田云剛,郭洪偉,劉一涵,王建霞,田 蘭,李思迪,魏 華,3*
1吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院;2湘西自治州民族醫(yī)藥研究所;3湖南省土家醫(yī)藥研究中心,吉首 416000
白頭婆Eupatoriumjaponicum是菊科澤蘭屬植物,多年生草本,多生于山坡林下、河岸水旁[1]。我國(guó)東部及西南部各省份均有分布,日本、朝鮮廣布。《中國(guó)民族藥辭典》記載白頭婆是我國(guó)12個(gè)少數(shù)民族使用的常用草藥,具有治療感冒發(fā)熱、風(fēng)濕咳嗽、跌打損傷、產(chǎn)后腰痛、蛇咬傷等多種功效。在湘西土家族地區(qū),白頭婆主要用于治療跌打損傷,具有“強(qiáng)盜藥”之稱;土家藥匠將白頭婆的花泡酒喝,總結(jié)出具有抗疲勞、壯陽(yáng)、治療多種炎癥的功效;在韓國(guó),白頭婆的花用于泡茶[2]?,F(xiàn)代藥理研究表明白頭婆具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等多種活性[3-5]。在本課題組研究基礎(chǔ)之上,為繼續(xù)挖掘白頭婆的化學(xué)成分,本實(shí)驗(yàn)對(duì)白頭婆花70%乙醇提取物進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分分離。
Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振波譜儀(瑞士布魯克);LTQ-Obitrap XL質(zhì)譜儀(賽默飛世爾);LC-20AT型高效液相色譜(日本島津);YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×10 mm,5 μm);R2002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海SENCO);R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI);BZF-50型真空干燥箱(上海博訊);WFH-203B紫外暗箱(上海精科);BSZ-160F電腦自動(dòng)部分收集器(上海精科);柱色譜硅膠、薄層色譜硅膠G254均購(gòu)自青島海洋化工有限公司;Sephadex LH-20凝膠(Pharmacia);HW-40C凝膠(Toyopearl);高效液相用甲醇為色譜純(天津科密歐化工);其他試劑均為分析純,水為怡寶水。
白頭婆花于2017年10月采自湖南省龍山縣石牌鎮(zhèn),經(jīng)湘西自治州民族醫(yī)藥研究所田華詠教授鑒定為白頭婆Eupatoriumjaponicum的花。植物標(biāo)本(編號(hào):JSU20181007)存于吉首大學(xué)湖南省土家醫(yī)藥研究中心。
白頭婆干燥花(3.0 kg)用30 L的70%乙醇80 ℃提取5次,每次2 h,合并濾液,減壓干燥,得浸膏960.0 g。浸膏經(jīng)100~200目硅膠拌樣,依次用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇洗脫,洗脫液濃縮至干。將乙酸乙酯部位浸膏拌樣,經(jīng)正相硅膠柱分離,石油醚-乙酸乙酯(7∶1→1∶2)梯度洗脫,得5個(gè)組分(Fr.1~5)。Fr.2(2.3 g)經(jīng)硅膠柱層析反復(fù)分離(石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)和二氯甲烷-乙酸乙酯系統(tǒng)洗脫)、Sephadex LH-20柱色譜分離得化合物1(316.9 mg)、2(10.0 mg)、3(7.2 mg)。Fr.3(2.4 g)經(jīng)硅膠柱層析分離(石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)和正己烷-丙酮系統(tǒng)洗脫)、Sephadex LH-20柱色譜分離、半制備型HPLC純化得化合物4(11.1 mg)、5(26.7 mg)、8(4.0 mg)。Fr.4(22.6 g)經(jīng)硅膠柱層析,用二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)洗脫,經(jīng)MCI柱色譜(50%、70%、90%、100%乙醇洗脫)分離除去色素,經(jīng)HW-40C凝膠柱色譜分離、制備薄層色譜(二氯甲烷∶甲醇=7∶1)分離得化合物6(1.2 mg)、7(5.5 mg)、9(50.9 mg)、11(1.3 mg)、10(183.0 mg)。Fr.5經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-甲醇 50∶1→20∶1)、HW-40C凝膠柱色譜分離得化合物12(14.1 mg)。將二氯甲烷部位浸膏硅膠拌樣,經(jīng)正相硅膠柱分離,石油醚-乙酸乙酯(20∶1→5∶1)洗脫得到4個(gè)組分(Fr.1~4)。Fr.2(11.2 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離得化合物13(43.0 mg)、14(23.1 mg)、15(2.8 g)。Fr.3經(jīng)硅膠柱反復(fù)分離、凝膠柱純化得化合物16(42.5 mg)、17(18.0 mg)、18(50.0 mg)。石油醚部位浸膏經(jīng)硅膠柱分離,石油醚-二氯甲烷(50∶1→4∶1)洗脫得到5個(gè)組分(Fr.1~5)。Fr.4(1.7 g)通過(guò)硅膠柱分離得到化合物19(8.2 mg)。
化合物1白色粉末;ESI-MS:m/z169[M+Na]+,C9H6O2;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.42(1H,d,J=9.6 Hz,H-3),7.28(1H,td,J=7.2,1.2 Hz,H-6),7.33(1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-8),7.49(1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-5),7.53(1H,td,J=7.2,1.2 Hz,H-7),7.71(1H,d,J=9.6 Hz,H-4);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:116.8(C-3),117.0(C-8),118.9(C-10),124.6(C-6),128.0(C-5),132.0(C-7),143.6(C-4),154.1(C-9),160.9(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致,故鑒定為香豆素。
化合物2黃色粉末;ESI-MS:m/z201[M+Na]+,C10H10O3;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.64(3H,s,CH3-2),2.43(3H,s,CH3-6),6.85(1H,s,H-7),6.90(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),7.54(1H,d,J=7.8 Hz,H-4);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:22.2(CH3-2),22.9(CH3-6),103.8(C-2),113.6(C-7),116.1(C-9),124.1(C-5),125.1(C-4),151.7(C-6),170.7(C-8),198.4(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致,故鑒定為2-hydroxy-2,6-dimethylbenzofuran-3(2H)-one。
化合物3無(wú)色油狀;ESI-MS:m/z201[M+Na]+,C10H10O3;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:2.37(3H,s,Me-4),2.52(3H,s,H-10),6.74(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.84(1H,s,H-3),7.63(1H,d,J=8.4 Hz,H-6);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:22.4(Me-4),26.8(C-10),113.0(C-1),118.8(C-3),121.2(C-5),132.3(C-6),150.5(C-4),164.4(C-2),195.3(C-8),199.6(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致,故鑒定為1-(2-hydroxy-4-methylphenyl)propan-1,2-dione。
化合物4白色粉末;ESI-MS:m/z191[M+Na]+,C10H16O2;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:0.86(3H,d,J=6.6 Hz,CH3-4),0.92(3H,d,J=6.6 Hz,CH3-6),1.70(3H,t,J=1.8 Hz,CH3-3),1.87(1H,m,H-6),2.12(1H,t,J=16.2 Hz,H-5α),2.16(1H,m,H-4),2.32(1H,dd,J=16.2,3.6 Hz,H-5β),4.25(1H,dt,J=9.6,1.8 Hz,H-7),6.68(1H,s,H-2);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:15.4(CH3-3),16.7(CH3-4),20.9(CH3-6),27.3(C-4),37.2(C-5),51.2(C-6),69.4(C-7),135.4(C-3),151.9(C-2),202.3(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致,故鑒定為subamone。
化合物5無(wú)色油狀;ESI-MS:m/z261[M+Na]+,C15H26O2;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:0.61(3H,s,H-14),0.86(3H,d,J=6.6 Hz,H-12),0.92(3H,d,J=6.6 Hz,H-13),1.31(1H,m,H-8α),1.35(1H,m,H-9α),1.50(1H,m,H-2β),1.72(1H,m,H-9β),1.74(1H,m,H-11),1.84(1H,d,J=10.8 Hz,H-5),1.87(1H,m,H-2α),1.90(1H,m,H-8β),2.18(1H,m,H-3α),2.24(1H,m,H-3β),2.31(1H,m,H-6),3.13(1H,dd,J=7.8,4.2 Hz,H-7),3.48(1H,dd,J=11.4,4.8 Hz,H-1),4.67(1H,s,H-15α),4.81(1H,s,H-15β);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:12.9(C-14),16.4(C-12),21.3(C-13),27.5(C-8),32.4(C-11),32.7(C-2),36.0(C-3),38.6(C-9),40.9(C-6),50.7(C-10),56.2(C-5),79.8(C-1),82.8(C-7),107.4(C-15),149.4(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致,故鑒定為(7R*)-opposit-4(15)-ene-1β,7-diol。
化合物6白色粉末;ESI-MS:m/z177[M+Na]+,C7H6O4;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.65(1H,d,J=8.4 Hz,H-3),7.28(1H,d,J=8.4 Hz,H-4),7.35(1H,s,H-6);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:115.2(C-1),117.8(C-3),123.0(C-6),130.6(C-4),145.3(C-5),148.9(C-2),175.8(COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致,故鑒定為2,5-二羥基苯甲酸。
化合物7白色粉末;ESI-MS:m/z203[M+Na]+,C9H8O4;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.16(1H,d,J=15.6 Hz,H-8),6.71(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.86(1H,dd,J=8.4,1.8 Hz,H-6),6.97(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),7.45(1H,d,J=15.6 Hz,H-7);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:115.0(C-5),116.1(C-2),116.5(C-8),122.8(C-6),127.9(C-1),146.6(C-3),146.8(C-7),149.4(C-4),171.5(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致,故鑒定為咖啡酸。
化合物8白色粉末;ESI-MS:m/z189[M+Na]+,C10H14O2;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:1.19(3H,d,J=7.2 Hz,H-10),2.17(3H,s,H-7),3.18(1H,dd,J=13.2,6.6 Hz,H-8),3.43(1H,d,J=6.6 Hz,H-9β),3.66(1H,dd,J=10.2,5.4 Hz,H-9α),6.50(1H,s,H-2),6.54(1H,d,J=7.8 Hz,H-6),6.91(1H,d,J=7.8 Hz,H-5);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:17.1(C-10),21.1(C-7),36.7(C-8),68.1(C-9),116.6(C-2),121.3(C-6),128.3(C-5),128.6(C-4),137.8(C-1),156.0(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致,故鑒定為9-羥基百里酚。
化合物9無(wú)色油狀;ESI-MS:m/z177[M+Na]+,C7H6O4;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.65(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.28(1H,d,J=8.4 Hz,H-6),7.42(1H,d,J=1.8 Hz,H-2);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:115.5(C-5),117.7(C-2),123.5(C-6),126.2(C-1),145.7(C-3),150.4(C-4),172.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致,故鑒定為原兒茶酸。
化合物10白色粉末;ESI-MS:m/z187[M+Na]+,C9H8O3;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.37(1H,d,J=16.2 Hz,H-8),6.64(1H,d,J=1.8 Hz,H-5),6.65(1H,d,J=1.8 Hz,H-3),7.00(1H,td,J=7.8,1.8 Hz,H-4),7.28(1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6),7.77(1H,d,J=16.2 Hz,H-7);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:116.9(C-3),119.1(C-8),120.7(C-5),122.7(C-1),129.9(C-6),132.4(C-4),142.1(C-7),158.1(C-2),171.8(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致,故鑒定為反式鄰羥基肉桂酸。
化合物11黃色粉末;ESI-MS:m/z185[M+Na]+,C9H6O3;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.13(1H,d,J=9.6 Hz,H-3),6.65(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.74(1H,dd,J=8.4,2.4 Hz,H-6),7.40(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.81(1H,d,J=9.6 Hz,H-4);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:103.5(C-8),112.0(C-3),112.9(C-10),114.8(C-6),130.7(C-5),146.1(C-4),157.3(C-9),163.8(C-2),163.8(C-7)。以上數(shù)據(jù)[14]與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致,故鑒定為7-羥基香豆素。
化合物12黃色粉末;ESI-MS:m/z325[M+Na]+,C15H10O7;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.13(1H,s,H-8),6.34(1H,s,H-6),6.83(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),7.58(1H,d,J=8.4 Hz,H-6′),7.69(1H,s,H-2′);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:94.4(C-8),99.2(C-6),104.5(C-10),116.0(C-2′),116.2(C-5′),121.7(C-6′),124.1(C-1′),137.2(C-3),146.2(C-3′),148.0(C-2),148.7(C-4′),158.2(C-5),162.5(C-9),165.6(C-7),177.3(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致,故鑒定為槲皮素。
化合物13白色粉末;ESI-MS:m/z449[M+Na]+,C30H50O;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:0.76(3H,s,CH3-24),0.85(6H,s,CH3-25,CH3-28),0.93(3H,s,CH3-27),0.97(3H,s,CH3-23),1.01(3H,s,CH-26),1.01(3H,d,J=6.6 Hz,CH3-29),3.20(1H,dd,J=11.4,4.8 Hz,H-3),4.60(1H,t,J=2.4 Hz,H-30β),4.61(1H,t,J=2.4 Hz,H-30α);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:14.9(C-27),15.5(C-24),16.0(C-25),16.4(C-26),18.4(C-6),19.6(C-29),21.6(C-11),25.6(C-21),25.8(C-12),26.3(C-28),26.8(C-15),27.5(C-2),28.1(C-23),34.2(C-7),34.7(C-17),37.3(C-10),38.4(C-19),38.9(C-1),39.0(C-4,C-13),39.3(C-16),39.5(C-22),41.0(C-8),42.2(C-14),48.8(C-18),50.6(C-9),55.5(C-5),79.2(C-3),107.3(C-30),154.8(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致,故鑒定為蒲公英甾醇。
化合物14無(wú)色油狀;ESI-MS:m/z313[M+Na]+,C17H22O4;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.24(3H,d,J=7.2 Hz,H-10),1.99(3H,s,OCOCH3),2.07(3H,m,H-5′),2.08(3H,dd,J=7.2,1.2 Hz,H-4′),2.33(3H,s,H-7),3.23(1H,m,H-8),4.12(2H,d,J=7.2 Hz,H-9),6.28(1H,q,J=7.2 Hz,H-3′),6.89(1H,s,H-2),7.04(1H,d,J=7.8 Hz,H-6),7.19(1H,d,J=7.8 Hz,H-5);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:16.1(C-4′),17.6(C-10),20.9(C-7),21.1(C-5′),21.1(CH3CO-),32.0(C-8),68.7(C-9),123.3(C-2),127.1(C-6),127.1(C-5),127.2(C-2′),131.9(C-4),137.7(C-1),141.2(C-3′),148.6(C-3),166.4(C-1′),171.3(CH3CO-)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致,故鑒定為9-acetoxythymol 3-O-tiglate。
化合物15白色粉末;ESI-MS:m/z491[M+Na]+,C32H52O2;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:0.84,0.84,0.85,0.87,0.92,1.01,1.02(21H,7×-CH3),2.04(3H,s,COCH3),4.48(1H,dd,J=5.4,10.8Hz,H-3),4.60(2H,m,H-30);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:14.9(C-27),16.0(C-25),16.5(C-26),16.6(C-24),18.3(C-6),19.6(C-28),21.5(C-11),21.6(COMe),23.8(C-2),25.6(C-29),25.7(C-21),26.3(C-12),26.8(C-15),28.1(C-23),34.1(C-7),34.7(C-17),37.2(C-10),37.9(C-4),38.4(C-16),38.6(C-1),39.0(C-22),39.3(C-13),39.5(C-19),41.0(C-8),42.2(C-14),48.7(C-18),50.5(C-9),55.6(C-5),81.1(C-3),107.6(C-30),154.8(C-20),171.2(C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本基本一致,故鑒定為蒲公英甾醇乙酸酯。
化合物16無(wú)色油狀;ESI-MS:m/z303[M+Na]+,C18H32O2;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:0.89(3H,t,J=6.8 Hz,H-18),1.32(14H,m,H-4,5,6,7,15,16,17),1.63(2H,m,H-3),2.05(4H,q,J=7.2 Hz,H-8,14),2.35(2H,t,J=7.2 Hz,H-2),2.77(2H,t,J=6.6 Hz,H-11),5.35(4H,m,H-9,10,12,13);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:14.2(C-18),22.7(C-17),24.8(C-3),25.8(C-11),27.3(C-14),27.3(C-8),29.2(C-4),29.2(C-5),29.3(C-6),29.5(C-7),29.7(C-15),31.7(C-16),34.1(C-2),128.0(C-10),128.2(C-12),130.2(C-13),130.4(C-9),179.7(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致,故鑒定為亞油酸。
化合物17無(wú)色油狀;ESI-MS:m/z271[M+Na]+,C15H20O3;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.37(3H,d,J=7.2 Hz,H-10),1.90(3H,s,H-5′),1.98(3H,d,J=7.2 Hz,H-4′),2.28(3H,s,H-7),3.38(1H,m,H-8),3.98(1H,dd,J=10.8,8.4 Hz,H-9β),4.38(1H,dd,J=10.8,4.8 Hz,H-9α),6.12(1H,m,H-3′),6.68(1H,s,H-2),6.72(1H,d,J=7.8 Hz,H-6),7.06(1H,d,J=7.8 Hz,H-5);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:16.0(C-4′),16.6(C-10),20.7(C-5′),21.1(C-7),32.3(C-8),69.6(C-9),116.9(C-2),121.4(C-6),125.1(C-5),127.0(C-2′),127.7(C-4),138.0(C-1),139.3(C-3′),154.2(C-3),169.1(C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致,故鑒定為9-angeloyloxythymol。
化合物18白色粉末;ESI-MS:m/z435[M+Na]+,C29H48O;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:3.52(1H,m,3α-H),5.01(1H,dd,J=8.4,15.0 Hz,H-23),5.14(1H,dd,J=8.4,15.0 Hz,H-22),5.35(1H,s,H-6);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:12.2(C-18),12.42(C-29),19.1(C-26),19.6(C-19),21.2(C-21),21.3(C-7),21.4(C-11),24.5(C-15),25.6(C-28),29.1(C-16),31.8(C-1),32.0(C-2,7,8,25),36.6(C-10),37.4(C-12),39.8(C-4),40.7(C-20),42.4(C-13),50.3(C-9),51.4(C-24),56.1(C-14),57.0(C-17),72.0(C-3),121.9(C-6),129.4(C-23),138.5(C-22),140.9(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致,故鑒定為豆甾醇。
化合物19白色粉末;ESI-MS:m/z279[M+Na]+,C16H32O2;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:0.88(3H,t,J=6.6Hz,H-16),1.25(24H,s,12×-CH2),1.64(2H,m,H-3),2.35(2H,t,J=7.8Hz,H-2);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:14.3,22.9,24.9,29.2,29.4,29.5,29.6,29.7,29.9,32.1,33.6。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致,故鑒定為棕櫚酸。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多種色譜方法從白頭婆花70%乙醇提取物中分離鑒定了19個(gè)化合物,其中化合物2~9、11~13、16、19為首次從白頭婆中分離得到,化合物4~6、16為首次從澤蘭屬中分離得到。這些化合物主要為苯丙素類和萜類,其中苯丙素類化合物有主要有香豆素、1-(2-hydroxy-4-methylphenyl)propan-1,2-dione、咖啡酸、反式鄰羥基肉桂酸、7-羥基香豆素、9-羥基百里酚;研究表明,香豆素具有廣泛的生物活性,抑菌效果顯著[23],咖啡酸具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[24]。萜類化合物包括蒲公英甾醇、蒲公英甾醇乙酸酯、豆甾醇;豆甾醇生理活性強(qiáng),具有抗炎,抗氧化,抗腫瘤等多種活性[25],其中化合物得量最多的是蒲公英甾醇乙酸酯(2.8 g),這與課題組前期對(duì)白頭婆全草化學(xué)成分的研究結(jié)果相似[26],說(shuō)明蒲公英甾醇乙酸酯可能是白頭婆全草及花的主要化學(xué)成分,研究表明其具有抗炎[27]、抗瘧疾[28]活性,但其是否可作為白頭婆的藥效物質(zhì),是否具有其他活性仍需進(jìn)一步研究。以上分離鑒定的化合物大多具有多種生物活性,為白頭婆的開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)。