王燦銘,蘇 丹，, 應(yīng)莉莎,黃旻然, 吳映雪,胡錦林

隨著生物樣本庫(kù)的建立和科研需求，生物樣本庫(kù)中保存的肺組織不僅需要進(jìn)行核酸的提取，還需行HE染片。現(xiàn)將從生物樣本庫(kù)中保存的肺組織冷凍切片與常規(guī)術(shù)中肺組織冷凍切片的制作不同注意事項(xiàng)匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集浙江省腫瘤醫(yī)院生物樣本庫(kù)肺癌標(biāo)本90例，每例包括正常肺組織4塊，癌旁組織4塊，癌組織4塊。

1.2 材料英國(guó)產(chǎn)Thermo FSE型冷凍切片機(jī)。DEPC原液、甲醇、Gill改良蘇木精染液、醇溶性伊紅、梯度乙醇和二甲苯等。

1.3 方法(1)冷凍切片機(jī)徹底化霜，清洗干凈后擦DEPC原液，去除RNA對(duì)樣本的影響；(2)冷凍切片機(jī)箱體溫度設(shè)置-30 ℃，制作時(shí)速凍臺(tái)設(shè)置-50 ℃；(3)一次性切片刀在DEPC液中浸泡10 min后晾干，使用前用無(wú)水乙醇擦拭，每切一個(gè)樣本換一把新刀；(4)生物樣本庫(kù)取出樣本后放入干冰中保存，切片時(shí)直接從干冰中拿??；(5)將適量OCT包埋劑涂在冷凍樣本托上，稍冷凝后，將樣本包埋好，樣本托放置于速凍臺(tái)上，壓上冷凍錘至組織完全冷凍；(6)正常肺組織、癌旁組織切片厚6 μm，癌組織切片厚5 μm，勻速切片后入甲醇固定1 min；(7)進(jìn)行規(guī)范HE染色，封固；(8)組織去除OCT包埋劑后放入RNA保存液中低溫保存。

2 結(jié)果

通過(guò)該方法制作的冷凍切片，生物樣本庫(kù)提取的正常肺組織、癌旁組織細(xì)胞核清晰，癌組織結(jié)構(gòu)清晰完整，顏色鮮艷(圖1、2)。

①②

圖1正常肺組織：組織結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)染色鮮艷，對(duì)比度好
圖2肺癌組織：組織結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)染色鮮艷，對(duì)比度好

3 討論

生物樣本庫(kù)中肺癌組織制作冷凍切片后，剩余組織還需進(jìn)行RNA的提取，這就要求每一例標(biāo)本均不能被污染。在制作的前一天，要對(duì)冷凍切片機(jī)進(jìn)行徹底化霜，清洗干凈后擦DEPC原液，去除其他RNA對(duì)樣本的影響。一次性切片刀不能用高溫消毒，以免高溫破壞刀鋒而導(dǎo)致無(wú)法順利切片，可以在DEPC液中浸泡10 min后晾干，用無(wú)水乙醇擦拭后使用。對(duì)樣本托和鑷子等工具，每使用一次均需用無(wú)水乙醇擦拭。

與日常冷凍切片箱體溫度設(shè)置在-20 ℃不同[1]，從生物樣本庫(kù)保存的肺組織制作冷凍切片時(shí)的箱體溫度應(yīng)盡可能的低一些，設(shè)置約-30 ℃，速凍臺(tái)設(shè)置-50 ℃。由于肺組織的結(jié)構(gòu)比較疏松，血供豐富，腔隙較多，部分組織有較多的壞死和炎性分泌物，冷凍時(shí)間不能太久，否則易產(chǎn)生假象[2]。正常肺組織有大量的肺泡，切片時(shí)組織的支撐力不夠，溫度太高切片易產(chǎn)生皺褶，很難平整地切出。本組實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)切片2 h冷凍切片機(jī)的箱體溫度隨著切片時(shí)間的加長(zhǎng)而上升，當(dāng)箱體溫度為-20 ℃時(shí)，切片會(huì)吸附在切片刀座或防卷板上，很難平整地展片。這是由于肺組織從樣本庫(kù)提取后，在干冰中存放，樣本溫度接近-80 ℃，在切片時(shí)樣本的溫度也較低，樣本與切片刀座或防卷板的溫差較大，極易吸附。切片時(shí)除了手搖輪用力均勻，進(jìn)刀速度需迅速，避免切片因樣本支撐力度不足和溫差的影響而粘連。

樣本庫(kù)提取的組織較小，OCT包埋劑應(yīng)適量，用量太少切片時(shí)組織的支撐力不夠，不能很平整的出片；太多增加冷凍時(shí)間，切片時(shí)組織周邊會(huì)粘連，易出現(xiàn)皺折。調(diào)整防卷板至合適的位置尤為重要，防止切片卷曲和皺折。常規(guī)冷凍切片中常伴有冰晶存在，而減少冰晶的關(guān)鍵是速凍。由于細(xì)胞內(nèi)多數(shù)水分子以水化物的形式結(jié)合在蛋白質(zhì)或其他大分子的極性區(qū)域，部分水分子呈游離狀態(tài)，緩慢的冷凍使水分子向細(xì)胞間疏松區(qū)域游離、聚集，然后凝結(jié)成冰，等切片快速放入固定液后，冰融化留下空洞[3]。肺癌組織樣本在遭受多次冷凍/解凍循環(huán)后，對(duì)提取的RNA質(zhì)量和隨后的RT-PCR分析產(chǎn)生不利影響[4]，同時(shí)也會(huì)增加冰晶的產(chǎn)生，盡量一次性冷凍到位。本組制作的冷凍切片出現(xiàn)冰晶的情況極少，這主要是樣本在入庫(kù)時(shí)的溫度極低，達(dá)到速凍的條件，切片經(jīng)包埋后又在-50 ℃的速凍臺(tái)上速凍，快速越過(guò)產(chǎn)生冰晶的溫度，切片質(zhì)量明顯提高。

總之，從生物樣本庫(kù)保存的肺組織制作科研用冷凍切片時(shí)，我們?cè)谑炀毑僮鞯耐瑫r(shí)，需注意以下幾點(diǎn)：(1)準(zhǔn)備工作要做足，特別是冷凍切片的清洗與消毒，保證樣本不能被污染；(2)盡可能地增強(qiáng)組織的支撐力；(3)冷凍切片機(jī)的溫度要比常規(guī)冷凍切片時(shí)更低些，避免因溫差太大而切片吸附在防卷板或切片刀座上；(4)組織從干冰中提取后及時(shí)包埋冷凍，組織化開(kāi)后再次冷凍易產(chǎn)生冰晶及對(duì)RNA質(zhì)量的影響。只要我們按流程操作，掌握原理，不斷摸索、總結(jié)，通過(guò)各種方法提升自己的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和操作水平，并靈活正確的運(yùn)用到實(shí)際工作中，一定能制作出高質(zhì)量的冷凍切片。