雷公藤內(nèi)酯醇在不同種屬肝微粒中體外穩(wěn)定性性別差異研究*

劉萍霞 莊笑梅 李 錚 張玉杰 張振清

(1聯(lián)勤保障部隊(duì)廬山康復(fù)中心 江西九江 332000；2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所藥物代謝與藥代動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100850；3北京美迪克斯生物技術(shù)有限公司 北京 100012)

雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide， PG490)又名雷公藤甲素，是從中藥材雷公藤中分離出的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎、抗風(fēng)濕、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用，但由于毒性大，對(duì)皮膚和血管刺激性大限制了臨床的進(jìn)一步使用。目前，以PG490為母體進(jìn)行修飾后研發(fā)的新藥包括F60008、MC002[1-2]等。有文獻(xiàn)報(bào)道PG490在大鼠體外代謝動(dòng)力學(xué)存在性別差異[3]。課題組也進(jìn)行了另一項(xiàng)PG490在大鼠體內(nèi)代謝是否存在性別差異的研究，該實(shí)驗(yàn)主要是研究G490在體外不同種屬不同性別肝微粒體代謝特點(diǎn)，再結(jié)合動(dòng)物代謝性別差異體內(nèi)外相關(guān)性分析，最終通過(guò)人肝微粒代謝性別研究來(lái)初步推測(cè)藥物在人體內(nèi)是否存在代謝的性別差異。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

PG490，純度>98.5%，批號(hào)為020601，由北京美迪克斯生物技術(shù)有限公司提供；納曲酮，純度>99%，批號(hào)為051205，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。甲醇為色譜純，乙酸乙酯為分析純，甲酸銨為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為重蒸水。

Finnigan TM TSQ Quantum三級(jí)四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源(ESI)；Finnigan TM Surveyor自動(dòng)進(jìn)樣器和液相泵(美國(guó) Thermo公司)；離心濃縮儀(美國(guó)LABCONCO公司)；高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。XW-80A型漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；Sartorius BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，4Libror EB-330D電子分析天平(日本，島津)。

1.2 肝微粒體

肝微粒體來(lái)源均購(gòu)自于美國(guó)BD Gentest公司， 蛋白含量為20mg/mL，其中不同性別人肝微粒體為40人混合肝微粒體。

1.3 HPLC-MS/MSS 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Golden-C18柱(5μM，，2.1×100mm)(美國(guó)Thermo公司)，柱溫25℃。流動(dòng)相組成：甲醇：水(含5 mM甲酸銨)=55：45(v/v)，流速0.2mL/min。

質(zhì)譜檢測(cè)采用電噴霧(ESI)方式，正離子檢測(cè)，鞘氣壓力為23psi，輔助氣壓力為11psi，噴霧電壓4800V，毛細(xì)管溫度280℃，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解析電壓(Source CID)-10V。MC002、PG490和內(nèi)標(biāo)納曲酮檢測(cè)的m/z分別為446、361和3S42。選擇性離子(SRM)方式檢測(cè)m/z 446的碎片離子為m/z 165，m/z 361的碎片離子為m/z 128，m/z 342的碎片離子為m/z 324。Xcaliburl.4 SR1 采集分析數(shù)據(jù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 孵育體系各溶液的配置 ①肝微粒體：各種屬肝微粒體在冰浴中解凍，實(shí)驗(yàn)前用預(yù)先冰浴的緩沖液配置成1.25mg/mL待用。②NADPH啟動(dòng)劑的配置：稱(chēng)取12mgNADPH溶于1.44mL的緩沖液。③PG490的配置：甲醇溶解，緩沖液稀釋?zhuān)瑵舛葹?0μM使得有機(jī)溶劑的比例要低于0.5%。

1.4.2 反應(yīng)體系的組成 100μL藥物加入80μL肝微粒體預(yù)孵5min，加入20μL NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，于時(shí)間點(diǎn)加入終止劑(含內(nèi)標(biāo))，孵育時(shí)間為0、5min、15min、30min、1h、2h。

1.4.3 樣品處理 樣品渦旋混勻2min后，1200×g離心5min(4℃)，取上清液600μL，置離心濃縮儀30℃揮干，加入復(fù)溶劑溶液(組成與流動(dòng)相相同)100μL復(fù)溶，12 600×g離心10min(4℃)，上清液10μL進(jìn)樣。

1.4.4方法驗(yàn)證 PG490藥物在各種屬肝微粒體中的特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行了考察。各肝微粒空白雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，R2均大于0.99，日內(nèi)精密度<15%，準(zhǔn)確度在85～115%之間，均符合生物樣品檢定要求。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

將PG490在0時(shí)的濃度作為100%，其它時(shí)間點(diǎn)的濃度與0時(shí)的濃度相比得到PG490的剩余百分比。將各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比的自然對(duì)數(shù)與相應(yīng)的孵育時(shí)間作圖，經(jīng)直線回歸求得斜率( - κ )， 由公式(1)求得原藥微粒體代謝T1/2(min)，應(yīng)用 Well Stirred Mode l對(duì)微粒體的數(shù)據(jù)進(jìn)行外推可以得到 PG490在 3個(gè)種屬兩個(gè)性別肝中的固有清除率 CLint和肝清除率 CLh。

T1/2 = -0.693/κ

(1)

(2)

(3)

2 結(jié)果

藥物在大鼠肝微粒穩(wěn)定性有性別差異，PG490孵育2h后雄性肝微粒體中轉(zhuǎn)化了80%，而雌性大鼠轉(zhuǎn)化了20%。PG490在雌雄大鼠肝微粒中孵育的穩(wěn)定性比較見(jiàn)圖1。

圖1 PG490 在雌雄大鼠肝微粒中孵育不同時(shí)間

利用式(2)和式(3)計(jì)算出PG490大鼠肝中的固有清除率CLint和肝清除率CLh，見(jiàn)表1。而PG490在比格犬和人肝微粒體較穩(wěn)定，孵育2h均轉(zhuǎn)化不到15%，無(wú)法計(jì)算參數(shù)，未觀察到代謝的性別差異。

表1 PG490在大鼠肝微粒體中代謝動(dòng)力學(xué)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PG490在大鼠不同性別肝微粒中代謝統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異，而在比格犬和人肝微粒中沒(méi)有表現(xiàn)出性別差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，不同種屬PG490自身代謝特點(diǎn)不同，推測(cè)PG490的前體化合物如果在大鼠體內(nèi)代謝表現(xiàn)出的性別差異有可能在于活性代謝產(chǎn)物PG490自身代謝存在差異。

3 討論

肝微粒體中含有P450酶等主要參與藥物體內(nèi)代謝的酶，應(yīng)用肝微粒體孵育體系對(duì)化合物進(jìn)行代謝穩(wěn)定性研究能在很大程度上反映藥物在體內(nèi)的代謝速率。動(dòng)物肝微粒體制備方法成熟、保存方便，是很好的酶源。人源的肝微粒體雖然目前在國(guó)內(nèi)來(lái)源受限，但國(guó)外公司已能商品化提供不同性別的混合肝微粒體，為該部分研究提供了保證。

體外肝微粒實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)結(jié)果一致，也具有明顯性別差異，體內(nèi)外相關(guān)性好。而PG490在比格犬與人肝微粒的代謝均未顯示出自身代謝的性別差異。兩種動(dòng)物代謝性別差異存在種屬差異，PG490在大鼠體內(nèi)代謝有顯著性性別差異，而比格犬沒(méi)有差異，兩種動(dòng)物代謝特點(diǎn)體內(nèi)外相關(guān)性一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PG490在雌性肝微粒體中消除較慢(t1/2為69min)而雄性為21min，表明性別差異的原因在于代謝消除環(huán)節(jié)。藥物代謝差異主要表現(xiàn)在生物利用度、分布、代謝和消除，差異的形成主要是由于性別造成的體重、血容量、胃排空時(shí)間、血漿蛋白水平、CYP活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用和清除率活性的差別[4]。盡管大鼠PG490直接靜注給藥后代謝存在顯著的性別差異，但藥物在人體內(nèi)代謝的性別差異遠(yuǎn)沒(méi)有嚙齒類(lèi)動(dòng)物那樣明顯， 而且至今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人類(lèi)在酶亞型的表達(dá)上存在性別差異， 人體代謝上的差異更可能是遺傳、環(huán)境和飲食等因素造成的個(gè)體間差異的結(jié)果。因此，根據(jù)動(dòng)物體內(nèi)外代謝性質(zhì)相關(guān)性好和人源材料體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步推測(cè)，以及考慮到PG490主要的代謝酶CYP3A4性別差異不顯著，因而推測(cè)人體中MC002代謝不一定存在性別差異。