林曉琳，張凌云

1濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；2煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院萊山分院內(nèi)科，煙臺(tái)264003；3濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，煙臺(tái) 264100

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是指動(dòng)脈內(nèi)膜有脂質(zhì)等血液成分的沉積、平滑肌細(xì)胞增生和膠原纖維增多，形成粥糜樣含脂壞死病灶和血管壁硬化[1]。隨著AS的發(fā)展，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚變硬、血管腔狹窄，一旦發(fā)展到足以阻塞動(dòng)脈腔，則該動(dòng)脈所供應(yīng)的組織或器官將缺血或壞死[2]。近年來，AS的發(fā)病率逐漸升高，并且也是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因，這嚴(yán)重威脅著人們的生活健康[3,4]。雖然AS的發(fā)病率如此之高，但是臨床上還沒有一種專門治療AS的藥物，目前臨床上主要采用一些降脂藥(如他汀類藥物)治療AS，但這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能有效解決AS問題。因此，尋找一種安全、低毒、有效的治療AS藥物是迫切需要的。

引起AS的原因有很多，如高脂血癥和高膽固醇血癥[5]。近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)，剪切力在AS的發(fā)生中起著重要的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)低剪切力是誘導(dǎo)AS發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一[7]。低剪切力會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧(ROS)的活性，并降低一氧化氮(NO)的活性，造成內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和氧化應(yīng)激，促進(jìn)AS的發(fā)生[8]。因此，尋找一種可以改善低剪切力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂或降脂的藥物來治療AS可能是一條有效的策略。

迷迭香酸是一種天然的多酚類化合物，具有很好的抗炎和抗氧化作用[9,10]。很多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸對(duì)心血管有很好的保護(hù)作用，如心肌保護(hù)作用[11]，但是有關(guān)治療AS的作用尚未報(bào)道。因此，本研究主要研究迷迭香酸的治療AS模型作用。

1 材料

1.1 試劑

斑馬魚幼魚基礎(chǔ)飼料購自上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購自成都曼思特生物科技有限公司。橙色熒光標(biāo)記膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品、RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶和蛋白提取試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

Z-C-D6型集中式斑馬魚養(yǎng)殖單元購自上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。SZX7型奧林巴斯體視鏡購自奧林巴斯公司。HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；LEGEND Micro 21R型離心機(jī)(Thermo scientific，美國)；BS210S電子天平(Sartorius)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERA Cell 150)；熒光倒置顯微鏡(Olympus)；超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；iCycler iQ5(Bio-Rad，美國)，核酸定量?jī)x(Amerscham biosciences，美國)，逆轉(zhuǎn)錄儀器(Veriti 96，美國ABI)。

1.3 動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚、轉(zhuǎn)基因型(flil:EGFP)斑馬魚和轉(zhuǎn)基因型(mpx:EGFP)斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.hy926)均來源于ATCC公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取生長狀態(tài)良好的EA.hy 926細(xì)胞，使用含10%胎牛血清、鏈霉素(100 μg/L)、慶大霉素(100 μg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液(pH=7.5)，在37 ℃ 5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂模型建立

采用平行板流動(dòng)腔建立EA.hy926細(xì)胞功能紊亂模型，造模方法與文獻(xiàn)一致[8]，大體操作如下：將EA.hy926細(xì)胞爬片貼壁后置于可體外模擬LSS的平行板流動(dòng)腔中，施加剪切力2 dyn/cm2于貼壁的細(xì)胞，作用30 min即可。

2.1.3 DHE法檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞中ROS活性

取對(duì)數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞爬片，并使用不同濃度(0、0.1、1和10 mg/L)的迷迭香酸處理24 h后，進(jìn)行平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)。平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用DHE法檢測(cè)各組EA.hy926細(xì)胞中ROS活性。平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出玻片，去除培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入DHE于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。用PBS洗三次，收集細(xì)胞，在激發(fā)波長535 nm，發(fā)射波長610 nm處，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.1.4 DAF-FM DA法檢測(cè)細(xì)胞中NO活性

取對(duì)數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞爬片，并使用不同濃度(0、0.1、1和10 mg/L)的迷迭香酸處理24 h后，進(jìn)行平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)。平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用DAF-FM DA法檢測(cè)各組EA.hy926細(xì)胞中NO活性。平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出玻片，去除培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入DAF-FM DA于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。用PBS洗三次，收集細(xì)胞，在激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長515 nm處，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.1.5 檢測(cè)細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞爬片，并使用不同濃度(0、0.1、1和10 mg/L)的迷迭香酸處理24 h后，進(jìn)行平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)。平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，提取各組細(xì)胞中的總RNA，并使用q-PCR法檢測(cè)各組EA.hy926細(xì)胞中ICAM-1、VCAM-1和GAPDH。引物由Primer3 software設(shè)計(jì)與合成，引物的序列等信息將表1。細(xì)胞總RNA的提?。浩叫邪辶鲃?dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出玻片放置于培養(yǎng)皿中，后按照RNA提取說明書的方法采用Trizol溶液提取細(xì)胞總RNA。

RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按照說明書配制RT反應(yīng)液(5 × PrimeScript RT Buffer 2 μL，總RNA，RNase Free dH2O補(bǔ)足至10 μL)，置于逆轉(zhuǎn)錄儀中反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

熒光定量PCR檢測(cè)：以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中ICAM-1、VCAM-1和GAPDH的基因表達(dá)。25 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，以上兩步擴(kuò)增循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線。

表1 引物序列

2.1.6 檢測(cè)細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)

平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總蛋白試劑盒。將蛋白樣品加入5×上樣緩沖液后煮沸變性，每孔加入20 μg蛋白，70 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑至分離膠濃縮膠分界處，轉(zhuǎn)為90 V恒壓電泳至指示劑接近凝膠的底部。將電泳完畢的凝膠按照從正極到負(fù)極依次為海綿墊-濾紙-膜-凝膠-濾紙-海綿墊的順序夾好，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，冰浴，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h。使用脫脂牛奶(5%)封閉2 h后，加入一抗，在25 ℃下孵育1 h，緩慢搖動(dòng)。使用TBST洗3次，加入合適稀釋度的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后，TBST洗3次。采用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色，UVP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像信息，Image J軟件分析條帶光密度值，目的蛋白與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參比較后，再于正常組比較得出相對(duì)表達(dá)量。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 斑馬魚AS模型建立及血管中斑塊檢測(cè)

本研究采用高脂飼料喂食斑馬魚建立斑馬魚AS模型[12]，即對(duì)受精后5天(dpf)的斑馬魚幼魚喂食含4%膽固醇的高脂飼料10天。為了能夠觀察到血管中斑塊形成情況，本研究采用轉(zhuǎn)基因型(flil:EGFP)斑馬魚(血管帶有綠色熒光標(biāo)記)建造AS模型，并在高脂飼料中添加一些橙色熒光標(biāo)記的膽固醇(比例為10 μg/g)。將5 dpf的flil:EGFP斑馬魚幼魚分成5組：正常組、AS模型組、0.1 mg/L迷迭香酸治療組、1 mg/L迷迭香酸治療組和10 mg/L迷迭香酸治療組。在正常組中，向幼魚喂食正?；A(chǔ)飼料13天即可。在AS模型組中，先喂食3天正?；A(chǔ)飼料，在喂食10天含4%膽固醇的高脂飼料(帶有橙色熒光標(biāo)記的)10天。在3個(gè)不同劑量的迷迭香酸治療組中，先喂食3天正?；A(chǔ)飼料，在喂食10天含4%膽固醇的高脂飼料(帶有橙色熒光標(biāo)記的)10天，并在喂食高脂飼料的同時(shí)給予不用劑量(0.1、1和10 mg/L)的迷迭香酸治療。喂食高脂飼料10天后，禁食24 h，在熒光顯微鏡下可以清楚看到綠色熒光血管中有大量橙色熒光標(biāo)記的脂質(zhì)蓄積。已經(jīng)有研究證明了[13]，這些血管中蓄積的脂質(zhì)與人AS的早期斑塊成分是相似的。故可通過此模型來觀察AS斑塊的形成情況。

2.2.2 檢測(cè)斑馬魚的炎癥反應(yīng)

采用轉(zhuǎn)基因型(mpx:EGFP)斑馬魚(中性粒細(xì)胞帶有綠色熒光標(biāo)記)建造AS模型。斑馬魚的分組與處理與方法“2.6”中的一致，但是所喂食的高脂飼料不含有橙色熒光標(biāo)記的膽固醇。喂食高脂飼料10天后，禁食24 h，在熒光顯微鏡下，可通過觀察斑馬魚血管中綠色顆粒狀的中性粒細(xì)胞數(shù)量來反應(yīng)炎癥程度。

2.2.3 檢測(cè)斑馬魚的氧化應(yīng)激

采用野生型AB品系斑馬魚建造AS模型。斑馬魚的分組與處理與方法“2.6”中的一致，但是所喂食的高脂飼料不含有橙色熒光標(biāo)記的膽固醇。喂食高脂飼料10天后，禁食24 h后，使用DCFH-DA活性氧ROS熒光探針，觀察各組斑馬魚ROS活性。

2.2.4 檢測(cè)迷迭香酸的降脂作用

采用野生型AB品系斑馬魚建造AS模型。斑馬魚的分組與處理與方法“2.6”中的一致，但是所喂食的高脂飼料不含有橙色熒光標(biāo)記的膽固醇。喂食高脂飼料10天后，禁食24 h后，使用尼羅紅染色，觀察迷迭香酸對(duì)AS斑馬魚血脂水平的影響。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 迷迭香酸改善低剪切力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂

結(jié)果如圖1所示，低剪切力顯著升高EA.hy926細(xì)胞中ROS活性，并降低NO的活性。1和10 mg/L迷迭香酸能有效改善低剪切力誘導(dǎo)的ROS活性升高和NO活性降低。0.1 mg/L迷迭香酸對(duì)低剪切力誘導(dǎo)的ROS活性升高和NO活性降低并沒有顯著影響。

圖1 迷迭香酸降低ROS活性，并升高NO活性(n=3)

3.2 迷迭香酸改善低剪切力誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

通過q-PCR和Western blotting檢測(cè)一些血管黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)的基因和蛋白表達(dá)來反應(yīng)EA.hy926細(xì)胞的炎癥情況。q-PCR檢測(cè)結(jié)果如表2所示，低剪切力顯著升高EA.hy926細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)。1和10 mg/L迷迭香酸能顯著降低低剪切力誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)升高。0.1 mg/L迷迭香酸對(duì)ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)并沒有顯著影響。western blotting檢測(cè)如圖2所示，低剪切力顯著增加ICAM-1的蛋白表達(dá)，1和10 mg/L迷迭香酸能顯著降低低剪切力誘導(dǎo)的ICAM-1的蛋白表達(dá)升高，但是0.1 mg/L迷迭香酸對(duì)ICAM-1的蛋白表達(dá)沒有顯著影響。低剪切力顯著增加VCAM-1的蛋白表達(dá)，10 mg/L迷迭香酸能顯著降低低剪切力誘導(dǎo)的VCAM-1的蛋白表達(dá)升高，但是0.1和1 mg/L迷迭香酸對(duì)VCAM-1的蛋白表達(dá)沒有顯著影響。

表2 迷迭香酸降低低剪切力誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)升高(n=3)

注：與0 min LSS+ 0 mg/L RosA組比較，##P<0.01；與30 min LSS + 0 mg/LRosA組比較，**P<0.01。

Note:Compared with 0 min LSS + 0 mg/L RosA,##P< 0.01;Compared with 30 min LSS + 0 mg/L RosA,**P< 0.01.

圖2 迷迭香酸降低低剪切力誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)升高(n=3)

3.3 迷迭香酸減輕AS斑馬魚血管中斑塊的形成

通過觀察斑馬魚血管中的脂質(zhì)蓄積來反應(yīng)斑塊的形成情況。結(jié)果如圖3所示，正常組斑馬魚血管中并未出現(xiàn)斑塊。與正常組比較，AS模型組中出現(xiàn)大量的橙色脂質(zhì)斑塊。與AS模型組比較，1和10 mg/L迷迭香酸治療均能有效減輕血管中的斑塊形成。0.1 mg/L迷迭香酸治療并不能有效減輕斑塊的形成。

圖3 迷迭香酸減輕AS斑馬魚血管中斑塊的形成(n=6)

3.4 迷迭香酸改善AS斑馬魚的炎癥反應(yīng)

通過觀察斑馬魚的中性粒細(xì)胞來反應(yīng)炎癥情況。結(jié)果如圖4所示，與正常組比較，AS模型組斑馬魚出現(xiàn)大量的中性粒細(xì)胞。與AS模型組比較，1和10 mg/L迷迭香酸治療均能有效降低中性粒細(xì)胞數(shù)目。0.1 mg/L迷迭香酸對(duì)AS斑馬魚的中性粒細(xì)胞數(shù)量并沒有顯著影響。

3.5 迷迭香酸改善AS斑馬魚的氧化應(yīng)激

通過檢測(cè)斑馬魚ROS水平來反應(yīng)斑馬魚的氧化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果如圖5所示，與正常組比較，AS模型組斑馬魚的ROS水平顯著升高。與AS模型組比較，1和10 mg/L迷迭香酸治療均能有效降低ROS水平。0.1 mg/L迷迭香酸對(duì)AS斑馬魚的氧化應(yīng)激并沒有顯著影響。

圖4 迷迭香酸降低AS斑馬魚的中性粒細(xì)胞數(shù)量(n=6)

圖5 迷迭香酸降低AS斑馬魚的ROS水平(n=6)

3.6 迷迭香酸降低AS斑馬魚的血脂水平

通過尼羅紅染色觀察斑馬魚的血脂水平。結(jié)果如圖6所示，與正常組比較，AS模型組斑馬魚的血脂水平顯著升高。與AS模型組比較，1和10 mg/L迷迭香酸治療均能有效降低血脂水平。0.1 mg/L迷迭香酸對(duì)AS斑馬魚的血脂水平并沒有顯著影響。

圖6 迷迭香酸降低AS斑馬魚的血脂水平(n=6)

4 討論與結(jié)論

斑馬魚是一種常見的熱帶魚，由于斑馬魚基因與人類基因的相似度達(dá)到87%，這意味著在其身上做藥物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體，因此它受到生物學(xué)家的重視[14]。斑馬魚已經(jīng)被用于復(fù)制多種人類疾病模型，如腫瘤、非酒精性脂肪肝、心肌缺血再灌注損傷等模型[15-17]。同樣，斑馬魚也被用于建造AS模型，目前研究發(fā)現(xiàn)，通過高脂喂食斑馬魚幼魚，可以促進(jìn)脂質(zhì)在斑馬魚血管中發(fā)生蓄積，并且研究也證明了這些蓄積的脂質(zhì)與人類早期AS斑塊的成分是相似[12,13]。在本研究中，我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)高脂喂食可以誘導(dǎo)大量的脂質(zhì)蓄積在斑馬魚的血管中。這也進(jìn)一步說明了通過高脂喂食建立斑馬魚AS模型是可行的。并且迷迭香酸可以顯著改善高脂喂食誘導(dǎo)的血管中脂質(zhì)蓄積。這些結(jié)果說明，迷迭香酸可能具有治療AS作用。

研究發(fā)現(xiàn)，斑塊好發(fā)于血管彎曲內(nèi)側(cè)或血管分叉外側(cè)，這說明流體力學(xué)在AS的發(fā)生中也起著重要的作用[18]。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)剪切力在AS的發(fā)生中起著重要的作用[19]。剪切力是指血流與血管內(nèi)皮間的摩擦所用于血管壁單位面積的力，主要分為高剪切力、低剪切力和湍流剪切力。研究發(fā)現(xiàn)，低剪切力會(huì)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，促進(jìn)AS的發(fā)生。最近也有研究通過對(duì)斑馬魚進(jìn)行剪切力檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)斑馬魚尾部靜脈處為低剪切力(見圖7)，證明了斑馬魚也可以用于研究低剪切力誘導(dǎo)AS[20]。在本研究中，我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)蓄積主要發(fā)生在斑馬魚的尾部靜脈中，并且有研究已經(jīng)證實(shí)了這些蓄積在血管中的脂質(zhì)與人AS斑塊發(fā)生位置是相似的[13]。這一結(jié)果也進(jìn)一步說明斑馬魚AS模型是可以用于研究低剪切力誘導(dǎo)的AS。為了能進(jìn)一步研究迷迭香酸抗AS作用與低剪切力之間的關(guān)系，我們采用平行板流動(dòng)腔體外模擬低剪切力誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂模型。結(jié)果表明，迷迭香酸可以有效改善低剪切力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，主要表現(xiàn)為降低低剪切力誘導(dǎo)的ROS升高、NO活性降低和血管黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)mRNA的升高。這些結(jié)果說明，迷迭香酸的抗AS作用可能與其改善低剪切力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂作用有關(guān)。

中性粒細(xì)胞在AS的發(fā)生中起著重要的作用，一些血管黏附分子(ICAMs)的異常表達(dá)會(huì)造成中性粒細(xì)胞募集在血管內(nèi)膜上，造成炎癥的發(fā)生，促進(jìn)AS的發(fā)生[21]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AS斑馬魚低剪切力血管中聚集了大量的中性粒細(xì)胞，并且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了，低剪切力能誘導(dǎo)黏附分子高表達(dá)。這寫、些結(jié)果說明，低剪切力可能通過增加黏附分子的表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向低剪切力血管處募集，誘發(fā)血管炎癥，促進(jìn)AS的發(fā)生。而迷迭香酸的治療可以顯著改善這些低剪切力誘導(dǎo)的不良現(xiàn)象。這些結(jié)果也進(jìn)一步說明，迷迭香酸能改善低剪切力誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

引發(fā)AS的機(jī)制有很多，如高脂血癥、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[22,23]。在本研究中，我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)高脂喂食可以顯著升高斑馬魚的血脂水平，同時(shí)也誘發(fā)了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。迷迭香酸治療可以顯著降低血脂水平，并改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果說明，迷迭香酸的抗AS作用可能與其降血脂、抗氧化和抗炎作用相關(guān)。

圖7 受精后15天的斑馬魚血管造影，紅色方框區(qū)域?yàn)榈图羟辛ρ鲄^(qū)域。

綜上所述，迷迭香酸有很好的抗AS作用，并且其抗AS作用可能與其降血脂、抗氧化、抗炎和改善低剪切力誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂作用相關(guān)。