潘麗媛，賀建波，趙晉銘，王吳彬，邢光南，喻德躍，張小燕，李春燕，陳受宜，蓋鈞鎰

RTM-GWAS方法應(yīng)用于大豆RIL群體百粒重QTL檢測的功效

潘麗媛1，賀建波1，趙晉銘1，王吳彬1，邢光南1，喻德躍1，張小燕3，李春燕3，陳受宜2，蓋鈞鎰1

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所/國家大豆改良中心/農(nóng)業(yè)部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/江蘇省現(xiàn)代作物 生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095；2中國科學(xué)院遺傳發(fā)育研究所/植物基因組學(xué)國家重點實驗室，北京 100101；3山東圣豐種業(yè)科技有限公司，山東嘉祥 272400）

【】為全面解析大豆重組自交系群體中調(diào)控百粒重性狀的QTL體系，將限制性兩階段多位點全基因組關(guān)聯(lián)分析方法（RTM-GWAS）和不同定位方法進行比較、優(yōu)選，為后續(xù)候選基因體系探索及分子標(biāo)記輔助育種設(shè)計提供依據(jù)。利用以科豐1號和南農(nóng)1138-2為親本衍生的重組自交系群體NJRIKY的427個家系，通過由全基因組39 353個SNP構(gòu)建的3 683個SNPLDB標(biāo)記及3個環(huán)境下的百粒重表型數(shù)據(jù)，選用復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM）、基于混合線性模型的全基因組關(guān)聯(lián)分析方法（MLM-GWAS）和RTM-GWAS 3種方法檢測百粒重QTL，通過QTL數(shù)目和總的表型變異解釋率比較檢測功效，挑選最佳定位結(jié)果進行NJRIKY群體中的百粒重遺傳體系解析。通過候選基因體系的功能注釋，挖掘調(diào)控大豆百粒重的生物學(xué)途徑。科豐1號與南農(nóng)1138-2的百粒重差異較大，多環(huán)境平均數(shù)分別為9.0和17.9 g，遺傳變異系數(shù)為12.4%，遺傳率為85.4%，適用于百粒重性狀的遺傳解析。比較3種方法定位結(jié)果表明RTM-GWAS方法表現(xiàn)最佳，檢測QTL數(shù)目最多（57個），解釋表型變異最多（70.78%）。而CIM僅檢測到14個QTL，解釋了56.47%的表型變異，MLM-GWAS僅定位到6個QTL，解釋了18.47%的表型變異。RTM-GWAS共檢測到57個QTL，分布在19條染色體上，表型變異解釋率為0.03%—7.57%，其中41個QTL覆蓋了已報道的來自30個雙親群體的81個百粒重QTL，16個QTL為新發(fā)現(xiàn)位點，包含一個表型變異解釋率大于3%的大效應(yīng)位點。此外，檢測的57個QTL中有20個位點與環(huán)境存在互作效應(yīng)。這57個QTL構(gòu)成了影響NJRIKY群體百粒重性狀的遺傳體系。通過SNPLDB標(biāo)記與預(yù)測基因內(nèi)的SNP進行χ2檢驗，共篩選到36個候選基因，其中4個候選基因來自大效應(yīng)QTL，剩余32個候選基因來自小效應(yīng)QTL。通過GO注釋發(fā)現(xiàn)這些候選基因功能注釋豐富，其中13個候選基因與籽粒發(fā)育直接相關(guān)，剩余的候選基因功能豐富，包含轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等，表明不同生物學(xué)途徑的基因共同調(diào)控NJRIKY群體中百粒重性狀的表達。3種定位方法中，高效的RTM-GWAS方法檢測到較為全面的NJRIKY群體的百粒重QTL，更適用于雙親RIL群體的QTL定位。不同功能的候選基因共同調(diào)控了復(fù)雜的百粒重性狀的表達。

大豆；百粒重；QTL；重組自交家系；限制性兩階段多位點全基因組關(guān)聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】大豆是人類植物蛋白和脂肪的主要食物來源[1]，產(chǎn)量一直是大豆生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)注點，而百粒重是大豆產(chǎn)量構(gòu)成的重要因子，一般與產(chǎn)量呈正相關(guān)[2]。百粒重作為數(shù)量性狀，具有復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)，而現(xiàn)有的連鎖定位方法，僅能定位到少數(shù)幾個位點，限制了其遺傳體系的全面解析，需要高效的定位方法進行全基因組QTL檢測以全面解析其遺傳基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】前人基于連鎖定位的復(fù)合區(qū)間作圖法（composite interval mapping，CIM）[3]對多個雙親群體進行了百粒重性狀的QTL定位分析。目前，SoyBase數(shù)據(jù)庫（https://www.soybase.org/，截至2017年3月）已經(jīng)收錄了基于40個不同群體、利用不同定位方法檢測到的250個大豆百粒重QTL。最近，F(xiàn)ujii等[4]利用一個包含181個家系的重組自交系群體（recombinant inbred line，RIL），在2個環(huán)境下利用CIM方法共檢測到5個百粒重QTL，分布于第12、13、17和20等4條染色體上。Zhang等[5]通過半野生豆花皮豆（Huapidou）和一個栽培豆齊黃26（Qihuang26）衍生的RIL群體，利用完備區(qū)間作圖法（inclusive composite interval mapping，ICIM）和CIM分別檢測到10個和5個百粒重QTL。由于連鎖定位往往僅能定位到少數(shù)幾個大效應(yīng)位點，并且置信區(qū)間較大，不利于進一步篩選候選基因?，F(xiàn)今，眾多研究者通過關(guān)聯(lián)分析的方法，利用自然群體進行大豆百粒重遺傳解析[6-13]。Copley等[14]利用86個早熟組（MG 000—MG 00）大豆材料在2個環(huán)境下僅檢測到5個百粒重QTL。Jing等[15]通過由地方種質(zhì)和育成品種構(gòu)成的包含185個大豆材料的自然群體檢測到20個與百粒重關(guān)聯(lián)的SNP位點，其中11個SNP連續(xù)分布在同一基因組區(qū)域。為了解決現(xiàn)有GWAS方法中遺傳率缺失（missing heritability）和自然群體中的復(fù)等位變異問題，He等[16]開發(fā)了一種新的限制性兩階段多位點關(guān)聯(lián)分析方法（restricted two-stage multi-locus genome- wide association study，RTM-GWAS），該方法通過遺傳率控制位點的總表型變異解釋率，利用二階段方法和多位點模型提高了檢測功效，并成功應(yīng)用于多個自然群體和多親本群體[17-22]?！颈狙芯壳腥朦c】利用連鎖定位方法檢測到的大豆百粒重QTL較少，表型變異解釋率丟失較多。而隨著分子標(biāo)記信息的加密，關(guān)聯(lián)分析的精度提高，并且雙親群體中的群體結(jié)構(gòu)簡單[23]，前人已多次成功將關(guān)聯(lián)分析方法應(yīng)用于雙親群體中[24-26]，選擇高效的關(guān)聯(lián)分析方法有助于大豆百粒重數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的全面解析，可為揭示其完整基因體系提供支持?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于科豐1號×南農(nóng)1138-2衍生的重組自交系NJRIKY群體，利用3個環(huán)境下的大豆百粒重表型數(shù)據(jù)和3 683個SNPLDB標(biāo)記，使用CIM、MLM-GWAS和RTM-GWAS 3種定位方法檢測百粒重QTL，以QTL數(shù)目及總的表型變異解釋率判定其檢測功效，篩選最佳定位方法，進一步解析NJRIKY群體中百粒重的全基因組QTL體系及候選基因體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以栽培大豆科豐1號和南農(nóng)1138-2為母本和父本，衍生了一個含有427個家系的重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體。群體命名為NJRIKY，由兩部分組成；其中184個家系創(chuàng)制于1994年夏，F(xiàn)2世代采用單粒傳法繁代，F(xiàn)3-F7家系內(nèi)混合收獲播種，F(xiàn)7家系內(nèi)隨機收獲1株，種植F2:8世代，最終經(jīng)過群體校正后獲得；另外243個家系采用同樣方法獲得[27]。親本科豐1號來自黃淮海二熟制春夏作大豆品種生態(tài)區(qū)，由中科院遺傳研究所選育，熟期組為MG II，黑色種皮；親本南農(nóng)1138-2來自長江中下游二熟制春夏作大豆品種生態(tài)區(qū)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)選育，熟期組為MG V，黃色種皮[28]。

1.2 田間試驗

NJRIKY群體及親本，2012—2013年夏季于江蘇省南京市南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗站（32.07°N, 118.62°E）和2013年夏季于山東省濟寧市圣豐試驗站（36.67°N，116.98°E）3個環(huán)境進行田間試驗。3個環(huán)境分別簡稱為12JP、13JP和13SF，代表2012年江浦試驗站、2013年江浦試驗站和2013年圣豐試驗站。田間試驗均采用立方格子設(shè)計，每個環(huán)境3次重復(fù)，江浦試驗站采用穴播，兩穴一個小區(qū)，穴距為0.7 m×0.8 m，每穴定苗6株；圣豐試驗站采用行播，行長2 m，行距0.5 m，常規(guī)田間管理，籽粒成熟后按小區(qū)分別收獲脫粒，并在35—40℃條件下烘干至恒重，取100個完整籽粒置于精度0.01 g天平稱量記錄。

1.3 標(biāo)記分型

利用427家系及2個親本的新鮮幼嫩葉片采用CTAB法[29]提取DNA，建庫并利用Illumina Hiseq2000進行雙端測序，通過與參考基因組Williams82 v1.1比對獲得SNP。按照缺失≤20%、錯誤率≤1%和雜合率＜5%的標(biāo)準過濾獲得39 353個高質(zhì)量SNP。利用NPUTE[30]對SNP缺失基因型進行填補，用于SNPLDB（SNP linkage disequilibrium block）標(biāo)記構(gòu)建[25]。利用賀建波等[16]開發(fā)的RTM-GWAS軟件，根據(jù)雙親帶型劃分SNPLDB標(biāo)記，設(shè)置的最大窗口為200 kb使用默認設(shè)置的置信區(qū)間法定義區(qū)段，計算標(biāo)記間的LD（D’），若95%以上的SNP的D’值位于0.70—0.98，則說明具有強LD水平，則被劃分到一個單體型區(qū)塊中，這樣全基因組的SNP被劃分為SNP連鎖不平衡區(qū)塊（SNP linkage disequilibrium block，SNPLDB）。根據(jù)雙親帶型進行SNPLDB基因型分型，少量非親本單體型被與其最相似的親本單體型替換，最終獲得3 683個SNPLDB標(biāo)記用于遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位[25]。

1.4 表型數(shù)據(jù)分析

采用SAS軟件PROC GLM進行多環(huán)境下表型數(shù)據(jù)的聯(lián)合方差分析，同時利用PROC MIXED的REML方法估計方差組分，根據(jù)和分別估計多環(huán)境和單環(huán)境下的性狀遺傳率，遺傳變異系數(shù)（genotypic coefficient of variation，GCV）為100×σ/，其中為遺傳方差，為基因型與環(huán)境互作方差，為誤差方差，為環(huán)境的個數(shù)，為一個環(huán)境內(nèi)的試驗重復(fù)數(shù)，為整體平均數(shù)。

1.5 QTL定位方法

利用3種方法進行NJRIKY群體的百粒重QTL定位，分別為復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM）[3]、混合線性模型全基因組關(guān)聯(lián)分析方法（mixed linear model GWAS或MLM-GWAS）[31]、限制性兩階段多位點全基因組關(guān)聯(lián)分析方法（RTM-GWAS）[16]。

CIM方法應(yīng)用Windows QTL Cartographer V2.5軟件，表型數(shù)據(jù)為多環(huán)境下各家系百粒重均值，前景及背景選擇的顯著水平為0.05，步長為1 cM，并進行排列測驗1 000次，確定QTL檢測LOD閾值。

MLM-GWAS方法[31]應(yīng)用TASSEL 3.0軟件[32]，表型數(shù)據(jù)為多環(huán)境下各家系百粒重均值，參數(shù)設(shè)定為默認參數(shù)，采用5個主成分（principal component，P）和個體間親緣關(guān)系（kinship，K）矩陣，即P+K模型的MLM進行關(guān)聯(lián)分析，并利用R軟件fdrtool包[33]進行假發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）多重測驗校正，顯著水平為0.05。

RTM-GWAS方法利用限制性二階段多位點全基因組關(guān)聯(lián)分析方法（RTM-GWAS）軟件[16]進行QTL定位，表型數(shù)據(jù)為多環(huán)境小區(qū)原始觀測值，顯著水平設(shè)為0.05，分析模型同時考慮QTL與環(huán)境互作效應(yīng)。根據(jù)表型變異解釋率（phenotypic variation explained，PVE）大小將QTL分為兩類：大貢獻（large contribution，LC）主效位點（PVE≥3%）；小貢獻（small contribution，SC）主效位點（PVE＜3%）。

1.6 候選基因體系注釋

首先，檢測SNPLDB標(biāo)記（±100 kb）物理區(qū)間內(nèi)的注釋基因；然后利用卡平方（χ2）獨立性測驗，顯著水平設(shè)為0.05，檢測SNPLDB標(biāo)記與注釋基因內(nèi)SNP之間的相關(guān)性。當(dāng)這二者顯著相關(guān)時，則該SNP所在的注釋基因被確定為候選基因；同時，利用SoyBase數(shù)據(jù)庫（https://www. soybase.org）提取所有注釋基因的功能注釋（gene ontology，GO），優(yōu)先選擇與籽粒發(fā)育相關(guān)的注釋基因確定為候選基因。同時給出候選基因的功能注釋（GO）結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 多環(huán)境下NJRIKY群體百粒重變異

從表1可以看出3個環(huán)境下NJRIKY群體的親本科豐1號和南農(nóng)1138-2的表型差異較大，多環(huán)境平均值分別為9.0和17.9 g，重組自交家系的百粒重變異范圍為8.6—17.1 g（圖1），遺傳變異系數(shù)為12.4%，變異范圍位于雙親之間。該群體百粒重的遺傳率較高，多環(huán)境聯(lián)合下為85.4%，單環(huán)境下為92.5%—93.9%。多環(huán)境聯(lián)合方差分析的結(jié)果表明家系間、環(huán)境間及家系與環(huán)境互作的差異均達到極顯著水平（表2）。

Mean表示各家系3個環(huán)境百粒重平均數(shù)

表1 多環(huán)境下NJRIKY群體百粒重的次數(shù)分布和描述統(tǒng)計

Table 1 Frequency distribution and descriptive statistics of 100-seed weight of NJRIKY under multiple environments

：遺傳變異系數(shù): genotypic coefficient of variation

表2 NJRIKY群體多環(huán)境聯(lián)合方差分析結(jié)果

2.2 不同定位方法下百粒重QTL檢測結(jié)果

利用3 683個SNPLDB標(biāo)記及CIM、MLM-GWAS和RTM-GWAS 3種定位方法對NJRIKY群體的百粒重性狀進行QTL定位（表3），并通過QTL的數(shù)目和總的表型變異解釋率來比較各個方法的檢測功效，選取最佳的定位結(jié)果進行該群體的百粒重遺傳體系解析。

表3 NJRIKY群體中利用不同定位方法檢測到的百粒重位點結(jié)果概要

檢測的QTL：本研究檢測的QTL數(shù)目和染色體數(shù)目，57（19）：57個QTL位于19條染色體上。Mapped QTL：所有定位到的QTL的匯總。大貢獻主效QTL和小貢獻主效QTL分別表示貢獻率≥3%與＜3%的主效QTL。QTL×Env.表示QTL與環(huán)境互作效應(yīng)。已報道的QTL：SoyBase (http://www.soybase.org) 數(shù)據(jù)庫中前人報道的與始花期位于鄰近1 Mb位置的QTL數(shù)目，41（84）表示41個QTL與SoyBase (http://www.soybase.org) 中84個QTL位置一致或鄰近

Detected QTLs: the number of detected QTLs and chromosomes in the present study, 57(19): 57 QTLs on 19 chromosomes. Mapped QTL: the sum of all major QTLs. LC major QTL: the QTL detected from RTM-GWAS with its PVE more than 3% is called large-contribution (LC) major QTLs; SC major QTL: small-contribution major QTL with PVE less than 3%. QTL × Env.: the interaction between QTL and environments. Reported QTLs: the number of QTLs reported in SoyBase (http://www.soybase.org) that is nearby the present detected QTL in the RTM-GWAS procedure according to the physical position within 1 Mb, 41 (84): 41 QTLs shared same confidence regions with 84 SoyBase QTLs

在連鎖定位中較為普遍使用的CIM方法下共檢測到14個百粒重QTL，分布在8個連鎖群上，總表型變異解釋率（PVE）為56.47%（圖2和表4）。在普遍使用的關(guān)聯(lián)分析方法MLM-GWAS中僅檢測到6個QTL，位于3條染色體上，總PVE為18.47%（圖2和表4）。利用RTM-GWAS方法，檢測到57個百粒重QTL，分布在除Gm19以外的19條染色體上，共解釋70.78%的表型變異，結(jié)合方差分析估計得到的遺傳率為85.4%，剩余14.52%的表型變異來源于未定位到的微效QTL（圖2）。其中位于13條染色體上的20個百粒重QTL與環(huán)境存在互作效應(yīng)，共解釋4.20%的表型變異（表3和表5）。

遵循常規(guī)，以位點前后1 Mb的范圍來歸并QTL，發(fā)現(xiàn)RTM-GWAS方法幾乎覆蓋了CIM（8個QTL/共14個QTL，PVE=40.85%/總PVE=56.47%）和MLM-GWAS（4個QTL/共6個QTL，PVE=12.96%/總PVE=18.47%）方法的結(jié)果，包括位于第11染色體上的效應(yīng)最大的位點Gm11_BLOCK_5228756_ 5269867，這個位點在3種方法中的表型變異解釋率均最大，分別為11.05%（CIM）、3.69%（MLM-GWAS）和7.57%（RTM-GWAS）。

表4 NJRIKY群體中在CIM和MLM-GWAS方法下的百粒重QTL

LOD/-lg：LOD為CIM方法中QTL檢測的LOD（logarithm of odds）得分，-lg為MLM-GWAS方法中QTL檢測的值的對數(shù)值。SoyBase QTL：SoyBase (http://soybase.org) 數(shù)據(jù)庫中前人報道的與始花期位于鄰近1 Mb位置的QTL名稱

LOD/-lg: LOD is the logarithm of odds score in CIM and -lgis thevalue in log10 scale in MLM-GWAS. SoyBase QTL: the QTL names reported in SoyBase (http://soybase.org) that is nearby the present detected QTL in the RTM-GWAS procedure according to the physical position within 1 Mb

表5 NJRIKY群體中與百粒重性狀關(guān)聯(lián)的QTL位點

*表示該QTL具有QTL與環(huán)境互作效應(yīng)。標(biāo)記中Gm后的數(shù)字表示其所在染色體，末端數(shù)字為其對應(yīng)物理位置

* indicates the QTL interacted with environments. The number after “Gm” means the chromosome number, the number at the end of a marker indicates the corresponding physical position

以上3種定位方法的百粒重QTL結(jié)果表明，RTM-GWAS方法的檢測功效最高，檢測到更多的QTL（57 vs. 14和6），解釋了更多的表型變異（70.78% vs. 56.47%和18.47%），在NJRIKY群體中檢測到了較為全面的百粒重性狀的遺傳體系，所以將對RTM-GWAS方法檢測到的由57個QTL構(gòu)成的影響NJRIKY群體百粒重性狀的遺傳體系進行進一步的遺傳解析。這里要特別指出，RTM-GWAS還檢測到57個QTL中有20個是與環(huán)境存在互作（或因環(huán)境而波動）的QTL，這是其他2種定位方法所不及的。

2.3 NJRIKY RIL群體中百粒重的QTL及候選基因體系

利用3 683個SNPLDB標(biāo)記及RTM-GWAS方法對NJRIKY群體百粒重進行全基因QTL檢測，第一階段中，利用一般線性模型（general linear model，GLM）篩選到1 860個候選SNPLDB標(biāo)記；第二階段中，多位點模型最終檢測到57個與百粒重相關(guān)的QTL（圖3和表5）。

a：染色體結(jié)構(gòu)，異染色質(zhì)區(qū)域標(biāo)為淺紅色（單位為Mb）

圖3 NJRIKY中百粒重關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖和QQ圖

57個百粒重QTL分布于19條染色體，表型變異解釋率變化范圍為7.57%—0.13%，其中35個QTL的PVE為0.13%—1.00%，17個為1.00%—3.00%，剩余5個為3.00%—7.57%，表明百粒重作為一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，其所包含的位點貢獻率變化范圍廣，不僅僅包含表型變異解釋率很大的QTL，還包含更多小貢獻率的QTL。

57個QTL構(gòu)成的調(diào)控NJRIKY群體百粒重的QTL體系中，第4染色體包含的QTL數(shù)目最多，共14個QTL，第20染色體包含的QTL最少，僅為1個QTL。、、、、分別解釋了7.57%、5.12%、3.72%和3.61%的表型變異（phenotypic variation，PV），為大貢獻主效QTL，共解釋了23.30%的PV，剩余52個小貢獻主效QTL共解釋了47.48%的PV。NJRIKY群體的QTL體系中41個QTL與SoyBase中收錄的包含52個親本的30個雙親群體中檢測到的81個QTL（共250個QTL）的位置一致（表3）。

RTM-GWAS在3個環(huán)境下還檢測到20個QTL與環(huán)境存在互作效應(yīng)，其中，3個位于第4、9和11染色體的大貢獻主效QTL和17個位于12條染色體上的小貢獻主效QTL（表5）。

通過RTM-GWAS方法對NJRIKY群體的百粒重性狀進行較為全面的檢測后，基于高密度的遺傳標(biāo)記，進一步推斷其候選基因體系。通過SNPLDB標(biāo)記與預(yù)測基因內(nèi)的SNP進行χ2檢驗，共在57個QTL中檢測到36個候選基因解釋了54.12%的PV，其中4個候選基因來自4個大貢獻主效QTL，剩余32個候選基因來自32個小貢獻主效位點，還有20個QTL中未檢測到符合條件的候選基因（存在2個QTL的候選基因相同）（表6）。通過GO注釋可以看出13個候選基因與籽粒發(fā)育相關(guān)，剩余的候選基因的功能變化豐富，包含了轉(zhuǎn)運、蛋白糖基化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、脫落酸響應(yīng)等，表明這些候選基因通過不同生物途徑共同調(diào)控百粒重性狀的表達。

3 討論

3.1 高效的RTM-GWAS方法適用于雙親群體的QTL定位

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，植物生物學(xué)家的研究重心逐漸從少數(shù)基因功能向挖掘調(diào)控目標(biāo)性狀的全面基因體系和基因網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)移[34]。前人結(jié)果表明，RTM-GWAS方法適用于自然群體和巢式關(guān)聯(lián)群體的數(shù)量性狀全基因組位點檢測[16-17, 19]。本研究在3種不同的QTL方法中，RTM-GWAS幾乎覆蓋了其他方法（CIM和MLM-GWAS）檢測到的所有QTL。RTM-GWAS檢測到較多的QTL（57個QTL）解釋了更多的表型變異（70.78%），而在CIM和MLM-GWAS檢測到的QTL僅解釋了56.47%和18.47%的表型變異。由于雙親群體中不存在復(fù)雜的群體結(jié)構(gòu)問題，將關(guān)聯(lián)分析的方法應(yīng)用到雙親群體中，提高了檢測精度，將大大加快雙親群體數(shù)量性狀的遺傳體系的全面解析。另外，利用RTM-GWAS方法，由于其通過遺傳率控制了位點的總表型變異解釋率，利用二階段和多位點模型提高了檢測功效，僅利用一個雙親群體就檢測到了41個QTL與已報道的52個大豆材料中的81個QTL位置一致，并且13個候選基因與籽粒發(fā)育相關(guān)，表明RTM-GWAS方法在雙親群體RIL群體中QTL定位表現(xiàn)高效，適用于雙親群體的QTL定位。

3.2 大豆百粒重性狀的遺傳體系

大豆是人類重要的植物蛋白和油脂的食物來源，大豆百粒重與產(chǎn)量的直接相關(guān)[2]，直接決定了大豆百粒重性狀的重要性。前人已經(jīng)通過不同類型的群體對大豆百粒重的遺傳體系進行了研究[18, 35]，本研究利用RTM-GWAS方法在親本具有較大差異的NJRIKY群體中檢測到57個百粒重相關(guān)聯(lián)的QTL，其中16個QTL是該群體檢測到的新位點，的PVE達到5.12%。5個大效應(yīng)主效QTL中，的貢獻率最高為7.57%，其位置與SoyBase中的、和一致，其中和來源于科豐1號和南農(nóng)1138-2的184個家系后代群體[36-37]，QTL區(qū)間較大（5 132 968—6 184 217 bp），群體擴大及標(biāo)記加密后，SNPLDB的位置為5 228 756-5 269 867 bp。的貢獻率為3.71%，與已報道的和位于相近位置。的PVE為3.60%，與已報道的3個QTL位置相近，其中的定位群體為NJRIKY群體的184個家系。的貢獻率為3.27%，與和[38-39]的位置相近，這兩個已報道位點的標(biāo)記區(qū)間極大，約7 Mb，可能是定位的群體大小及標(biāo)記密度的影響。其他小貢獻主效QTL中也不乏被多個群體多次定位到的位點，如的貢獻率在本群體中僅為0.68%，其與SoyBase中的7個雙親群體中的8個QTL位置相近。

表6 RTM-GWAS方法中檢測到的與百粒重相關(guān)的候選基因體系

加粗的候選基因表示該基因的GO注釋與籽粒發(fā)育相關(guān)

The candidate genes in boldface mean their gene ontology description is associated with seed development

NJRIKY群體中檢測到36個候選基因中，13個候選基因與籽粒發(fā)育相關(guān)。其中2個候選基因、分別來自2個大貢獻主效QTL——和，剩余11個候選基因來自11個小貢獻主效位點。如，（PVE=1.87%）的候選基因與胚發(fā)育相關(guān)，其在擬南芥中的同源基因表達產(chǎn)物為TOR蛋白，直接調(diào)控了植物的胚生長發(fā)育和逆境響應(yīng)[40]。具有不同功能的候選基因，共同調(diào)控了復(fù)雜的百粒重性狀的表達，而現(xiàn)今的研究還具有局限性，包括材料的限制等，因此，綜合越來越多的群體中百粒重性狀的結(jié)果，結(jié)合高效的QTL定位方法，為全面解析基因體系及網(wǎng)絡(luò)提供了必要基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

NJRIKY RIL群體中，雙親的百粒重差異較大，適用于百粒重性狀的遺傳解析。利用3種定位方法，在3個環(huán)境下，RTM-GWAS方法定位到的QTL更多，表型變異解釋率更高，其檢測功效優(yōu)于其他2種方法（CIM和MLM-GWAS）。通過RTM-GWAS定位到57個百粒重QTL構(gòu)成了NJRIKY群體的百粒重遺傳體系，表明高效的QTL定位方法將加快全面解析復(fù)雜的百粒重性狀的遺傳體系。

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Detection power of RTM-GWAS applied to 100-seed weight QTL identification in a recombinant inbred lines population of soybean

PAN LiYuan1, HE JianBo1, ZHAO JinMing1, WANG WuBin1, XING GuangNan1, YU DeYue1, ZHANG XiaoYan3, LI ChunYan3, CHEN ShouYi2, GAI JunYi1

(1Soybean Research Institute, Nanjing Agricultural University /National Center for Soybean Improvement /Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministry of Agriculture/State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210095;2Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences/State Key Laboratory of Plant Genomics, Beijing 100101;3Shandong Shofine Seed Technology Co. Ltd., Jiaxiang 272400, Shandong)

【】To thoroughly dissect the QTL system conferring 100-seed weight in a recombinant inbred lines population, the restricted two-stage multi-locus genome-wide association analysis (RTM-GWAS) method was compared with other mapping methods for method optimization, which will provides basis for further exploration of candidate gene system and molecular marker-assisted design breeding. 【】 A recombinant inbred line population consisting of 427 lines derived from a cross between Kefeng-1 and NN1138-2 was tested for its 100-seed weight under three environments. A total of 3 683 SNPLDBs (SNP linkage disequilibrium blocks) composed of 39 353 SNPs were applied to QTL mapping using three different mapping procedures, including the composite interval mapping (CIM) method, the mixed linear model (MLM-GWAS) method and the RTM-GWAS method, and the best mapping procedure was selected for the analysis of the 100-seed weight genetic system in NJRIKY population through comparing their detection power, including the detected number of QTLs and total phenotypic variation explained. 【】The 100-seed weight of Kefeng-1 and NN1138-2 were 9.0 g and 17.9 g, respectively, showing significant difference. The genotypic coefficient of variation and heritability of the trait were 12.4% and 85.4%, respectively. These results indicated that the population was suitable for genetic analysis of 100-seed weight trait. The RTM-GWAS procedure performed the best with the largest number of QTLs (57) explaining the most phenotypic variation (PVE=70.78%), while a total of 14 and 6 QTLs contributing 56.47% and 18.47% phenotypic variation were detected using CIM and MLM-GWAS, respectively. The 57 QTLs detected from the RTM-GWAS distributed on 19 chromosomes, of which 41 QTLs overlapped with 81 QTLs identified from 30 bi-parental populations in the literature. Furthermore, the PVE of 57 QTLs ranged from 0.03% to 7.57%, of which 16 QTLs were novel ones, including one large contribution major QTL(PVE＞3%). Furthermore, 20 QTLs had significant interaction effect with environment. A total of 36 candidate genes were annotated from 37 QTLs through χ2test between SNPLDB markers and SNPs harboring in the predicted genes, of which 4 candidate genes were from the large contribution QTLs and other 32 candidate genes were from the small contribution QTLs. These candidate genes were included in different biological processes, of which 13 candidate genes were grouped in seed development directly, and the remaining candidate genes were grouped into different functions, such as transport, transcriptional regulators, etc., indicating that these genes from different biological pathways regulate the expression of 100-seed weight trait in NJRIKY together. 【】Among the three different mapping procedures, RTM-GWAS procedure is the most powerful one which can provide a relatively thorough detection of 100-seed weight QTLs in NJRIKY population, therefore, it is more suitable for QTL mapping in bi-parental population such as RIL population. The candidate genes with various functions jointly regulated the complex expression of 100-seed weight trait.

soybean [(L.) Merr.]; 100-seed weight; QTL (quantitative trait locus); recombinant inbred lines population; restricted two-stage multi-locus genome-wide association analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.004

2019-08-24；

2020-01-02

國家自然科學(xué)基金（31701447）、國家作物育種重點研發(fā)計劃（2017YFD0101500，2017YFD0102002）、長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（PCSIRT_17R55）、教育部111項目（B08025）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目（KYT201801）、農(nóng)業(yè)部國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系CARS-04、江蘇省優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程專項、江蘇省JCIC-MCP項目

潘麗媛，E-mail：panly89@126.com。通信作者賀建波，E-mail：hjbxyz@gmail.com。通信作者蓋鈞鎰，E-mail：sri@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）