biāo)準(zhǔn)，國產(chǎn)全麥粉或全麥?zhǔn)称分?全麥粉>50%)，ARs的含量應(yīng)大于0.32 mg/g。國內(nèi)研究調(diào)查表明，國產(chǎn)全麥粉中AR含量只有0.12 mg/g[19]，遠(yuǎn)小于全麥粉標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 小麥麩皮結(jié)構(gòu)層中烷基間苯二酚類化合物的液相色譜圖(以中間層為例)

表4不同小麥品種的麩皮結(jié)構(gòu)層中烷基間苯二酚含量/mg/g

小麥品種外果皮中間層糊粉層濟(jì)麥22(白麥)0.086±0.0079.562±1.0800.037±0.002煙農(nóng)21(白麥)0.152±0.00612.792±1.9110.084±0.005鄭麥9023(白麥)0.068±0.00311.898±1.3530.040±0.003川麥107(白麥)0.151±0.00613.650±0.9280.070±0.006云麥42(紅麥)0.069±0.00411.092±1.5400.031±0.004云麥59(紅麥)0.122±0.00912.439±0.8470.046±0.001平均0.10811.900.051品種間極差0.0844.090.053

2.2.3 國產(chǎn)小麥品種麩皮結(jié)構(gòu)層中的總磷含量

國外學(xué)者一般以植酸作為麥麩糊粉層的標(biāo)示物。研究表明，麥麩中80%以上的磷以植酸形式存在，且富集在糊粉層中[8, 20, 21]；同時(shí)，與植酸測定相比，磷含量測定相對簡單，且測定精度較高。因此，采用總磷代替植酸作為麥麩糊粉層的定量標(biāo)示物。由表5可知，糊粉層中總磷含量最高，約為外果皮和中間層中含量的20倍?？偭卓勺鳛槎坑?jì)算糊粉層的標(biāo)示物。

表5 小麥麩皮各個(gè)結(jié)構(gòu)層中總磷含量/mg/g

2.3 小麥麩皮結(jié)構(gòu)層的定量方法驗(yàn)證

根據(jù)麥麩各結(jié)構(gòu)層標(biāo)示物成分匯總結(jié)果(表6)，建立麥麩結(jié)構(gòu)層的定量方法。

中間層比例= [ARs]樣品/[ARs]中間層×100%

糊粉層比例= [P]樣品/[P]糊粉層×100%

胚乳比例= [淀粉]樣品/[淀粉]胚乳×100%

外皮層比例= 100%-中間層比例-糊粉層比例-胚乳比例

式中：ARs為總烷基間苯二酚含量；P為總磷含量。

表6 小麥麩皮各結(jié)構(gòu)層中標(biāo)示物含量匯總

根據(jù)公式計(jì)算白麥(濟(jì)麥22)和紅麥(云麥59)的麥麩各結(jié)構(gòu)層的相對比例，與手工剝離的樣品進(jìn)行對比，驗(yàn)證結(jié)果見圖5。濟(jì)麥22的標(biāo)示物法計(jì)算所得糊粉層比例與手工剝離的比例相當(dāng)，云麥59的標(biāo)示物法計(jì)算得糊粉層比例較手工比例高2.8%，主要是因?yàn)樗鶞y的總磷中包含外果皮和中間層中的磷含量造成的。總體上糊粉層的比例與真實(shí)值的偏差為6%左右，非糊粉層部分與手工剝離結(jié)果的偏差小于10%(分別為7.1%和7.2%)。不同品種中小麥成分差異較大，可能也會影響標(biāo)示物法的準(zhǔn)確性。Hemery等[6]、Antoine等[7]和Ross等[22]曾利用標(biāo)示物法定量研究過歐洲小麥麩皮結(jié)構(gòu)層比例。結(jié)果表明，標(biāo)示物定量的準(zhǔn)確性與小麥品種具有較大相關(guān)性，但可以較為準(zhǔn)確的定量結(jié)構(gòu)層的比例。以所測定的標(biāo)示物含量平均值作為標(biāo)準(zhǔn)，可以較為準(zhǔn)確定量國產(chǎn)小麥品種中麥麩結(jié)構(gòu)層的添加比例。

圖5 麥麩結(jié)構(gòu)層比例(濟(jì)麥22和云麥59)的標(biāo)示物法定量結(jié)果與手工剝離結(jié)果的對比

3 結(jié)論

對6種國產(chǎn)小麥籽粒中的麥麩結(jié)構(gòu)層手工比例、顯微結(jié)構(gòu)觀測和標(biāo)示物成分分析，結(jié)果表明，國產(chǎn)小麥品種中麥麩及其結(jié)構(gòu)層的比例與國外小麥相似，麥麩結(jié)構(gòu)層比例的品種間差異較小。其次，外果皮、中間層和糊粉層的顯微結(jié)構(gòu)具有明顯區(qū)別，可以通過光學(xué)或熒光顯微鏡定性判定麥麩顆粒的大致添加量、組成和剝離情況。與外國小麥品種相似，國產(chǎn)小麥品種麩皮的ARs主要富集在中間層中，平均含量為11.9 mg/g，小于國外小麥品種中含量；國產(chǎn)小麥中糊粉層中磷的平均含量達(dá)28.7 mg/g，約為非糊粉層中磷含量的20倍，可以用于定量標(biāo)示糊粉層的含量；p-香豆酸、阿魏酸及阿魏酸二、三聚體雖然在外果皮中有一定的富集性，但不足于作為準(zhǔn)確定量外果皮的標(biāo)志物。ARs和總磷可分別作為定量中間層和糊粉層的標(biāo)示物，而外果皮的含量可間接計(jì)算獲得。以本文所獲方法和數(shù)據(jù)，可以較為準(zhǔn)確地定性和定量判定國產(chǎn)全麥產(chǎn)品的真?zhèn)魏望滬煹南鄬μ砑颖壤?/p>