戴 謙，黃 斐，王宇鵬，黃 傲，成劍文，潘柏申，郭 瑋，周 儉，樊 嘉，楊欣榮，王蓓麗

（1.復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032）

肝內(nèi)膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）約占原發(fā)性肝臟腫瘤的10%～15%，惡性程度高，5年生存率不到10%[1-2]。雖然手術(shù)切除是目前ICC首選的治療方式，但由于缺乏有效的早期診斷方法，有近70%的患者并沒有機會接受手術(shù)治療，只能采取放療和化療等姑息療法，導致中位生存時間僅為1.8個月，而手術(shù)切除的中位生存時間為12.2個月[3]。目前，臨床常用的影像學檢查尚不能準確鑒別ICC與原發(fā)性硬化性膽管炎、肝內(nèi)膽管結(jié)石等疾病。而血清學指標如糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等的敏感性、特異性均難以滿足臨床需求[2]。因此尋找更有效的ICC早期預警、復發(fā)監(jiān)測、預后評估及療效監(jiān)測方法是實現(xiàn)ICC患者早診、早治、改善預后的關(guān)鍵[4-5]。

目前多采用腫瘤組織進行基因檢測。然而，對于ICC來說，不僅腫瘤組織取材困難，且瘤內(nèi)異質(zhì)性高，不同位點僅有46.8%的突變基因一致率[6]，一些常見突變基因如BRAF、KRAS、EGFR等在腫瘤組織中的檢出率均不足30%[7-8]，且不同ICC患者的高頻突變基因譜也不盡相同[9]。由此可見，單一、特定的突變標志物在ICC診療中的作用有限，所以篩選我國ICC相關(guān)的突變基因并建立多個相關(guān)基因的診療譜具有重要意義。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）以其半衰期短、無創(chuàng)、可反映腫瘤原發(fā)灶整體突變負荷等優(yōu)勢為這些問題的解決帶來了希望。由于ctDNA僅占血漿循環(huán)DNA總量的1%，目前臨床常用的檢測技術(shù)無法對其準確定量。數(shù)字聚合酶鏈反應（digital polymerase chain reaction，dPCR）是通過單分子擴增實現(xiàn)核酸拷貝數(shù)絕對定量的第3代PCR技術(shù)，具有極高的敏感性和特異性，是目前ctDNA突變定量檢測的優(yōu)選方案。本團隊前期研究已對ICC患者的腫瘤、癌旁組織及外周血進行了全外顯子測序，并參考其他基于ICC組織的大規(guī)模測序文獻[7，10-11]，篩選出3個在外周血及腫瘤組織中特異存在的高頻突變基因（KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C）。本研究旨在建立檢測上述3種突變的dPCR平臺，并初步評估該平臺的基本檢測性能及臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2018年12月在復旦大學附屬中山醫(yī)院行切除手術(shù)的ICC患者22例，其中男17例、女5例，年齡52～78歲。ICC診斷標準：CA19-9升高或具有影像學特征，且由病理科明確診斷為ICC。ICC患者腫瘤組織樣本來自手術(shù)切除組織，用福爾馬林固定后制成石蠟包埋組織切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色并由病理科評估，以保證有足夠的腫瘤細胞用于后續(xù)檢測。選取2019年7—8月在復旦大學附屬中山醫(yī)院行切除手術(shù)的肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者10例作為疾病對照，其中男8例、女2例，年齡38～66歲。HCC診斷標準參考《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》中的診斷標準，所有患者均經(jīng)病理診斷確診為HCC。選取2018年1—12月復旦大學附屬中山醫(yī)院體檢健康者10名作為正常對照，其中男7名、女3名，年齡42～60歲，均經(jīng)過血液檢查、影像學檢查和臨床檢查排除肝、膽及其他臟器疾病。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變型及野生型質(zhì)粒自行構(gòu)建。限制性內(nèi)切酶（XholⅠ和EcoRⅠ）購自大連 TaKaRa公司，普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（批號03116）購自北京天根生化技術(shù)有限公司，石蠟切片樣本DNA分離試劑盒（批號H21507150X）及血清/血漿游離DNA分離試劑盒（批號H21506020Y）均購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，TaqMan Genotyping MatserMix及ABI 7500定量PCR擴增儀均購自美國 Life Technologies公司，QX100微滴式dPCR系統(tǒng)和液滴穩(wěn)定劑、Mini-Protean型垂直電泳儀、SYSTEM GelDoc XR IMAGELA成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2.2 質(zhì)粒DNA制備 采用限制性內(nèi)切酶酶切野生型和KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變型質(zhì)粒，使其成為線性短鏈DNA，經(jīng)普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣本DNA制備 取ICC患者10 μm厚的石蠟包埋組織切片5張，依照石蠟切片樣本DNA分離試劑盒說明書要求抽提組織DNA，溶于100 μL洗脫液中，置-80℃保存?zhèn)溆?。采集ICC、HCC患者手術(shù)前的靜脈血10 mL，采集正常對照者靜脈血10 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，900×g離心10 min，吸取上清液，16000×g再次離心10 min，以徹底去除血漿中剩余的有核細胞，根據(jù)血清/血漿游離DNA分離試劑盒說明書，提取血漿游離DNA，溶于50 μL洗脫液中，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物及探針 參考文獻[11]，采用Primer Express軟件（美國ABI公司）分別設(shè)計KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變引物及探針。見表1。

表1 KRAS、TP53、IDH1突變引物及探針序列

1.2.5 建立dPCR檢測平臺 dPCR的原理主要是基于SYKES等[12]提出的模板無限稀釋及泊松分布定量檢測理論，在傳統(tǒng)PCR擴增前對樣本進行微滴化處理，將含有核酸分子的反應體系稀釋為1000萬份pL級微滴，使每個微滴分配有一個至數(shù)個待檢核酸分子或不包含待檢核酸分子，隨后經(jīng)PCR擴增后，對每個微滴進行逐次檢測，根據(jù)野生型與突變型微滴種熒光信號的有無進行判讀，最終得出待測突變的豐度。反應體系：TaqMan Genotyping MatserMix 10 μL，10 μmol/L上游和下游引物各0.9 μL，10 μmol/L野生型和突變型探針各0.5 μL，模板（ctDNA）6.0 μL，去離子水1.2 μL，終體積為20 μL。反應條件：95℃酶活化10 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，60℃延伸15 s，45個循環(huán)；98℃孵育10 min，最終降溫至12℃。

1.3 dPCR平臺檢測性能評估

1.3.1 準確性評估 將KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變型質(zhì)粒分別配制成高、中、低（KRASG12D：5%、1%、0.5%；TP53 C242S：5%、1%、0.5%；IDH1：7.8%、1.56%、0.78%）3個豐度的標準品，每種突變類型的每個豐度重復檢測3次，要求定量結(jié)果與理論值的偏差≤±15 %。

1.3.2 精密度評估 自制KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變高、低2個豐度的混合標準品，每個豐度分裝后保存于-20℃直至檢測，批內(nèi)重復檢測8次，計算批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）；每批重復檢測2次，連續(xù)檢測5 d，計算批間CV。CV≤20%為符合要求。

1.3.3 空白限（limit of blank，LOB）評估 自配僅含3種基因的野生型質(zhì)粒（2×105拷貝/μL），計算由錯配產(chǎn)生的假陽性液滴數(shù)。dPCR為絕對定量，1滴代表1拷貝。

1.3.4 功能靈敏度評估 將KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C突變型質(zhì)粒分別倍比稀釋為20000、2000、200、20和2 拷貝/μL，各自與等量野生型質(zhì)粒（2×105拷貝/μL）混合，得到濃度分別為10%、1%、0.1%、0.01%和0.001%的標準品質(zhì)粒。每個濃度重復檢測5次，滿足CV＜20%的標準品質(zhì)粒最低分子豐度為功能靈敏度。

1.3.5 線性評估 分別重復檢測10%、5%、1%和0.1%的標準品質(zhì)粒3次，各濃度的檢測偏差百分比＜15%，且曲線的回歸系數(shù)（r2）＞0.99可判斷為線性。

1.3.6 臨床應用評估 將KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C這3種突變命名為ctDNA突變譜。采用建立的ctDNA突變譜dPCR平臺檢測22例ICC患者和10例HCC患者、10名正常對照者外周血ctDNA突變情況，初步評估該平臺的檢測效能。22例ICC患者術(shù)前外周血及腫瘤組織分別采用Oseq-ctDNA及Oseq-T靶向測序平臺（華大基因公司）檢測，評估這2種平臺與自建dPCR平臺的一致性。ICC患者行切除術(shù)后每6個月采集1次外周血并跟蹤隨訪，平均隨訪時間為22.3個月，以患者死亡為隨訪終點。結(jié)合影像學及血清腫瘤標志物檢查結(jié)果，初步評估dPCR平臺在ICC患者術(shù)后療效監(jiān)測及預后評估中的作用。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單側(cè)泊松分布公式計算LOB。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學評價

2.1.1 準確性評估KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C突變3個豐度的檢測結(jié)果與理論值的偏差均＜±15 %，符合要求。見表2。

表2 dPCR平臺檢測3種突變的準確性 /%

2.1.2 精密度評估KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C突變高、低2個豐度的批內(nèi)精密度（CV）和批間精密度（CV）均＜20%，符合要求，見表3。

2.1.3 LOBKRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C突變的平均假陽性液滴數(shù)分別為4、3、3滴，為減少檢測臨床樣本的假陽性結(jié)果，將3種突變的LOB統(tǒng)一設(shè)定為4滴。見圖1。

2.1.4 功能靈敏度 dPCR平臺的功能靈敏度可達0.1%，見表4。

表3 dPCR平臺檢測3種突變高、低豐度的批內(nèi)和批間精密度結(jié)果

圖1 dPCR平臺檢測3種突變的LOB評估

表4 dPCR平臺檢測3種突變的功能靈敏度 /%

2.1.5 線性評估 線性回歸分析結(jié)果顯示，KRASG12D、TP53 C242S和IDH1 R132C預期值與實測值的線性回歸方程分別為Y=0.9720X+1.029（r2=0.9987，P＜0.01）、Y=0.9757X+0.05599（r2=0.9971，P＜0.01）、Y=1.033X+0.07856（r2=0.9962，P＜0.01）。在0.1%～10.0%范圍內(nèi)線性良好。見圖2。

2.2 dPCR平臺的臨床應用評估

2.2.1 dPCR平臺檢測22例ICC患者3種基因突變的結(jié)果 采用建立的dPCR平臺檢測22例ICC患者的3種基因突變，有7例患者為陽性，見表5；10例HCC患者及10名正常對照者均為陰性。

圖2 dPCR檢測3種突變的線性評估

表5 7例ICC患者3種基因突變檢測陽性結(jié)果

2.2.2 ctDNA突變譜和CA19-9單項及聯(lián)合檢測診斷ICC的效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示，ctDNA突變譜診斷ICC 的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.659，敏感性為31.8%，特異性為100%；CA19-9診斷ICC 的AUC為0.773，最佳臨界值為＞37 U/mL，敏感性為54.5%，特異性為100%；ctDNA突變譜與CA19-9聯(lián)合檢測診斷ICC的AUC為0.841，敏感性為68.2%，特異性為100%。見圖3。

2.2.3 dPCR與Oseq-ctDNA及Oseq-T靶向測序的一致性 dPCR檢測22例ICC患者外周血3種基因突變結(jié)果與Oseq-T測序結(jié)果的一致性為100%。dPCR平臺與Oseq-ctDNA測序結(jié)果有較高的一致性（kappa=0.792，P=0.007），其中患者7采用dPCR檢測到0.12%的KRASG12D突變豐度，在腫瘤組織樣本中同樣也檢測到該突變，但Oseq-T靶向測序卻未在外周血中檢測出該突變。

圖3 ctDNA突變譜和CA19-9單項及聯(lián)合檢測診斷ICC的ROC曲線

2.2.4 跟蹤隨訪 對7例dPCR陽性患者中的3例（患者3、患者9、患者7）進行治療后跟蹤隨訪，每間隔6個月檢測1次ctDNA突變譜。3例患者中有1例失訪（患者9）?；颊?在行切除術(shù)后ctDNA突變譜載量顯著降低，但術(shù)后18個月時再次檢測到KRASG12D突變（豐度0.33%），同時伴有CA19-9升高（45.6 IU/L），影像學檢查確認肝內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移灶，見圖4。患者7行切除術(shù)后采用GEMOX方案（吉西他濱、奧沙利鉑）進行鞏固治療，治療后ctDNA突變譜載量持續(xù)下降并最終轉(zhuǎn)為陰性，見圖5。

圖4 患者3 ICC突變基因譜、腫瘤標志物的變化及CT檢查結(jié)果

圖5 患者7 ICC突變基因譜及腫瘤標志物的變化

3 討論

ICC是僅次于HCC的第2位原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢[13-14]。我國的ICC患者例數(shù)遠高于歐美，約占全世界膽管癌患者的55%[15]，深入研究ICC有非常重要的意義。

由于缺乏典型的癥狀，ICC的早期診斷仍然較困難，CA19-9、CEA是目前較為有效的血清學指標，但在鑒別診斷膽道梗阻、肝內(nèi)膽管結(jié)石時，其敏感性與特異性均不理想[16]。近年來，隨著液體活檢技術(shù)的興起，ctDNA檢測成為當前腫瘤研究領(lǐng)域的新熱點，其在腫瘤早期診斷、預后評估、復發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測和療效預測等方面均具有廣闊的臨床應用前景。

ICC是存在高度異質(zhì)性的腫瘤。ZOU等[7]的研究結(jié)果顯示，ICC相關(guān)的突變基因可達25個，其中8個（TP53、KRAS、IDH1、PTEN、ARIDA、EPKK1、ECE2、FYN）可能為驅(qū)動基因。結(jié)合本團隊前期研究結(jié)果，其中TP53、KRAS、IDH1是最常見的突變基因，所以本研究選擇了這3個基因作為檢測對象。

目前，用于血漿ctDNA檢測的技術(shù)存在靈敏度低、定量不準確等缺陷，而dPCR以其獨特的檢測原理，能在大量體細胞DNA干擾的背景下對低頻突變進行準確的絕對定量（0.01%～1.00%）檢測。因此，本研究建立了檢測KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變的dPCR平臺，并評估了該平臺的檢測性能，結(jié)果顯示，該平臺的功能靈敏度可達0.1%，與文獻報道一致[17]。在0.1%～10.0%范圍內(nèi)該平臺的檢測結(jié)果呈線性，可對KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變進行準確的定量檢測。

采用dPCR平臺對22例ICC患者外周血進行檢測，ctDNA突變譜診斷ICC的敏感性為31.8%，特異性為100%，與CA19-9聯(lián)合檢測時可將敏感性提升至68.2%。由于本研究的入組例數(shù)過少，因此該平臺是否可作為ICC的輔助診斷工具還有待進一步研究。ctDNA突變的定量檢測可作為腫瘤診療隨訪的縱向觀察指標，適合對腫瘤負荷進行監(jiān)測。行惡性腫瘤根治術(shù)后，患者ctDNA可降至正常水平，如不能降至正常水平，提示可能有腫瘤病灶殘留[18]。有研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，ctDNA較糖類抗原153（carbohydrate antigen 153，CA153）、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）能更好地反映病情變化[19]。對2例ICC患者治療后的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示，外周血ctDNA突變豐度隨患者原發(fā)病灶的切除而降低，提示本研究建立的dPCR平臺可用于ICC患者治療后的隨訪監(jiān)測。另外，在治療過程中進行ctDNA突變的動態(tài)監(jiān)測，可提前預警獲得性耐藥的發(fā)生。在用表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體治療結(jié)腸癌的過程中，監(jiān)測ctDNA中的KRAS突變，可比常規(guī)方法提前10個月發(fā)現(xiàn)KRAS突變相關(guān)耐藥的發(fā)生[20]。本研究在1例ICC患者（患者3）的隨訪過程中觀察到KRASG12D突變在腫瘤切除術(shù)后18個月升高，與影像學檢查確認的復發(fā)時間一致。

目前尚無用于ICC治療的標準靶向藥物。雖然美國食品與藥品監(jiān)督管理局（U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）尚未批準針對本研究檢測的3個突變基因位點（KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C）的靶向藥物。但針對TP53突變的基因療法、靶向腫瘤疫苗和抗腫瘤藥物已處于臨床試驗階段，如STG-53、ALT-801、MK-1775等[21-22]，這些藥物在晚期實體腫瘤的治療中表現(xiàn)出了一定的療效。IDH1基因編碼異檸檬酸脫氫酶，這是一類在三羧酸循環(huán)中起重要作用的酶家族，該類酶依賴輔因子催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，是三羧酸循環(huán)中的限速步驟。IDH1基因及IDH2基因突變可導致蛋白功能受影響，突變的IDH1/IDH2編碼的異檸檬酸脫氫酶催化異檸檬酸變成2-羥戊二酸，而非α-酮戊二酸。目前，針對IDH1 R132C的靶向治療藥物有替莫唑胺[23]及AG-120[24]。替莫唑胺是一類具有抗腫瘤活性，含有咪唑四嗪環(huán)的烷化劑類抗腫瘤藥物，其本身無活性，屬于前體藥物，須在生理水平的pH值下經(jīng)非酶途徑轉(zhuǎn)化為活性化合物異硫氰酸甲酯，異硫氰酸甲酯可通過DNA鳥嘌呤的O6和N2位點上的烷基化（甲基化）發(fā)揮對腫瘤的細胞毒作用。1999年，美國FDA批準替莫唑胺用于治療難治性間變型星形細胞瘤。AG-120是小分子異檸檬酸脫氫酶1抑制劑，通過特異性結(jié)合IDH1突變的構(gòu)象，抑制突變構(gòu)象形成2-二羥戊酸，從而抑制細胞增殖和分化。目前，AG-120用于治療攜帶IDH1突變的實體瘤患者的臨床試驗（NCT02073994）正在開展，但尚未見IDH1抑制劑替莫唑胺及AG-120用于治療攜帶IDH1突變的肝膽癌患者的報道。

綜上所述，本研究建立了檢測外周血KRASG12D、TP53 C242S、IDH1 R132C突變的dPCR平臺，并初步評估了該平臺的檢測性能及臨床應用價值，但由于樣本量較少，其在ICC診斷中的價值還有待增加樣本量進一步研究。初步研究結(jié)果表明該平臺可用于定量檢測外周血ctDNA突變，適用于ICC患者的輔助診斷、術(shù)后療效評估及療效動態(tài)監(jiān)測等。該平臺的建立有助于推動ICC個體化治療的進展，為臨床提供更準確的患者基因突變信息。