副溶血性弧菌毒素編碼基因的微量、可視化檢測

蘇晨麗，陳蘭明

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）隸屬于γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），弧菌目（Vibrionales），弧菌科（Vibrionaceae），弧菌屬（Vibrio），為革蘭氏陰性嗜鹽菌[1]。該菌是一種人的重要食源性致病菌，可引起腹瀉、腸胃炎、傷口感染、敗血癥等疾病，甚至死亡[2]。副溶血性弧菌主要產生兩種毒素，即耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）和TDH相關溶血素（TDH-related hemolysin，TRH）[3]，直接作用于人血液紅細胞或腸道上皮細胞，在靶細胞膜上形成通道，致其死亡[4]。TDH和TRH分別由tdh（740 bp）和trh（570 bp）基因編碼。流行病學研究發(fā)現，90%～99.8%的臨床分離副溶血性弧菌攜tdh或trh基因，而環(huán)境分離株中僅占0.2%～10%[5-7]。

迄今為止，國內外大量文獻報道了副溶血性弧菌污染檢測的微生物學、免疫學、分子生物學等方法[8-9]。其中，常規(guī)微生物培養(yǎng)方法（如GB 4789.7—2013《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》）[10]，檢測準確度高，但費時費力；免疫學方法雖縮短了檢測時間，但檢測的靈敏度較低；分子生物學方法，如聚合酶鏈式以應（polymerase chain reaction，PCR）、實時PCR、DNA微陣列等，具有省時省力、靈敏高和特異性強的特點，但是需要昂貴的儀器設備，現場樣本檢測受限。

Notomi等[11]建立了環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術，采用4～6 條特異性引物，以及DNA鏈置換BstDNA聚合酶在恒溫條件下擴增靶基因，具有檢測耗時短、靈敏度高、特異性強、不需要熱循環(huán)、操作簡便等特點。Tomita等[12]將鈣黃綠素引入LAMP以應體系，無需打開以應管蓋即可通過顏色變化判斷LAMP檢測結果，避免了檢測過程中氣溶膠的污染，縮短了檢測時間。近年，多重LAMP技術備受關注，主要有兩種形式：1）在同一以應管中設置多對引物進行LAMP以應，可是，引物之間的相互干擾和競爭限制了靶基因的擴增效率，且難以辨別以應產物的來源[13]；2）采用物理隔離，一般基于微流控芯片，然而，芯片的制造及其專用引物增加了檢測的成本[14]。因此，降低LAMP檢測的成本是目前該技術發(fā)展的重要方向。

在國內，已有涉及LAMP技術檢測副溶血性弧菌毒力基因的研究報道。程曉艷等[15]針對副溶血性弧菌tdh基因建立了LAMP檢測方法。然而，該方法需要在以應結束后打開以應管蓋，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，或在以應管中加入GeneFinderTM核酸染料，通過以應液的顏色變化判定以應結果。如上所述，開蓋檢測易造成氣溶膠污染，導致假陽性結果。黃夢詩等[16]針對副溶血性弧菌tlh基因，以羥基萘酚藍（hydroxynaphthol blue，HNB）作為指示劑建立了LAMP檢測方法。該指示劑陽性以應呈天藍色，陰性以應呈紫羅蘭色；顏色差異較小，影響結果的準確判讀。此外，這些LAMP檢測方法以塑料八連管為以應介質，在以應過程中因加熱可能造成以應混合液蒸發(fā)、泄露，從而導致假陽性結果；且LAMP以應為25 μL體系，檢測成本較高于PCR等方法。

本研究針對副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh，建立一種微量、可視化毛細管環(huán)介導等溫擴增（capillary LAMP，cLAMP）檢測方法，具有下列優(yōu)勢：1）采用毛細管作為LAMP以應載體，在毛細管的兩端用超純水（液體）、空氣（氣體）、強力膠（固體）密封。這些隔離層既避免了氣溶膠的污染，又避免了因加熱導致微量試劑蒸發(fā)而造成的實驗誤差；2）以鈣黃綠素熒光染料作為指示劑，陽性以應液呈綠色，陰性以應液呈橙色。顏色差異大，易于實驗結果的判讀；3）以應體系僅為5 μL，檢測成本是常規(guī)LAMP方法的20%。另外，不需要昂貴的儀器設備，操作簡便、特異性強、靈敏度高，為副溶血性弧菌產毒株微量、可視化檢測試劑盒的研發(fā)提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

副溶血性弧菌ATCC33847（tdh+trh－）、ATCC17802（tdh－trh+）菌株 美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；副溶血性弧菌CHN25（tdh－trh－）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，tdh－trh－）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，tdh－trh－）、大腸桿菌（Escherichia coli，tdh－trh－）、霍亂弧菌（V. cholerae，tdh－trh－）、創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus，tdh－trh－）、溶藻弧菌（V. alginolyticus，tdh－trh－）菌株為本實驗室保藏。

1.1.2 材料與試劑

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（thiosulfate citrate bile sucrose agar，TCBS）、Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術有限責任公司；ThermoPol Buffer（10×）、BstDNA聚合酶（8 U）、Magnesium Sulfate（MgSO4）Solution（100 mmol/L） New England Biolabs公司；dNTPs（10 mmol/L）、TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 寶生物工程（大連）有限公司；MnCl2·4H2O 生工生物工程（上海）股份有限公司；Betaine（5 mol/L）、鈣黃綠素 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；2×TaqMaster Mix 近岸蛋白質科技有限公司；D2000 DNA Marker、100 bp Marker、DNase/RNase-Free去離子水天根生化科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

MilliQ dH2O Millipore 法國Molsheim公司；Research?plus pipette移液器、Eppendorf臺式恒溫混勻器德國Hamburg公司；三恒電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；Molecular Imager?Gel Doc? XR+System自動凝膠成像掃描儀 美國Bio-Rad公司；DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司；ACB-A超凈工作臺 新加坡Esco Micro Pte Ltd公司；0.5 mm×100 mm玻璃毛細管上海醫(yī)藥集團股份有限公司；ergo強力膠 瑞士Kisling公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據副溶血性弧菌t d h（G e n B a n k I D：NC_004605.1）和trh（GenBank ID：CPO14047.2）基因的保守序列，采用Primer Explorer V軟件（http://primerexplorer.jp/e/）設計LAMP引物，包括外引物F3和B3、內引物FIP和BIP；采用SnapGene（4.1.9）軟件設計環(huán)引物LF和LB。寡核苷酸引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 LAMP和PCR引物及其序列Table 1 Sequrnces of primers used for LAMP and PCR

1.2.2 基因組 DNA 的提取

采用TaKaRa細菌基因組提取試劑盒，根據其說明書步驟，提取供試菌株的基因組DNA。采用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA樣品；凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄實驗結果；多功能酶標儀測定DNA樣品的濃度和純度。

參考胡元慶等[18]的方法，吸取培養(yǎng)至對數生長期的1 mL新鮮菌體培養(yǎng)液，在5 000 ×g離心2 min收集菌體沉淀，用1 mL無菌去離子水洗滌菌體沉淀2 次，用等量無菌去離子水懸浮菌體，吸取10 μL菌懸液于50 μL無菌去離子水中，在100 ℃煮沸10 min，迅速置于冰上冷卻，5 000×g離心2 min，吸取上清液，備用。DNA樣品的檢測方法如上所述。

1.2.3 LAMP以應體系

參照文獻[13,18]的方法，25 μL的LAMP以應體系包括：1×ThermoPol Buffer（含2.0 mmol/L Mg2+），8.0 mmol/L Mg2+，各0.2 μmol/L外引物（F3和B3），各1.6 μmol/L內引物（FIP和BIP），各0.8 mmol/L環(huán)引物（LF和LB），1.4 mmol/L dNTPs，0.32 UBstDNA聚合酶，2 μL DNA模板（20 ng/μL）。65 ℃以應60 min，80 ℃酶滅活10 min。

1.2.4 LAMP以應產物的檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳法、可視化染料檢測法兩種方法。電泳檢測：取5 μL LAMP以應產物與1 μL 6×Loading Buffer混勻后上樣，采用2%瓊脂糖凝膠在電壓100 V電泳45 min。電泳結束后，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄實驗結果。若電泳圖譜呈現出階梯狀DNA擴增條帶，則判斷結果為陽性；以之則為陰性?？梢暬瘷z測：在LAMP以應液中添加鈣黃綠素指示劑（0.5 mmol/L Mn2+、25 μmol/L鈣黃綠素），在自然光下觀察以應液的顏色變化。若以應液顯色為綠色，則判斷結果為陽性；若顯色為橘黃或無色，則判斷結果為陰性。

1.2.5 LAMP以應體系的優(yōu)化

分別優(yōu)化LAMP以應體系的Mg2+濃度（2、4、6、8、10、12 mmol/L）、dNTPs濃度（0.8、0.96、1.12、1.28、1.44、1.6、1.76 mmol/L）、BstDNA聚合酶使用量（0.32、0.48、0.64、0.8、0.96 U）、以應時間（30、40、50、60、70 min）、以應溫度（59、61、63、65、67 ℃）等參數。當對其中某一參數進行優(yōu)化時，其他參數則按照1.2.3節(jié)以應條件；3 次重復。

1.2.6 cLAMP以應體系的建立

將5 μL LAMP以應混合液吸入毛細管中，采用約7 μL超純水（液體）、空氣（氣體）及約10 μL強力膠（固體）密封毛細管兩端。以應條件參見1.2.3節(jié)。

1.2.7 cLAMP方法的靈敏度分析

將副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802菌株的純培養(yǎng)液或基因組DNA按10 倍梯度稀釋，采用LAMP、cLAMP和PCR方法進行檢測，結果判斷參見1.2.4節(jié)方法；3 次重復。

1.2.8 cLAMP方法的特異性分析

分別提取1.1.1節(jié)中供試菌株的基因組DNA，以其為模板（20 ng/mL）進行可視化cLAMP檢測，以應條件同1.2.3節(jié)；3 次重復。

1.2.9 常規(guī)PCR

PCR以應引物見表1。20 μL的PCR以應體系包括7 μL無菌超純水，10 μL 2×TaqMaster Mix，各1 μL上下游引物（5 ng/μL），1 μL模板DNA（20 ng/μL）。PCR條件為95 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，50～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)后，于72 ℃以應5 min。吸取PCR以應液6 μL上樣于2.0%瓊脂糖凝膠，在120 V電壓下電泳約30 min，采用1.2.4節(jié)方法進行檢測；3 次重復。

1.3 圖片分析方法

采用Molecular Imager?Gel Doc? XR+System自動凝膠成像掃描儀拍照、記錄瓊脂糖凝膠電泳實驗結果；采用1 600萬 像素（彩色）電子照相設備記錄可見光下以應管顯色結果。

2 結果與分析

2.1 LAMP以應體系的優(yōu)化

2.1.1 LAMP引物的特異性

圖1 LAMP分析副溶血性弧菌毒力靶基因tdh和trh引物的特異性Fig. 1 Specificity of the primers targeting tdh and trh genes of V. parahaemolyticus evaluated by LAMP assay

針對副溶血性弧菌毒力靶基因tdh、trh，本研究分別設計了3 對LAMP引物（表1），以副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802菌株的基因組DNA為模板進行LAMP以應。從圖1可以看出，ATCC33847菌株的tdh基因檢測為陽性，在可視化染料檢測中顯色為綠色（圖1A，以應管1），且在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中呈現階梯狀DNA擴增片段（圖1B，泳道1）；而ATCC17802菌株的trh基因檢測為陽性（圖1A，以應管3；圖1B，泳道3）；陰性對照則顯色為橘色且無擴增產物（圖1A，以應管2、4；圖1B，泳道2、4）。結果表明，針對靶基因tdh、trh設計的6 條LAMP引物特異性強。

2.1.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

圖2 Mg2＋濃度對LAMP檢測tdh和trh基因的影響Fig. 2 Effect of Mg2+ concentration on the LAMP assay

針對靶基因tdh，以副溶血性弧菌ATCC33847基因組DNA為模板，測定不同Mg2+濃度（2～12 mmol/L）對LAMP以應體系的影響（圖2）。在25 μL LAMP以應體系中，當Mg2+濃度為4～12 mmol/L時，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現階梯狀DNA擴增條帶（圖2B，泳道2～6），且當Mg2+濃度為6 mmol/L時，DNA條帶的清晰度和亮度最佳。相應的可視化染料檢測結果（圖2A，以應管2～6）與凝膠電泳檢測結果一致，即第2～6號以應管（4～12 mmol/L）顯色為綠色，呈陽性以應。在5 μL LAMP以應體系中，Mg2+最適濃度同樣為6 mmol/L。

針對靶基因trh，以副溶血性弧菌ATCC17802基因組DNA為模板，LAMP分析結果如圖2E～H所示。在25、5 μL LAMP以應體系中Mg2+的最適濃度均為8 mmol/L（表2）。

表2 LAMP反應條件的優(yōu)化Table 2 Optimal conditions for the LAMP system

2.1.3 dNTPs濃度的優(yōu)化

針對靶基因tdh，在25 μL以應體系中，當dNTPs濃度為0.8～1.28 mmol/L時，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現模糊的階梯狀DNA擴增條帶，且在可視化染料檢測中呈現綠色；當dNTPs濃度增加至1.44 mmol/L時，階梯狀DNA擴增條帶清晰度和亮度最佳，相應的可視化染料檢測結果呈現綠色。在5 μL LAMP以應體系中，dNTPs的最適濃度同樣為1.44 mmol/L（表2）。

針對靶基因trh，在25、5 μL以應體系中，dNTPs的最適濃度分別為1.44、1.28 mmol/L（表2）。

2.1.4BstDNA聚合酶使用量的優(yōu)化

針對靶基因tdh，在25 μL LAMP以應體系中，當BstDNA聚合酶使用量為0.32 U時，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現階梯狀DNA擴增條帶清晰度和亮度最佳，相應的可視化染料檢測結果與凝膠電泳檢測結果一致。在5 μL LAMP以應體系中，BstDNA聚合酶的最適使用量為0.48 U（表2）。

針對靶基因trh，在25、5 μL LAMP以應體系中，BstDNA聚合酶最適使用量分別為0.32、0.48 U（表2）。

2.1.5 以應時間的優(yōu)化

針對靶基因tdh，在25 μL以應體系中，當以應時間為50～70 min時，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現較為清晰的階梯狀DNA擴增條帶，相應的可視化染料檢測結果與凝膠電泳檢測結果一致。同樣，在5 μL LAMP以應體系中，最適以應時間為60 min。針對trh靶基因，在25、5 μL以應體系中最適以應時間均為60 min（表2）。

2.1.6 以應溫度的優(yōu)化

其次，有的學生做題時一旦遇到疑惑，便馬上翻開書本查找，這樣容易形成一種心理暗示，沒復習好不要緊，反正待會兒做的時候看書就可以了。在這種情況下，事先進行的復習也不過是走走形式而已，所以，做題要一氣呵成，如果確實遇到了難以解決的問題，先不要急著翻書，而是等著這部分練習全部做完后，再去查找、補查復習不到位的地方。這樣，就能借助練習找到自己的弱點，進行有針對性的復習，補足知識上的缺陷。

針對靶基因tdh，考察以應溫度（59～67 ℃）對LAMP以應體系的影響。在25 μL LAMP以應體系中，當以應溫度為65 ℃時，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現階梯狀DNA擴增條帶清晰度和亮度最佳，相應的可視化染料檢測結果與凝膠電泳檢測結果一致。在5 μL LAMP以應體系中最適以應溫度也為65 ℃。針對靶基因trh，在25、5 μL LAMP以應體系中最適以應溫度均為65 ℃（表2）。

2.2 cLAMP以應體系的建立

圖3 副溶血性弧菌ATCC17802及ATCC33847菌株的cLAMP檢測結果Fig. 3 cLAMP analysis of V. parahaemolyticus ATCC 17802 and ATCC 33847

根據優(yōu)化的5 μL LAMP以應體系，以毛細管為以應載體，以副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802菌株的基因組DNA為模板，cLAMP可視化染料的檢測結果如圖3所示。含有tdh、trh基因的第1、第3根毛細管均顯色為綠色，呈現陽性以應；陰性對照顯色為橘色或無色（第2、4號毛細管）。結果表明，本研究建立的微量cLAMP以應體系（5 μL）能夠正確擴增目標基因tdh、trh。

2.3 cLAMP方法的特異性

分別以副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802、CHN25菌株，以及6 種常見致病菌基因組DNA為模板，分析cLAMP的特異性，結果如圖4所示。針對靶基因tdh，僅副溶血性弧菌ATCC33847菌株的以應毛細管顯色為綠色（圖4E，毛細管9），且在相應的瓊脂糖凝膠電泳中檢測到階梯狀DNA條帶（圖4B、D，泳道9），呈現陽性以應；而副溶血性弧菌ATCC17802、CHN25菌株，以及嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌菌株的以應毛細管均顯色為橘色或無色（圖4E，毛細管1～8、10），呈現陰性以應，相應的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果與可視化染料檢測結果一致（圖4B、D，泳道1～8、10）。針對trh基因，分析結果顯示，僅副溶血性弧菌ATCC17802菌株的以應毛細管顯色為綠色（圖4J，毛細管9），且在對應的瓊脂糖凝膠電泳中檢測到階梯狀DNA條帶，呈現陽性以應；而不含有trh基因的毛細管均顯色為橘色或無色，且相應地無特異性DNA條帶產生。研究表明，針對靶基因tdh和trh的LAMP引物具有高度特異性，對副溶血性弧菌非毒力菌株，以及其他6 種常見的致病菌均不產生交叉以應。

圖4 cLAMP方法檢測靶基因tdh和trh的特異性Fig. 4 Specificity of the cLAMP assay for the tdh and trh genes

2.4 cLAMP方法的靈敏度

2.4.1 檢測副溶血性弧菌基因組DNA

圖5 cLAMP方法檢測基因組DNA靶基因的靈敏度Fig. 5 Sensitivity of the cLAMP assay for genomic DNA

針對靶基因tdh，以副溶血性弧菌ATCC33847基因組DNA為模板，在cLAMP以應體系中加入DNA模板的質量濃度為3×102～3×10-7ng/μL，研究結果顯示，cLAMP的最低檢測限為3 fg/μL（圖5E），與25 μL（圖5A、B）及5 μL（圖5C、D）LAMP以應體系檢測限一致，是普通PCR方法（圖5F）最低檢測限（3 pg/μL）的1/1 000。

由圖5可以看出，針對靶基因trh，以副溶血性弧菌ATCC17802基因組DNA為模板，在cLAMP以應體系中加入DNA模板質量濃度為3.4×102～3.4×10-7ng/μL，cLAMP最低檢測限為34 fg/μL，是普通PCR方法（圖5L）最低檢測限（34 pg/μL）的1/1 000。

2.4.2 檢測副溶血性弧菌純培養(yǎng)物

圖6 cLAMP方法檢測純培養(yǎng)物的靈敏度Fig. 6 Sensitivity of the cLAMP assay for bacterial culture

從圖6可以看出，針對靶基因tdh和trh，分別以副溶血性弧菌ATCC33847、ATCC17802菌株純培養(yǎng)物為模板，cLAMP方法最低檢測限分別為9.85×103、8.25×105CFU/mL，與25、5 μL LAMP以應體系的檢測限一致，分別是常規(guī)PCR檢測方法最低檢測限（9.85×105、8.25×106CFU/mL）的1/100和1/10。

3 討 論

副溶血性弧菌引起的食物中毒事件位居我國沿海地區(qū)微生物性食物中毒事件的首位，且逐年呈上升趨勢[19-20]。近年來，國內外有大量研究報道涉及水產品中副溶血性弧菌的污染，如比目魚（Pleuronectiformes）、牡蠣（Ostrea gigas thunberg）、貽貝（Mytilus edulis）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、藍蟹（Callinectes sapidus）等水產品中均檢出副溶血性弧菌污染[21-27]。傳統(tǒng)的微生物學方法和常規(guī)PCR技術成熟，但是存在耗時耗力，需要專門的儀器設備等不足之處。LAMP是一種新型核酸體外擴增技術，但是其檢測成本較高，LAMP以應中的BstDNA聚合酶價格相對昂貴。本研究針對副溶血性弧菌毒力靶基因tdh和trh，建立了微量（5 μL）cLAMP檢測方法，檢測成本縮減至常規(guī)LAMP方法的五分之一。

LAMP以應通常受多個因素影響，如Mg2+濃度、BstDNA聚合酶使用量、dNTPs濃度、以應時間、以應溫度等。本研究針對tdh和trh基因，分別設計了6 條特異性引物，并對以應體系中上述各因素分別進行了系統(tǒng)優(yōu)化，確定微量LAMP以應體系（5 μL）中各因素最適條件分別為：6 mmol/L（tdh）或8 mmol/L（trh）Mg2+、1.44 mmol/L（tdh）或1.28 mmol/L（trh）dNTPs、0.48 UBstDNA聚合酶、以應溫度65 ℃、以應時間60 min。針對tdh、trh靶基因，本研究建立的cLAMP方法檢測副溶血性弧菌基因組DNA的最低檢測限分別為3、34 fg/μL；檢測純培養(yǎng)物的最低檢測限分別為9.85×103、8.25×105CFU/mL。吳家林等[28]對副溶血性弧菌tdh基因的LAMP檢測靈敏度為101CFU/ml；張云怡等[29]建立的三重PCR方法檢測致病性副溶血性弧菌的靈敏度為102CFU/PCR以應。這些研究報道的檢測限均低于本研究方法對副溶血性弧菌純培養(yǎng)物的檢測。

鈣黃綠素需要通過與錳離子結合實現通過以應混合液顏色變化的判讀[30]，因此，鈣黃綠素與錳離子濃度的配比至關重要，直接影響最終判讀的實驗結果。探索開發(fā)陰性、陽性顏色差異大，易于區(qū)分的染料更適于本研究建立的cLAMP檢測方法。

4 結 論

針對副溶血性弧菌主要毒素編碼基因tdh和trh，本研究設計了特異性LAMP檢測引物；系統(tǒng)優(yōu)化了微量LAMP以應體系（5 μL）中各因素的最適以應條件：6 mmol/L或8 mmol/L Mg2+、1.44 mmol/L或1.28 mmol/L dNTPs、0.48 UBstDNA聚合酶、內外引物比8∶1、以應溫度65 ℃、以應時間60 min；建立了微量（5 μL）、特異性高、靈敏度強、低成本、可視化的快速檢測副溶血性弧菌產毒株的cLAMP方法，基因組DNA的最低檢測限分別為3、34 fg/μL，純培養(yǎng)物的最低檢測限分別為9.85×103、8.25×105CFU/mL。本研究結果為副溶血性弧菌產毒株微量、可視化檢測試劑盒的研發(fā)提供了技術支撐。