閆 君，陳 婷，張 文，張 婕，苗 茜

(蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730050)

陳皮為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮[1]，藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其氣香，味辛、苦，性溫，主要含揮發(fā)油、黃酮類、生物堿、肌醇等成分[2]，具有理氣健脾，燥濕化痰之功效。陳皮是國際國內(nèi)市場需求量大的常用藥材，若其原料柑橘在種植過程中盲目施用大量農(nóng)藥會導(dǎo)致農(nóng)殘超標(biāo)[3]，且多集中于果實表皮，嚴(yán)重影響陳皮的質(zhì)量安全及開發(fā)應(yīng)用。因此，建立陳皮中農(nóng)藥殘留快速檢測方法對促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)代化、國際化進(jìn)程具有重要意義。

目前，農(nóng)殘檢測技術(shù)主要有氣相色譜法[4]、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]和液相色譜-質(zhì)譜法[7]等，其中氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法因具有靈敏度高、選擇性好，已成為主要分析方法。陳皮中農(nóng)殘的前處理方法主要為固相萃取法[8]，但其試劑消耗大，操作步驟繁瑣，費時費力；QuEChERS方法通過液-液微萃取，可快速、簡便、低成本的去除干擾物質(zhì)[9]，廣泛用于水果、蔬菜等中的農(nóng)殘檢測[10-11]，其前處理輔助材料陶瓷均質(zhì)子因可節(jié)約萃取時間、防止鹽類結(jié)塊、提高萃取效率等優(yōu)點已被應(yīng)用于《GB 23200.133-2018》[12]，鮮有報道將其用于中藥材中農(nóng)殘檢測?；诖耍疚慕Y(jié)合日常柑橘類水果檢測結(jié)果、文獻(xiàn)報道[13]及藥典規(guī)定的農(nóng)藥種類，建立了陳皮中88種農(nóng)藥的QuEChERS/氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，方法操作簡單、耗時短、靈敏度高、選擇性和重現(xiàn)性好，可滿足陳皮中農(nóng)藥殘留的分析要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B-7000D氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；移液槍、Centrifuge 5810R高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；ME204/02萬分之一電子天平、MS205DU十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)；EVA50A氮吹儀(中國北京普立泰科儀器有限公司)；KS501搖床(德國IKA公司)；VORTEX-5渦旋混勻器(中國其林貝爾儀器制造有限公司)；0.22 μm有機(jī)濾膜(中國天津博納艾杰爾科技有限公司)；西貝樂料理機(jī)(中國上海帥佳電子科技有限公司)，SiO-6512 QuEChERS全自動樣品制備系統(tǒng)(配渦流振動離心機(jī)，12位均質(zhì)離心轉(zhuǎn)子，均質(zhì)分離工作站，北京Ability公司)，2 cm(長)×1 cm(外徑)兩側(cè)為斜切面的陶瓷均質(zhì)子(美國Agilent公司)。

88種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%，德國Dr Ehrenstorfer公司)；乙腈、正己烷(色譜純，德國Merck公司)；丙酮(色譜純，天津科密歐公司)；無水硫酸鎂、氯化鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉鹽(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、石墨化炭黑(GCB)(中國天津博納艾杰爾科技有限公司)；實驗用水為Milli-Q超純水(德國默克化工(技術(shù))上海有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制精密稱取10 mg(精確至0.01 mg)各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別于10 mL容量瓶中，根據(jù)需要分別選擇丙酮或正己烷稀釋并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL左右的農(nóng)藥單標(biāo)儲備液，于-18 ℃避光保存，待用。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制分別準(zhǔn)確移取一定體積的農(nóng)藥單標(biāo)儲備液于25 mL容量瓶中，加入正己烷稀釋并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為8 mg/L左右的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃避光保存，用于質(zhì)譜離子對確認(rèn)和出峰時間的確定。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品制備陳皮購自蘭州市藥材市場，粉碎研成末后過3號篩，混勻，按四分法留樣200 g，避光保存，備用。

1.3.2 陳皮樣品前處理提取：取2 g(精確至0.01 g)陳皮樣品于50 mL離心管中，加入一顆陶瓷均質(zhì)子，再加入10.0 mL 1%冰醋酸溶液渦旋30 s后，靜置30 min，待樣品充分浸潤后加入10.0 mL乙腈，振蕩10 min，加入5.0 g QuEChERS 鹽包(含4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g無水乙酸鈉)，渦旋混合均勻1 min，在室溫下靜置5 min后以3 900 r/min離心5 min，取上清液，待凈化。

凈化：取5.0 mL上清液轉(zhuǎn)入QuEChERS凈化管(含200 mg PSA、100 mg C18和30 mg GCB)中，混勻，渦旋1 min，以3 900 r/min離心5 min，取2.00 mL上清液于7 mL離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至近干，加入2.00 mL正己烷，渦旋溶解，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待氣相色譜-質(zhì)譜測定。

1.4 分析條件

氣相色譜條件：HP-5MS UI氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至170 ℃，再以10 ℃/min升至310 ℃，保持3 min；載氣為氦氣，流速1.2 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；動態(tài)多反應(yīng)掃描模式(dMRM)；溶劑延遲3.5 min；Agilent MassHunter工作軟件，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 88種農(nóng)藥的CAS號、保留時間、離子對及碰撞電壓Table 1 Retention time and mass spectrometry parameters of 88 pesticides

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dMRM)方法的建立

取88種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在m/z50～500范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，使用NIST標(biāo)準(zhǔn)庫匹配檢索，確證目標(biāo)物的保留時間和特征離子碎片，優(yōu)化碰撞能量。結(jié)果顯示，與多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)相比，dMRM是對每個組分的保留時間窗口進(jìn)行動態(tài)分配，檢測多種化合物也無需分時間段，可簡化分析流程、改善峰形、提高分析效率和靈敏度，適合一針分析多種化合物。88種農(nóng)藥的定量離子、定性離子及碰撞能量結(jié)果見表1，在動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描下的總離子流圖見圖1。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取條件優(yōu)化利用藥典四部通則2341氣相色譜-質(zhì)譜方法進(jìn)行提取后，發(fā)現(xiàn)有部分無水硫酸鎂和無水乙酸鈉遇水結(jié)塊，為避免無水硫酸鎂結(jié)塊影響除水效果和消除因結(jié)塊包裹目標(biāo)物造成回收率下降，需在提取環(huán)節(jié)中加入陶瓷均質(zhì)子。陶瓷均質(zhì)子2 cm(長)×1 cm(外徑)兩側(cè)為斜切面的圓柱體陶瓷，可在振蕩過程中通過剪切力將樣品和結(jié)塊的無水硫酸鎂進(jìn)一步切碎混勻，增大陳皮與提取液比表面積，還可使陳皮中的內(nèi)吸性農(nóng)藥進(jìn)一步被釋放提取，從而提高農(nóng)藥的回收率。在提取環(huán)節(jié)比較了加入一顆和加入兩顆陶瓷均質(zhì)子的回收率，發(fā)現(xiàn)加入兩顆陶瓷均質(zhì)子與一顆陶瓷均質(zhì)子的回收率基本一致，表明加入一顆陶瓷均質(zhì)子即可滿足提取需要。為確保提取過程有充足振蕩空間，在藥典提取方法的基礎(chǔ)上按比例縮減提取試劑，最終提取方法為：稱取2 g樣品，加入一顆陶瓷均質(zhì)子和10.0 mL 1%冰醋酸溶液，再加入10.0 mL乙腈提取。

圖1 陳皮中88種農(nóng)藥在動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描下的總離子流圖(0.1 mg/kg)Fig.1 Total ion chromatograms of 88 pesticides(0.1 mg/kg) using dMRM mode in Pericarpium citri reticulatae

2.2.2 凈化條件優(yōu)化QuEChERS凈化管通過分散吸附劑吸附樣品中的雜質(zhì)進(jìn)而達(dá)到凈化的目的,常用于基質(zhì)復(fù)雜樣品[14]，常用的吸附劑有C18、石墨化炭黑(GCB)和PSA。其中C18可去除脂類等疏水性雜質(zhì)；GCB用于去除色素類物質(zhì)；PSA作為一種弱陰離子交換劑用于去除脂肪酸等物質(zhì)[15]。本研究參考2015版藥典四部通則2341方法第四法[16]并結(jié)合陳皮中的主要成分，在空白陳皮樣品添加0.1 mg/kg混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，并設(shè)計PSA(100、200、300 mg)、C18(100、200、300 mg)和GCB(15、30、45 mg)用量的3因素3水平正交試驗，以待測物的平均回收率驗證其凈化效果。結(jié)果顯示，3個因素的主次關(guān)系為GCB>C18>PSA，且根據(jù)88種農(nóng)藥的平均回收率及回收率在80%～120%的農(nóng)藥數(shù)量，確定最佳PSA、C18和GCB的用量分別為200、100、30 mg。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是由基質(zhì)引起的檢測信號增強(qiáng)或減弱，在氣相色譜分析中普遍存在，且多表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，對定量準(zhǔn)確性和重復(fù)性具有一定影響[17-18]。由于陳皮基質(zhì)成分復(fù)雜，因此需對其基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價，本研究采用提取后加入法和絕對基質(zhì)效應(yīng)法評價基質(zhì)效應(yīng)[19-20]：ME(%)=100%×(A-B)/B，式中A為農(nóng)藥在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)值，B為農(nóng)藥在純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值，當(dāng)ME%低于-20%為基質(zhì)抑制效應(yīng)，在-20%～20%之間時為弱基質(zhì)效應(yīng)；大于20%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果顯示：88種農(nóng)藥的ME(%)均為正值，且其中11種(鄰苯基苯酚、二苯胺、氟樂靈、甲基毒死蜱、環(huán)氧七氯、六氯苯、甲霜靈、艾氏劑、腐霉利、氯丹、狄氏劑)農(nóng)藥表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，其余77種農(nóng)藥為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)(ME(%)為21.5%～145%)。因此實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，以減弱基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)化合物定量結(jié)果的影響。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍取空白陳皮樣品，按“1.3.2”方法處理后，添加88種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配成質(zhì)量濃度為9.0～220 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化條件下測定，以各農(nóng)藥的定量離子峰峰面積響應(yīng)值(y)對其質(zhì)量濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，88種農(nóng)藥在各自的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均不低于0.996 3。

2.4.2 檢出限與定量下限取陰性陳皮空白樣品，按“1.3.2“方法制得空白基質(zhì)溶液，向其中添加一定量農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成質(zhì)量濃度為9.0～220 ng/mL的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化條件下測定，分別以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結(jié)果表明：88種農(nóng)藥的LOD為0.001 0～0.050 0 mg/kg，LOQ為0.002 0～0.100 0 mg/kg(表2)。

2.4.3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差準(zhǔn)確稱取2.0 g空白陳皮樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，添加水平為0.045～0.55 mg/kg，每個濃度平行6個。結(jié)果顯示，88種農(nóng)藥的平均回收率為60.1%～118%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.30%～13%(表2)。表明方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度。

表2 88種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)、檢出限及定量下限Table 2 Linear ranges,correlation coefficient(r2),recoveries,RSDs(n=6),LODs and LOQs of 88 pesticides

(續(xù)表2)

圖2 檢出14種農(nóng)藥的陳皮樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of Pericarpium citri reticulatae samples with 14 pesticides detected the number 1-25 were the same as those in Table 3

2.5 實際樣品檢測

采用本方法在優(yōu)化條件下對市售陳皮進(jìn)行檢測(表3)，結(jié)果顯示，26批次陳皮中農(nóng)藥檢出率為100%，88種農(nóng)藥中共檢出25種，最少的樣品檢出2種農(nóng)藥，最多的檢出14種(圖2)，其中殺撲磷的檢出率最高，咪鮮胺的殘留量最高。雖然陳皮中農(nóng)藥檢出率高，但其整體殘留量較低，這可能與其制作過程需長時間晾曬有關(guān)。

表3 陳皮中農(nóng)藥的檢出結(jié)果Table 3 Detected results of pesticide residues in Pericarpium citri reticulatae

(續(xù)表3)

3 結(jié) 論

優(yōu)化了QuEChERS前處理方法，利用GC-MS/MS動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dMRM)模式檢測技術(shù)，建立了陳皮中88種農(nóng)藥的檢測方法。方法在提取環(huán)節(jié)加入陶瓷均質(zhì)子可以最大限度地減少人員之間的誤差，提高了結(jié)果的一致性及重現(xiàn)性，并提高了農(nóng)藥殘留回收率，同時也為藥典農(nóng)殘檢驗方法的完善提供了參考依據(jù)。通過樣品實測證明本方法操作簡單、檢測分析時間短、靈敏度高，可用于陳皮中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查，具有實際應(yīng)用價值。