孫 苗，徐文清，王 黎，龐月紅

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類由兩個(gè)及以上苯環(huán)稠合而成的持久性有機(jī)污染物，極易在食品加工過程(如燒烤、烘烤、熏烤、煎炸等)中產(chǎn)生[1-2]，對人體有非常強(qiáng)的致癌、致畸和致突變毒性[3-4]。苯并芘(BaP)是PAHs中致癌性最強(qiáng)的一種，是世界衛(wèi)生組織認(rèn)證的三大致癌物之一[5-7]，常作為PAHs的指標(biāo)化合物。因此，對食品中BaP含量的測定具有非常重要的意義。

目前，食品中BaP的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[8-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[7,11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[12-14]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[15-16]、熒光分析法和電化學(xué)方法[5,17]等。其中電化學(xué)發(fā)光法(ECL)作為一種新型的電化學(xué)及發(fā)光分析方法，由于具有儀器設(shè)備成本低、操作簡單、快速、靈敏度較高等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于食品及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域[18-20]。

共價(jià)有機(jī)骨架(COFs)是一類由輕元素(如H、B、C、N和O等)通過強(qiáng)共價(jià)鍵連接的結(jié)構(gòu)高度有序的新型晶型多孔材料，與其他材料相比，具有孔徑可調(diào)、孔隙率持久、熱及化學(xué)穩(wěn)定性較高、比表面積較大、可功能化等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于氣體儲(chǔ)存、催化、樣品前處理、色譜分析等領(lǐng)域[21-22]。近年來，已有將COFs材料應(yīng)用于電化學(xué)及傳感方面的研究報(bào)道，如孫淑敏等[23]合成三嗪基共價(jià)有機(jī)骨架/石墨烯復(fù)合材料，并研究其用作超級(jí)電容器電極材料的電化學(xué)性能；Banerjee 課題組[24]通過信號(hào)開、關(guān)兩種傳感機(jī)制將2D COF 納米片用于硝基芳香化合物的快速、高靈敏檢測；Zhang等[25]通過將制備的TAPB-DMTP-COFs復(fù)合材料與金納米結(jié)合構(gòu)成了一種檢測綠原酸的電化學(xué)傳感器。CTpPa-2是由功能化的1,3,5-三醛基間苯三酚(CTp)與2,5-二甲基對苯二胺(Pa-2)通過縮合反應(yīng)形成的一種亞胺類COF材料[26-27]，具有較好的結(jié)晶度、較大的比表面積、良好的穩(wěn)定性，并含有豐富的共軛結(jié)構(gòu)，其孔徑約為12 ?，略大于BaP的分子直徑(11.5 ?)。本文通過滴涂法將功能化的共價(jià)有機(jī)骨架材料CTpPa-2修飾至電極表面，建立了一種新型的基于共價(jià)有機(jī)骨架的BaP電化學(xué)發(fā)光傳感器，并將其用于烤肉樣品的測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-E型電化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)包括電化學(xué)分析儀和多功能化學(xué)發(fā)光檢測儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)；CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；LC-10A高效液相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；FE20K精密pH計(jì)(Mettler-Toledo Instr Ltd)；Milli-Q Integral Cabinet 3超純水系統(tǒng)(美國密里博公司)。

魯米諾(BBI生命科學(xué)有限公司);苯并芘(上海百靈威科技有限公司);過氧化氫、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、四氫呋喃、無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CTpPa-2修飾電極的制備玻碳電極(GCE)的預(yù)處理：依次采用3 μm和0.05 μm Al2O3粉末對裸玻碳電極研磨拋光至鏡面，然后在硝酸水溶液(1∶3,體積比)、乙醇和水中各超聲30 s、1 min、1 min，氮?dú)獯蹈珊螅捎醚h(huán)伏安法(CV)以0.03 V/s的掃速在10 mL 1 mmol/L鐵氰化鉀的電解液中進(jìn)行掃描，當(dāng)掃描的氧化峰和還原峰峰電位差(ΔEp)間隔小于0.1 V時(shí)，表明電極潔凈度較好。再經(jīng)水沖洗，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

CTpPa-2/GCE制備：將5.0 mg共價(jià)有機(jī)骨架材料CTpPa-2溶于5.0 mL乙醇溶液，超聲振蕩2 h后，與1%Nafion的乙醇溶液以1∶1體積比進(jìn)行混合并超聲至分散均勻。取5.0 μL混合溶液均勻滴于經(jīng)預(yù)處理的電極上，待電極表面晾干，標(biāo)記為CTpPa-2/GCE。

1.2.2 電化學(xué)測試及電化學(xué)發(fā)光檢測采用三電極體系，以CTpPa-2/GCE為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極，在1 mmol/L鐵氰化鉀電解液中以0.03 V/s的掃速進(jìn)行CV掃描，測試修飾電極的電化學(xué)性能。以含20 nmol/L的魯米諾，pH為8.5的磷酸緩沖液(PBS)(2 mL磷酸緩沖溶液、20 μL過氧化氫溶液、20 μL魯米諾)為電解液，對CTpPa-2/GCE進(jìn)行差分脈沖法掃描。

在電化學(xué)發(fā)光檢測過程中，以CTpPa-2/GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為對電極，并以上述PBS溶液為電解液。設(shè)置循環(huán)伏安參數(shù)為：初始電位0 V，高電位0.8 V，低電位0 V，掃速100 mV/s，光電倍增管為800 V。體系置于暗箱中進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，同時(shí)記錄其循環(huán)伏安特性和電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。于魯米諾的反應(yīng)電位處觀察峰形，測試魯米諾的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)程度。

1.2.3 樣品處理烤肉樣品購自當(dāng)?shù)責(zé)緮?，均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取30 g，于90 mL乙腈-水(9∶1，體積比)混合溶液中依次超聲、100 ℃水浴提取1 h，待冷卻浸泡1夜后，離心過濾，收集上清液，經(jīng)濾膜過濾后備用。樣品溶液經(jīng)0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH 8.5后代替上述電解液中的磷酸緩沖溶液進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測定。

1.2.4 高效液相色譜法測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27-2016[28]，采用高效液相色譜法對實(shí)際樣品中的BaP進(jìn)行檢測。色譜條件為：C18色譜柱，流動(dòng)相為88%的乙腈水溶液，流速1.0 mL/min，激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 BaP電化學(xué)發(fā)光傳感器構(gòu)建

BaP電化學(xué)發(fā)光傳感器的構(gòu)建如圖1所示，通過簡單的滴涂方式將共價(jià)有機(jī)骨架材料CTpPa-2修飾至潔凈電極表面，然后在魯米諾-過氧化氫為電解液的三電極體系中分別考察裸GCE及CTpPa-2/GCE對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的響應(yīng)情況。由差分脈沖曲線(圖2A)可以看出，裸GCE在約0.5 V電位處的氧化峰電流為1.18 μA，而CTpPa-2/GCE的電流值為1.57 μA，說明CTpPa-2材料的引入能夠增強(qiáng)電極上魯米諾的氧化還原反應(yīng)，起到放大電流信號(hào)的作用。電化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)也表明，同樣在0.5 V電位處，裸GCE的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度約為1 900 a.u，而CTpPa-2/GCE約為7 780 a.u(見圖2B)，表明經(jīng)CTpPa-2修飾后電極上魯米諾的發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)近4倍。這可能是由于CTpPa-2的存在不僅增大了電極的比表面積，使魯米諾與電極的接觸面積變大，且CTpPa-2本身所富含的共軛體系與魯米諾的苯環(huán)結(jié)構(gòu)間產(chǎn)生了π-π相互作用，使魯米諾在CTpPa-2/GCE上發(fā)生了聚集，雙重作用下，導(dǎo)致魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)得到極大增強(qiáng)。

圖1 CTpPa-2/GCE的制備過程及檢測示意圖Fig.1 Schematic diagram for preparation process and detection of CTpPa-2/GCE

圖2 GCE、CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中的差分脈沖曲線(A)和ECL響應(yīng)曲線(B)Fig.2 Differential pulse curves(A) and ECL responses(B) of bare GCE and CTpPa-2/GCE in luminol systema:bare GCE ;b:CTpPa-2/GCE

圖3 600 nmol/L BaP對CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中ECL強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of 600 nmol/L BaP on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system

從圖3可以看到，當(dāng)向反應(yīng)體系中加入BaP后，CTpPa-2/GCE電極上的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度大幅度減弱，這可能是由于BaP相較于魯米諾含有更多的苯環(huán)，更易與電極表面的CTpPa-2材料結(jié)合，與魯米諾間產(chǎn)生了競爭作用，導(dǎo)致魯米諾的吸附量減少，從而造成電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的降低。本文根據(jù)BaP的加入量與信號(hào)減弱程度的關(guān)系，構(gòu)建了BaP的電化學(xué)發(fā)光傳感器。

2.2 CTpPa-2/GCE的表征

圖4為CTpPa-2/GCE在緩沖溶液中的恒流充放電曲線(A)及循環(huán)伏安曲線(B)，由圖4A可看到，CTpPa-2能夠較快進(jìn)行完全的充放電，而由圖4B可觀察到，在-0.1 V左右有1個(gè)還原峰，但并無氧化峰出現(xiàn)，表明反應(yīng)過程不可逆。上述電化學(xué)測試均表明該材料具有良好的電化學(xué)性能。

采用掃描電子顯微鏡(SEM)和循環(huán)伏安法對CTpPa-2/GCE進(jìn)行表征(圖5)。由SEM圖可以看出，裸GCE的表面光滑平整(圖5A-a)，而經(jīng)CTpPa-2材料修飾后，電極表面變得粗糙，且呈現(xiàn)褶皺的形態(tài)，從而提供了較大的比表面積(圖5A-b)，表明CTpPa-2已成功修飾至電極表面。

圖4 CTpPa-2/GCE在0.32 A/g電流密度下的恒流充放電曲線(A)，以及GCE與CTpPa-2/GCE的循環(huán)伏安曲線(B)Fig.4 Galvanostatic charge/discharge curve of CTpPa-2/GCE at a current density of 0.32 A/g (A),and CV curves of bare GCE and CTpPa-2/GCE (B)a:bare GCE;b:CTpPa-2/GCE

分別將裸GCE及CTpPa-2/GCE浸入1 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，掃描其循環(huán)伏安圖(圖5B)?？捎^察到，相較于裸GCE，CTpPa-2/GCE的氧化、還原峰電流值分別由-13.17 μA和12.95 μA上升至-14.58 μA和15.52 μA，表明經(jīng)過CTpPa-2修飾后電極的電化學(xué)性能較裸GCE更佳。

圖5 裸GCE 及CTpPa-2/GCE表面的SEM圖(A)，以及GCE和CTpPa-2/GCE在1 mmol/L鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安曲線(B)Fig.5 SEM images(A) and CV curves in 1 mmol/L potassium ferricyanide solution(B) of bare GCE and CTpPa-2/GCEa:bare GCE;b:CTpPa-2/GCE

圖6 pH值對CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中 ECL強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of pH value on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system

2.3 電化學(xué)發(fā)光檢測條件的優(yōu)化

為使CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中獲得更強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，以實(shí)現(xiàn)對BaP更靈敏的檢測，本實(shí)驗(yàn)分別對電解液pH值及掃描速率進(jìn)行了優(yōu)化。

圖7 不同濃度BaP對CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中ECL強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of different BaP concentrations on ECL intensity of CTpPa-2/GCE in luminol system BaP concentration (a-g):0,50,200,300,400,500,600 nmol/L;insert:linear relationship between ECL intensity and BaP concentration

2.3.1 pH值對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響大量研究表明，魯米諾在中性和堿性體系中才具有良好的電化學(xué)發(fā)光性能。因此本實(shí)驗(yàn)在pH依次為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的電解液中考察了CTpPa-2/GCE在魯米諾體系中的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。由圖6可以看出，在pH 7.0～8.5范圍內(nèi)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。此后，隨著pH值的進(jìn)一步增大，發(fā)光強(qiáng)度呈下降趨勢。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇魯米諾體系的最佳pH值為8.5。

2.3.2 掃描速率對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響電化學(xué)發(fā)光的發(fā)光效率與激發(fā)態(tài)物質(zhì)的產(chǎn)生和湮沒比率有關(guān)，而激發(fā)態(tài)物質(zhì)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的效果與掃描速率的快慢有關(guān)，過慢或過快的掃描速率均會(huì)導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度的降低。因此本實(shí)驗(yàn)在掃描速率為0.05～0.12 V/s范圍內(nèi)對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，隨著掃描速率的不斷增加，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增大并在0.10 V/s處達(dá)到最大值，隨著掃描速率的繼續(xù)增加，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸減弱。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇0.10 V/s作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的掃描速率。

2.4 BaP的電化學(xué)發(fā)光檢測

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，向含魯米諾的PBS溶液中加入不同濃度的BaP，依次測定其電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(圖7)。結(jié)果顯示，隨著BaP濃度的增加，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸降低，且發(fā)光強(qiáng)度與加入的BaP濃度在50～600 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r2= 0.995 1)，檢出限(S/N=3)為5.60 nmol/L。

2.5 電化學(xué)發(fā)光傳感器的穩(wěn)定性與抗干擾性

發(fā)光體系和修飾電極的穩(wěn)定性有助于構(gòu)建性能優(yōu)異的電化學(xué)發(fā)光傳感器，因此本實(shí)驗(yàn)考察了該電化學(xué)發(fā)光傳感器的穩(wěn)定性。將所制備的CTpPa-2/GCE在含魯米諾的PBS溶液中連續(xù)掃描10圈后，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值為初始響應(yīng)值的99.7%。將修飾后的電極于室溫干燥環(huán)境中放置7 d后，考察電極放置前后對BaP響應(yīng)值的變化。結(jié)果顯示，放置后的響應(yīng)值為初始響應(yīng)值的91.5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本文制備的CTpPa-2/GCE具有很好的穩(wěn)定性。

要實(shí)現(xiàn)食品中BaP的檢測，需排除能與BaP共存且性質(zhì)相似物質(zhì)(如脂溶性抗氧化劑)的干擾，為此，進(jìn)一步考察了電極的抗干擾性。食品中常見的該類似物質(zhì)有沒食子酸丙酯(PG)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、維生素E等。本實(shí)驗(yàn)分別將0.1 mol/L的PG、TBHQ及維生素E與BaP一同放入電解液中進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BaP的相對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值分別變化了2.4%、3.9%和5.0%。說明上述抗氧化劑未對BaP的電化學(xué)發(fā)光檢測產(chǎn)生明顯干擾，本文制備的電化學(xué)發(fā)光傳感器具有較好的抗干擾性。

2.6 烤肉樣品中BaP的測定

將烤肉樣品按照“1.2.3”進(jìn)行處理后，分別用本文提出的電化學(xué)發(fā)光傳感方法和高效液相色譜法對實(shí)際樣品中的BaP進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果如表1所示。對比結(jié)果顯示，本方法測定實(shí)際樣品中BaP含量的結(jié)果與HPLC法的測定結(jié)果相近，表明本方法對實(shí)際樣品中BaP的檢測具有較好準(zhǔn)確性、有效性和可行性。

表1 烤肉中BaP的ECL和HPLC測定結(jié)果(n=6)Table 1 Detection results of BaP in roast meat with ECL and HPLC methods(n=6)

3 結(jié) 論

本文通過將共價(jià)有機(jī)骨架材料CTpPa-2修飾至電極表面，并與魯米諾-過氧化氫體系相結(jié)合，構(gòu)建了一種BaP的電化學(xué)發(fā)光傳感器并成功運(yùn)用于實(shí)際樣品中BaP的檢測。該方法操作簡單快速、成本低廉，且具有較好的穩(wěn)定性與抗干擾能力，以及良好的應(yīng)用前景。