李曙光，曹永策，賀建波，王吳彬，邢光南，楊加銀，趙團結(jié)，蓋鈞鎰

大豆巢式關(guān)聯(lián)作圖群體蛋白質(zhì)含量的遺傳解析

李曙光1,2，曹永策1，賀建波1，王吳彬1，邢光南1，楊加銀2，趙團結(jié)1，蓋鈞鎰1

（1南京農(nóng)業(yè)大學大豆研究所/國家大豆改良中心/農(nóng)業(yè)部大豆生物學與遺傳育種重點實驗室/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095；2江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇淮安 223001）

【】大豆是重要的經(jīng)濟作物，是人類植物蛋白質(zhì)和油脂的主要來源。蛋白質(zhì)含量作為大豆育種的主要目標之一，屬于多基因控制的復雜數(shù)量性狀，并且受環(huán)境條件的影響。通過對大豆巢式關(guān)聯(lián)作圖群體的蛋白質(zhì)含量進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，解析其遺傳構(gòu)成，為高蛋白質(zhì)含量的大豆品種育種提供理論基礎(chǔ)。以蒙8206為共同親本，對臨河×蒙8206、正陽×蒙8206、蒙8206×通山與蒙8206×WSB分別雜交，通過單粒傳法自交7代衍生的4個重組自交系群體，共計623個家系，整合為一個大豆巢式關(guān)聯(lián)作圖群體，利用RAD-seq技術(shù)進行SNP標記基因分型，并于2012年至2014年將該群體種植在5個不同田間環(huán)境，在大豆完熟期R8時測定蛋白質(zhì)含量，利用限制性兩階段多位點全基因組關(guān)聯(lián)分析方法（RTM-GWAS）來解析蛋白質(zhì)含量的遺傳構(gòu)成。試驗群體的蛋白質(zhì)含量變異較大，蛋白質(zhì)含量性狀遺傳率較高，遺傳變異可解釋85.00%的表型變異。多環(huán)境聯(lián)合方差分析表明，蛋白質(zhì)含量的基因型、環(huán)境以及基因型×環(huán)境均達到差異極顯著水平。全基因組關(guān)聯(lián)分析共檢測到90個蛋白質(zhì)含量QTL，其中新檢測到20個QTL，每個QTL的表型變異解釋率為0.06%—3.99%，貢獻率總和為45.60%。每個QTL包含2—5個等位變異，等位變異效應(yīng)為-2.434%—2.845%，大多數(shù)等位變異效應(yīng)為-1.000%—1.000%，表明大多數(shù)等位變異的效應(yīng)較小。根據(jù)檢測的90個蛋白質(zhì)含量QTL，預測了73個蛋白質(zhì)含量相關(guān)基因，其中參與甘氨酸與芳香族氨基酸代謝，參與半胱氨酸生物合成，推測其為重要蛋白質(zhì)含量候選基因。根據(jù)試驗群體的蛋白質(zhì)含量QTL-allele矩陣，預測出潛在雜交組合的純系后代的蛋白質(zhì)含量育種潛力高達56.5%。檢測到90個大豆蛋白質(zhì)含量QTL，新檢測到20個QTL，預測到73個蛋白質(zhì)含量相關(guān)基因，表明大豆蛋白質(zhì)含量是由多基因控制的數(shù)量性狀。

大豆；巢式關(guān)聯(lián)作圖群體；蛋白質(zhì)含量；限制性兩階段多位點全基因組關(guān)聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】大豆（(L.) Merr.）是世界上重要的經(jīng)濟作物，是植物蛋白質(zhì)和油脂的主要來源之一，提高大豆蛋白質(zhì)含量是大豆重要的育種目標。解析大豆蛋白質(zhì)含量的遺傳構(gòu)成對大豆分子設(shè)計育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，大豆蛋白質(zhì)含量是典型的數(shù)量遺傳性狀，由多基因控制，并且容易受環(huán)境條件的影響[1-2]。近年來，隨著基因組測序技術(shù)和遺傳統(tǒng)計方法的迅速發(fā)展，前人分別利用雙親本衍生分離群體和自然群體，對大豆蛋白質(zhì)含量的遺傳構(gòu)成進行了大量研究。根據(jù)大豆SoyBase數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻，迄今為止，至少有248個大豆蛋白質(zhì)含量QTL（quantitative trait loci）已被報道，分布在大豆的20條染色體上[2]。基于連鎖定位方法，Karikari等[3]利用Linhefenqingdou×Meng8206衍生的重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體檢測到一個位于第7染色體上的多環(huán)境下穩(wěn)定表達的大豆蛋白質(zhì)含量QTL（），可以解釋13.59%—26.22%的表型變異；Zhang等[4]利用Huapidou（ZDD09982）×Qihuang26（ZDD23189）衍生RIL群體，在大豆第1、10和15染色體上檢測到3個表型變異解釋率14.00%以上的蛋白質(zhì)含量QTL?；陉P(guān)聯(lián)分析方法，Li等[5]以185份來自國內(nèi)外的大豆種質(zhì)為材料，采用MLM（mixed linear model）方法，在第1、13和20染色體上檢測到3個遺傳貢獻率13.00%以上的穩(wěn)定表達的QTL；Wang等[6]利用235份國內(nèi)外收集的大豆品種，以FarmCPU（fixed and random model circulating probability unification）方法，檢測到12個多環(huán)境下穩(wěn)定表達的與蛋白質(zhì)含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP。另一方面，以雙親本衍生分離群體為材料進行QTL定位，不能檢測雙親本間不具多態(tài)性的關(guān)鍵基因位點[7-8]；以自然群體為材料進行關(guān)聯(lián)分析，個體親緣關(guān)系導致的群體結(jié)構(gòu)可能會導致關(guān)聯(lián)分析的假陽性[9]；相比之下巢式關(guān)聯(lián)作圖（nested association mapping，NAM）群體利用了多親本之間更多的遺傳差異，能夠相對較好地控制群體結(jié)構(gòu)。因此，NAM群體結(jié)合了連鎖定位中QTL檢測高功效與關(guān)聯(lián)分析中高作圖精度的優(yōu)點，成為解析復雜性狀解剖的很有發(fā)展前景的多親本遺傳設(shè)計[8,10]。在前期研究中，筆者構(gòu)建了包含4個RIL群體的大豆NAM群體，并提出了全面解析NAM群體數(shù)量性狀遺傳構(gòu)成的優(yōu)化方法[11]?！颈狙芯壳腥朦c】由于大豆蛋白質(zhì)含量是典型的復雜數(shù)量遺傳性狀，人們對其遺傳構(gòu)成還有待進一步深入了解。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以大豆NAM群體為研究對象，利用RAD-seq進行基因分型并在5個環(huán)境下進行田間試驗，采用前期研究鑒定的適合于NAM群體的最佳QTL定位方法，來解析大豆NAM群體的蛋白質(zhì)含量的遺傳結(jié)構(gòu)以及推測相關(guān)候選基因，并從中探索構(gòu)建該群體的5個親本的重組潛力，為高蛋白質(zhì)含量的大豆品種育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以蒙8206（M8206）為共同親本，臨河×蒙8206（Linhe×M8206，LM，104 RILs）、正陽×蒙8206（Zhengyang×M8206，ZM，126 RILs）、蒙8206×通山（M8206×Tongshan，MT，289 RILs）、蒙8206×WSB（M8206×WSB，MW，104 RILs）分別得到F1代，通過單籽傳法自交7代獲得4個RIL群體，共計623個家系，整合為一個NAM群體。本研究NAM群體由南京農(nóng)業(yè)大學國家大豆改良中心創(chuàng)制和保存。

1.2 田間試驗設(shè)計

NAM群體及親本分別于2012年、2013年和2014年在南京農(nóng)業(yè)大學國家大豆改良中心江浦試驗站（江浦，簡稱JP2012、JP2013和JP2014），屬于北亞熱帶季風性濕潤氣候，雨量充沛、日照充足，無霜期230 d，年均氣溫15.3℃，降水量1 102.2 mm，年日照2 165.2 h；2012年在安徽科技學院鳳陽試驗田（鳳陽，簡稱FY2012），屬于北亞熱帶向溫帶漸變氣候，氣候溫和，光照充足，無霜期212 d，年均氣溫14.9℃，年降雨量904.4 mm，年日照2 248.7 h；2014年在江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所（鹽城，簡稱YC2014），屬于亞熱帶與暖濕帶的過渡地帶氣候，氣溫適中，雨量充沛，無霜期213 d，年平均氣溫14.1℃，常年降水量1 042.2 mm，年日照2 238.9 h；共計5個環(huán)境進行田間試驗。每公頃施用三元復合肥（N-P2O5-K2O）225 kg，其中N 15%、P2O515%、K2O 15%，總養(yǎng)分含量≥45%。采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復，單行區(qū)，行長1 m，行距0.5 m，株距10 cm，常規(guī)田間管理。

1.3 蛋白質(zhì)含量測定及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

大豆自然成熟（完熟期R8）時，每個小區(qū)植株收獲后脫粒，通風晾干并在35—40℃烘干至恒重，選取籽粒大小一致、飽滿的種子，采用FOSS公司生產(chǎn)的近紅外谷物分析儀InfratecTM 1241 NIR Grain Analyzer（Sweden）測定大豆種子蛋白質(zhì)含量，樣品測定為近紅外透射技術(shù)，波長范圍570—1 100 nm，完全整粒無損分析，無需磨粉，儀器內(nèi)置大豆模型，直接顯示蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果。分別對NAM群體在每個環(huán)境下的3次重復進行蛋白質(zhì)含量檢測。

1.4 SNP基因型分析與SNPLDB標記構(gòu)建

NAM群體的SNP基因型與SNPLDB標記來源于Li等[11]文獻。利用Restriction-site associated DNA sequencing（RAD-seq）技術(shù)對NAM群體進行SNP標記基因分型。由于一個SNP標記位點只有2種等位變異，又稱為雙等位變異標記，SNP不適合NAM群體中存在復等位變異的基本特征。因此，本研究把位于一個連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）區(qū)段內(nèi)緊密連鎖的多個SNP，作為該基因組區(qū)域的一段序列，劃分為一個SNP連鎖不平衡區(qū)塊（SNP linkage disequilibrium block，SNPLDB），簡稱為SNPLDB標記。并且用NAM群體的親本單倍型作為其等位變異，增加每個標記位點的單倍型/等位變異的數(shù)量，來匹配NAM群體的復等位變異特征?；谝陨戏治?，NAM群體共鑒定了55 936個SNP和6 137個SNPLDB標記。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用賀建波等[12-13]提出的限制性兩階段多位點全基因組關(guān)聯(lián)分析方法（restricted two-stage multi-locus genome-wide association analysis，RTM-GWAS），基因型數(shù)據(jù)為NAM群體的6 137 SNPLDB標記，表型數(shù)據(jù)為5個環(huán)境下蛋白質(zhì)含量的小區(qū)觀測值（含每個環(huán)境下的3次重復數(shù)據(jù)）。RTM-GWAS方法分兩階段進行：第一階段，基于簡單線性模型進行單位點關(guān)聯(lián)檢驗，對SNPLDB標記進行初步篩選，使用常規(guī)顯著水平0.05作為篩選閾值；第二階段，對第一階段篩選到的顯著位點，利用多位點模型分析進行QTL檢測，并估計等位變異效應(yīng)，顯著水平設(shè)為0.01。在這兩個階段中，將基于SNPLDB標記的個體間遺傳相似系數(shù)矩陣的前10個特征向量作為協(xié)變量進行群體結(jié)構(gòu)控制。

根據(jù)McCouch等[14]提出的QTL命名法，以“q”+性狀名稱+染色體編號+QTL序號，用斜體表示。如，表示QTL，表示大豆種子蛋白質(zhì)含量，表示該QTL定位在第6染色體上，表示該染色體上第1個蛋白質(zhì)含量QTL。

1.6 候選基因預測

根據(jù)檢測到的蛋白質(zhì)含量QTL，推斷其候選基因體系。首先，利用大豆基因組數(shù)據(jù)庫SoyBase（http://soybase.org），檢索關(guān)聯(lián)SNPLDB標記（±100 kb）物理范圍內(nèi)的注釋基因；然后在這些基因中，鑒定出NAM群體中該物理區(qū)間內(nèi)SNP所在的基因；最后，使用卡平方（c2）獨立性測驗（test for independence），顯著性水平設(shè)置為0.05，檢驗SNPLDB標記（復等位變異）和注釋基因中SNP（雙等位變異）之間是否顯著相關(guān)。當這二者存在顯著相關(guān)時，則該SNP所在的注釋基因被認為是候選基因。大豆參考基因組Williams 82（Glyma.Wm82.a1.v1.1）[15]用于基因功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)含量表型數(shù)據(jù)分析

NAM群體的蛋白質(zhì)含量變異較大，在5個環(huán)境下平均值的變異幅度為36.6%—46.0%，在5個單環(huán)境之間的變異幅度為31.5%—47.8%。NAM群體的共同親本（M8206）的蛋白質(zhì)含量為36.3%，低于其他4個親本（臨河、正陽、通山和WSB），這4個親本的蛋白質(zhì)含量分別為47.8%、44.7%、45.1%和42.9%。蛋白質(zhì)含量廣義遺傳率較高，即遺傳變異可以解釋85.00%的蛋白質(zhì)含量表型變異（表1）。多環(huán)境聯(lián)合方差分析結(jié)果表明，蛋白質(zhì)含量在NAM群體中不同基因型之間存在顯著差異，同時環(huán)境、重復之間、基因型×環(huán)境互作也達到了差異極顯著水平（＜0.01），表示蛋白質(zhì)含量受到外在環(huán)境條件影響較大，但是基因型間均方遠大于基因型×環(huán)境互作的均方（表2）。

表1 大豆NAM群體中蛋白質(zhì)含量（%）的次數(shù)分布和描述性統(tǒng)計

a：試驗環(huán)境。平均值是5個環(huán)境FY2012、JP2012、JP2013、JP2014和YC2014蛋白質(zhì)含量的平均值。b：變異系數(shù)

a: environment. Mean is the average over five environments FY2012, JP2012, JP2013, JP2014 and YC2014.b: Coefficient of variation

表2 大豆NAM群體中蛋白質(zhì)含量的多環(huán)境聯(lián)合方差分析

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用RTM-GWAS方法解析NAM群體中蛋白質(zhì)含量的遺傳構(gòu)成，共檢測到90個蛋白質(zhì)含量QTL，分布在大豆20條染色體上，每條染色體上具有1個（第9、12和17染色體）至12個（第6染色體）QTL，單個QTL的表型變異解釋率為0.06%—3.99%，共解釋45.6%表型變異（圖1和表3）。其中，、、、、、、、、和等10個蛋白質(zhì)含量QTL的表型變異解釋率分別為3.99%、2.46%、2.42%、1.85%、1.74%、1.71%、1.64%、1.45%、1.30%和1.02%，貢獻均超過1.00%的表型變異，為大貢獻QTL（large-contribution QTL），共解釋19.60%的表型變異；其余80個小貢獻QTL（small-contribution QTL），共解釋26.00%的表型變異。

水平虛線為0.01顯著性水平，-lgP范圍介于2.0—89.2，大于10的值以8—11的值顯示

表3 大豆NAM群體中檢測到的蛋白質(zhì)含量QTL

表型貢獻大于1.0%和小于1.0%的QTL，分別稱為大貢獻（LC）QTL和小貢獻（SC）QTL。2：每個QTL位點的遺傳貢獻率。a：Soybase報道的相對一致的蛋白質(zhì)含量（seed protein content） QTL。67(119)表示本研究檢測到的67個QTL與Soybase中119個QTL相鄰近。b：GWAS QTL 指文獻報道的關(guān)聯(lián)分析QTL；33(45)表示本研究檢測到的33個QTL與以前報道的關(guān)聯(lián)分析文獻中的45個QTL相一致

Those with phenotypic contribution more than 1.0% and less than 1.0% are called roughly as large-contribution (LC) QTL and small-contribution (SC) QTL, respectively.2: genetic contribution of a QTL.a: SoyBase QTL means the loci are relatively consistent with the seed protein content QTL found in SoyBase; 67 (119) indicates that 67 QTLs detected in this study were located in or around 119 QTLs by linkage mapping in SoyBase.b: GWAS QTL means the QTLs detected in previous GWAS literature; 33 (45) indicates that 33 QTLs detected in this study were consistent with 45 QTLs reported in previous GWAS literature

根據(jù)多環(huán)境聯(lián)合方差分析，遺傳變異解釋的蛋白質(zhì)含量表型變異，即性狀遺傳率為85.00%。本研究檢測到的90個蛋白質(zhì)含量QTL表型變異貢獻率為45.60%，推測剩余的39.40%的遺傳變異的來源于未定位到的微效QTL，QTL×環(huán)境互作與試驗誤差解釋15.00%蛋白質(zhì)含量表型變異。

2.3 蛋白質(zhì)含量QTL-等位變異矩陣

NAM群體檢測到的90個蛋白質(zhì)含量QTL中，每個QTL包含2—5個等位變異，共鑒定了303個等位變異效應(yīng)，其中增效等位變異156個，減效等位變異147個，增效等位變異的效應(yīng)值為0.007%—2.845%，減效等位變異的效應(yīng)值為-0.012%—-2.434%，90.8%的等位變異效應(yīng)值為-1.000%—1.000%，表明大多數(shù)等位變異的效應(yīng)值較小，具有極高或極低表型效應(yīng)的等位變異較為少見（圖2）。

NAM群體的623個家系中90個QTL的303個等位變異效應(yīng)，組成了一個蛋白質(zhì)含量QTL-等位變異矩陣（QTL-allele matrix），全面顯示了該群體蛋白質(zhì)含量的遺傳構(gòu)成信息。圖2為NAM群體的蛋白質(zhì)含量QTL-allele矩陣圖，每個QTL的等位變異效應(yīng)以顏色的深淺表示。從蛋白質(zhì)含量QTL-allele矩陣圖中可以看到，不存在等位變異效應(yīng)完全是減效或增效的NAM家系。蛋白質(zhì)含量高低的差異在于不同家系中的減效或增效等位變異的構(gòu)成比例，高蛋白質(zhì)含量值家系比低值家系具有更多的增效等位變異。此外，高蛋白質(zhì)含量家系存在一定數(shù)量的減效等位變異，而低蛋白質(zhì)含量家系也存在某些增效等位變異，表明蛋白質(zhì)含量改良存在很高的重組潛力，并且在育種利用中低蛋白質(zhì)含量家系的優(yōu)異變異不應(yīng)被忽略。

2.4 NAM群體5個親本的蛋白質(zhì)含量育種潛力

利用NAM群體的蛋白質(zhì)含量QTL-allele矩陣來預測5個親本（臨河、正陽、通山、WSB和蒙8206）的蛋白質(zhì)含量的育種潛力。表4為NAM群體的5個親本之間潛在的10個雜交組合的蛋白質(zhì)含量預測結(jié)果。根據(jù)RTM-GWAS法檢測到的5個親本的蛋白質(zhì)含量QTL-等位變異效應(yīng)值，計算潛在雜交組合F2單籽傳衍生的10 000個純系后代蛋白質(zhì)含量預測值。分別以5%分位數(shù)和95%分位數(shù)作為預測組合純合基因型后代的低值和高值。

橫軸表示以蛋白質(zhì)含量（%）升序排列的種質(zhì)材料，縱軸表示以增效等位變異頻率升序排列的QTL。每行表示一個QTL在不同材料中的等位基因分布，而每列表示一份材料在所有QTL上的等位基因構(gòu)成。等位基因效應(yīng)以顏色表示，等位變異效應(yīng)以顏色表示，即具有暖色的格子代表增效等位變異，而具有冷色的格子代表減效等位變異，顏色的深淺代表等位變異效應(yīng)的大小

表4 大豆NAM群體5個親本之間潛在雜交組合后代的蛋白質(zhì)含量預測值

Table 4 The predicted protein content value of progenies derived from the possible crosses among the five parental lines in the soybean NAM population

Y1和Y2分別為2個親本的表型觀測值；P5和P95分別表示第5和第95個百分位數(shù)

Y1 and Y2 represent the observed phenotypic values of the two parents; P5 and P95 represent the 5th and 95th percentile

在連鎖模型預測下，構(gòu)成大豆NAM群體的4個RIL群體對應(yīng)的4個雜交組合，臨河×蒙8206、正陽×蒙8206、蒙8206×通山和蒙8206×WSB組合在5%—95%百分位數(shù)（預測5%范圍）的蛋白質(zhì)含量預測值分別是37.8%—46.3%、37.1%—43.9%、37.5%—43.9%和36.4%—42.7%，而這4個RIL群體的實際表型觀測值范圍是38.4%—46.0%、36.7%—44.4%、36.7%—45.4%和37.1%—43.2%，表明如不打破連鎖，現(xiàn)實的變異潛力與預測的變異潛力相差不大。

如果在獨立模型下發(fā)生進一步遺傳重組，基因組將會發(fā)生更大的潛在分離重組。5個親本之間的10個潛在雜交組合后代的5%—95%百分位數(shù)范圍，在連鎖模型下預測值為36.4%—50.9%，在獨立模型下為33.1%—56.5%，比個別雜交組合變異更加廣泛。因此，RTM-GWAS構(gòu)建的QTL等位基因矩陣，提供了一個親本材料基因分型與預測親本之間遺傳潛力的方法。

2.5 蛋白質(zhì)含量相關(guān)候選基因體系

根據(jù)NAM群體中檢測的90個蛋白質(zhì)含量QTL，推斷73個蛋白質(zhì)含量相關(guān)候選基因，共解釋39.90%的表型變異。根據(jù)候選基因的功能注釋，這些候選基因歸為6類生物學過程，包括蛋白質(zhì)代謝、DNA代謝、信號轉(zhuǎn)導、代謝過程、胚發(fā)育和未知過程等（圖3）。

第Ⅰ組，具有27個氨基酸和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)候選基因，解釋18.70%表型變異，包括參與甘氨酸與芳香族氨基酸代謝（）、半胱氨酸生物合成（）、氨基酸生物合成和分解代謝（、、和）、蛋白磷酸化（、、等）、依賴泛素的蛋白質(zhì)分解代謝（、）、蛋白水解（、、）的基因。

第Ⅱ組，具有17個DNA代謝相關(guān)候選基因，解釋8.80%表型變異，包括參與依賴DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（、、等）、DNA甲基化（）的基因。

第Ⅲ組，具有13個信號轉(zhuǎn)導與運輸過程相關(guān)候選基因，解釋6.80%表型變異，包括參與生長素和油菜素內(nèi)酯刺激的響應(yīng)（）、信號轉(zhuǎn)導（和）、氨基酸運輸（）、高爾基體囊泡介導的運輸（和）、跨膜運輸（）的基因。

第Ⅳ組，具有5個代謝過程相關(guān)候選基因，解釋1.70%表型變異，包括參與碳水化合物代謝（）的基因。

Ⅰ—Ⅵ：蛋白質(zhì)含量候選基因的6類生物學過程

第Ⅴ組，具有2個胚發(fā)育相關(guān)候選基因，解釋1.10%表型變異，包括參與減數(shù)分裂（）、種子休眠之前胚發(fā)育（）的基因。

第Ⅵ組，具有9個蛋白質(zhì)含量性狀間接相關(guān)的未知過程候選基因，解釋2.80%表型變異，包括、、等基因。

3 討論

3.1 大豆蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)數(shù)量遺傳特點

大豆蛋白質(zhì)含量屬于復雜數(shù)量遺傳性狀，由若干遺傳效應(yīng)大小不一的基因控制，并且受到環(huán)境條件的影響[1,5]。本研究NAM群體蛋白質(zhì)含量的變異幅度為36.6%—46.0%，表現(xiàn)近似正態(tài)連續(xù)分布的數(shù)量遺傳特點。根據(jù)前人數(shù)量性狀單基因與多基因遺傳模型，蓋鈞鎰等[31]提出了植物數(shù)量性狀的泛主基因＋多基因混合遺傳模型，數(shù)量性狀可能由多個基因控制，遺傳效應(yīng)大小不等且容易受環(huán)境影響；在一般試驗條件下可以檢測到、效應(yīng)較大的基因作為主效基因，而在現(xiàn)有試驗條件下不能單獨檢測到、效應(yīng)相對非常小的基因作為微效基因或多基因；主效與微效基因之間的區(qū)別是相對的，取決于試驗誤差或精度，在一種環(huán)境中某一基因可能作為主效基因，而在另一環(huán)境中受誤差干擾表現(xiàn)為微效基因。因此，數(shù)量性狀由主基因與多基因共同控制是數(shù)量性狀遺傳的基本模型，而純主基因或純多基因的遺傳模型只是其個別特例。Zhang等[20]利用多位點復等位變異關(guān)聯(lián)分析方法RTM- GWAS來解析中國大豆地方品種群體蛋白質(zhì)含量的QTL-allele體系，檢測到89個蛋白質(zhì)含量QTL，遺傳貢獻率為0.04%—11.30%，本研究利用相同方法來解析大豆NAM群體的蛋白質(zhì)含量的遺傳構(gòu)成，檢測到90個蛋白質(zhì)含量QTL，遺傳貢獻從0.06%—3.99%，該結(jié)果很好地驗證了蓋鈞鎰等[31]提出的泛主基因＋多基因數(shù)量性狀混合遺傳模型假說，更進一步表明大豆蛋白質(zhì)含量是一個典型的數(shù)量遺傳性狀。

3.2 本研究檢測到蛋白質(zhì)含量QTL與文獻報道QTL比較

大豆蛋白質(zhì)含量是許多微效基因控制的復雜數(shù)量性狀，同時也受環(huán)境條件的影響[2,5]?；陔p親分離群體的連鎖定位和自然群體的關(guān)聯(lián)分析方法，以前的研究已經(jīng)報道了許多大豆蛋白質(zhì)含量QTL。目前在大豆基因組數(shù)據(jù)庫SoyBase中公布了248個基于連鎖定位的蛋白質(zhì)含量QTL，其中一些QTL在不同群體中在相同或非常相近的染色體位置被檢測到了3次或更多次，表明這些QTL是非?？尚诺模欢@些已知的QTL在應(yīng)用到標記輔助育種工作之前需要進一步驗證。因此，本研究根據(jù)相關(guān)標記的參考基因組的物理區(qū)域（Glyma.Wm82.a1.v1.1）對本研究檢測到的蛋白質(zhì)含量QTL與前人報道的QTL進行比較。

本研究檢測到了90個蛋白質(zhì)含量QTL，分布在所有20條染色體上，其中67個QTL位于或接近SoyBase中已經(jīng)報道的119個QTL區(qū)間，33個QTL與以前報道的關(guān)聯(lián)分析文獻中的45個QTL相一致，其余20個QTL是本研究中新檢測到的。在NAM群體中檢測到的90個蛋白質(zhì)含量QTL中，具有最大的遺傳貢獻率3.99%，前人通過連鎖定位方法檢測到的4個蛋白質(zhì)含量QTL位于該QTL區(qū)域附近，包括Seed protein 30-5[32]，cqSeed protein-005、cqSeed protein-007和cqSeed protein-015[33]；前人通過關(guān)聯(lián)分析方法檢測到的2個QTL與該QTL相一致，包括Gm06_5660542[16]與Gm06_6067567[17]。并且，還有6個大貢獻QTL同時與前人連鎖定位與關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)的多個QTL相一致，如（貢獻率2.46%）與Seed protein 33-5[34]和Gm07_7058915[18]的定位區(qū)域相臨近；（貢獻率1.85%）與Seed protein 2-2[35]、Seed protein 36-31[36]和Gm19_46335384[19]的定位區(qū)域相鄰近；（貢獻率1.74%）與Seed protein 34-2[37]和Gm06_12914255[20]的定位區(qū)域相鄰近；（貢獻率1.71%）與Seed protein 21-4[38]和Gm02_7987834[20]的定位區(qū)域相鄰近；（貢獻率1.45%）與Seed protein 26-12[39]、Seed protein 28-5[40]、Seed protein 36-25[36]和Gm18_2064407[21]的定位區(qū)域相鄰近；（貢獻率1.02%）與Seed protein 1-6[41]、Seed protein 4-10[42]、Seed protein 45-1[43]和Gm14_7160557[21]的定位區(qū)域相鄰近。在本研究新檢測的20個QTL中，（2.42%）和（1.30%）是大豆蛋白質(zhì)含量的大貢獻QTL。

3.3 NAM群體5個親本的超親分離潛力

本研究預測了NAM群體5個親本（臨河、正陽、通山、WSB和蒙8206）之間潛在的10個雜交組合的純系后代的蛋白質(zhì)含量，其預測值為33.1%—56.5%，表現(xiàn)出明顯的雙向超親分離潛力。Zhang等[20]預測了中國大豆地方品種群體潛在雜交組合的純系后代的蛋白質(zhì)含量的育種潛力，其分離范圍是39.86%—55.71%。預測優(yōu)異雜交組合是分子設(shè)計育種的前提，但是需要作物育種實踐來證明。Zhang等[44]報道了利用QTL-allele設(shè)計親本組配以及后代選擇創(chuàng)造大豆高蛋白質(zhì)含量材料，從2個RIL群體中選擇了具有超親蛋白質(zhì)含量表型的2個家系XG30（45.53%）和WT133（48.39%），并對3個已定位到的大效應(yīng)加性QTL進行標記分型，WT133×XG30雜交后代表現(xiàn)出較大的超親分離，選育出蛋白質(zhì)含量高達54.15%的品系材料，由此證明了QTL-allele矩陣在數(shù)量性狀的超親分離中的應(yīng)用價值。此外，NAM群體蛋白質(zhì)含量的QTL-allele中，蛋白質(zhì)含量等位變異效應(yīng)值從-2.434%—2.845%不等，但是絕大多數(shù)等位變異效應(yīng)比較集中在-1.000%—1.000%，具有極高或低表型效應(yīng)的等位變異較為少見，具有極端值的稀有等位變異對于選育高蛋白質(zhì)大豆材料存在積極意義。

4 結(jié)論

共檢測到90個蛋白質(zhì)含量QTL，其中新檢測到20個QTL，貢獻率總和為45.60%，預測了73個蛋白質(zhì)含量相關(guān)基因。根據(jù)NAM群體的蛋白質(zhì)含量QTL-allele矩陣，預測出潛在雜交組合的純系后代的蛋白質(zhì)含量為33.1%—56.5%。

[1] Hwang E Y, Song Q, Jia G, Specht J E, Hyten D L, Costa J, Cregan P B. A genome-wide association study of seed protein and oil content in soybean., 2014, 15(1): 1-12.

[2] Patil G, Mian R, Vuong T, Pantalone V, Song Q j, Chen P y, Shannon G J, Carter T C, Nguyen H T. Molecular mapping and genomics of soybean seed protein: a review and perspective for the future., 2017, 130(10): 1975-1991.

[3] Karikari B, Li S g, Bhat J A, Cao Y c, Kong J j, Yang J y, Gai J y, Zhao T j. Genome-wide detection of major and epistatic effect QTLs for seed protein and oil content in soybean under multiple environments using high-density bin map., 2019, 20(4): 979.

[4] Zhang Y, Li W, Lin Y, Zhang L, Wang C, Xu R. Construction of a high-density genetic map and mapping of QTLs for soybean () agronomic and seed quality traits by specific length amplified fragment sequencing., 2018, 19(1): 641.

[5] Li D m, Zhao X, Han Y p, Li W b, Xie F t. Genome-wide association mapping for seed protein and oil contents using a large panel of soybean accessions., 2019, 111(1): 90-95.

[6] Wang Y Y, Li Y Q, Wu H Y, Hu B, Zheng J J, Zhai H, Lü S X, Liu X L, Chen X, Qiu H M, Yang J, Zong C M, Han D Z, Wen Z X, Wang D C, Xia Z J. Genotyping of soybean cultivars with medium-density array reveals the population structure and QTNs underlying maturity and seed traits., 2018, 9: 610.

[7] 王建康, 李慧慧, 張學才, 尹長斌, 黎裕, 馬有志, 李新海, 邱麗娟, 萬建民. 中國作物分子設(shè)計育種. 作物學報, 2011, 37(2): 191-201.

WANG J K, LI H H, ZHANG X C, YIN C B, LI Y, MA Y Z, LI X H, QIU L J, WAN J M. Molecular design breeding in crops in China., 2011, 37(2): 191-201. (in Chinese)

[8] Li H, Bradbury P, Ersoz E, Buckler E S, Wang J. Joint QTL linkage mapping for multiple-cross mating design sharing one common parent., 2011, 6(3): e17573.

[9] Cardon L R, Palmer L J. Population stratification and spurious allelic association., 2003, 361(9357): 598-604.

[10] Buckler E S, Holland J B, Bradbury P J, Acharya C B, Brown P J, Browne C, Ersoz E, Flint-Garcia S, Garcia A, Glaubitz J C, Goodman M M, Harjes C, Guill K, Kroon D E, Larsson S, Lepak N K, Li H, Mitchell S E, Pressoir G, Peiffer J A, Rosas M O, Rocheford T R, Romay M C, Romero S, Salvo S, Sanchez V H, Da S H S, Sun Q, Tian F, Upadyayula N, Ware D, Yates H, Yu J, Zhang Z, Kresovich S, Mcmullen M D. The genetic architecture of maize flowering time., 2009, 325(5941): 714-718.

[11] Li S, Cao Y, He J, Zhao T, Gai J. Detecting the QTL-allele system conferring flowering date in a nested association mapping population of soybean using a novel procedure., 2017, 130(11): 2297-2314.

[12] He J, Meng S, Zhao T, Xing G, Yang S, Li Y, Guan R, Lu J, Wang Y, Xia Q, Yang B, Gai J. An innovative procedure of genome-wide association analysis fits studies on germplasm population and plant breeding., 2017, 130(11): 2327-2343.

[13] 賀建波, 劉方東, 邢光南, 王吳彬, 趙團結(jié), 管榮展, 蓋鈞鎰. 限制性兩階段多位點全基因組關(guān)聯(lián)分析方法的特點與計算程序. 作物學報, 2018, 44(9): 1274-1289.

HE J B, LIU F D, XING G N, WANG W B, ZHAO T J, GUAN R Z, GAI J Y. Characterization and analytical programs of the restricted two-stage multi- locus genome-wide association analysis., 2018, 44(9): 1274-1289. (in Chinese)

[14] Mccouch S, Cho Y, Yano M, Paul E, Blinstrub M, Morishima H, Kinoshita T. Report on QTL nomenclature., 1997, 14: 11-13.

[15] Schmutz J, Cannon S B, Schlueter J, Ma J, Mitros T, Nelson W, Hyten D L, Song Q, Thelen J J, Cheng J, Xu D, Hellsten U, May G D, Yu Y, Sakurai T, Umezawa T, Bhattacharyya M K, Sandhu D, Valliyodan B, Lindquist E, Peto M, Grant D, Shu S, Goodstein D, Barry K, Futrell-Griggs M, Abernathy B, Du J, Tian Z, Zhu L, Gill N, Joshi T, Libault M, Sethuraman A, Zhang X C, Shinozaki K, Nguyen H T, Wing R A, Cregan P, Specht J, Grimwood J, Rokhsar D, Stacey G, Shoemaker R C, Jackson S A. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean., 2010, 463(7278): 178-183.

[16] Bandillo N, Jarquin D, Song Q J, Nelson R, Cregan P, Specht J, Lorenz A. A population structure and genome-wide association analysis on the USDA soybean germplasm collection., 2015, 8(3):1-13.

[17] Liu Z X, Li H H, Fan X H, Huang W, Yang J Y, Wen Z X, Li Y H, Guan R X, Guo Y, Chang R Z, Wang D C, Chen P Y, Wang S M, Qiu L J. Phenotypic characterization and genetic dissection of nine agronomic traits inand its derived cultivars in soybean ((L.) Merr.)., 2017, 256: 72-86.

[18] Wen Z, Boyse J F, Song Q, Cregan P B, Wang D. Genomic consequences of selection and genome-wide association mapping in soybean., 2015, 16: 671.

[19] Han Y, Zhao X, Liu D, Li Y, Lightfoot D A, Yang Z, Zhao L, Zhou G, Wang Z, Huang L, Zhang Z, Qiu L, Zheng H, Li W. Domestication footprints anchor genomic regions of agronomic importance in soybeans., 2016, 209(2): 871-884.

[20] Dias D A, Polo L R T, Lazzari F, Silva G J D, Schuster I. Genome-wide association for mapping QTLs linked to protein and oil contents in soybean., 2017, 52(10): 896-904.

[21] Zhang K, Liu S, Li W, Liu S, Li X, Fang Y, Zhang J, Wang Y, Xu S, Zhang J, Song J, Qi Z, Tian X, Tian Z, Li W X, Ning H. Identification of QTNs controlling seed protein content in soybean using multi-locus genome-wide association studies., 2018, 9: 1690.

[22] Fang C, Ma Y m, Wu S W, Liu Z, Wang Z, Yang R, Hu G H, Zhou Z K, Yu H, Zhang M, Pan Y, Zhou G A, Ren H X, Du W G, Yan H R, Wang Y P, Han D Z, Shen Y T, Liu S L, Liu T F, Zhang J X, Qin H, Yuan J, Yuan X H, Kong F J, Liu B H, Li J Y, Zhang Z W, Wang G D, Zhu B G, Tian Z X. Genome-wide association studies dissect the genetic networks underlying agronomical traits in soybean., 2017, 18(1): 161.

[23] Zhang Y H, He J b, Meng S, Liu M F, Xing G N, Li Y, Yang S P, Yang J Y, Zhao T J, Gai J Y. Identifying QTL–allele system of seed protein content in Chinese soybean landraces for population differentiation studies and optimal cross predictions., 2018, 214(9): 157.

[24] Li Y H, Reif J C, Hong H L, Li H H, Liu Z X, Ma Y S, Li J, Tian Y, Li Y F, Li W B, Qiu L J. Genome-wide association mapping of QTL underlying seed oil and protein contents of a diverse panel of soybean accessions., 2018, 266: 95-101.

[25] Sonah H, O'donoughue L, Cober E, Rajcan I, Belzile F. Identification of loci governing eight agronomic traits using a GBS-GWAS approach and validation by QTL mapping in soya bean., 2015, 13(2): 211-221.

[26] Liu Z, Li H, Wen Z, Fan X, Li Y, Guan R, Guo Y, Wang S, Wang D, Qiu L. Comparison of genetic diversity between chinese and american soybean (Glycine max (L.)) accessions revealed by high-density SNPs., 2017, 8: 2014.

[27] Zhang J P, Wang X Z, Lu Y M, Bhusal S J, Song Q J, Cregan P B, Yen Y, Brown M, Jiang G L. Genome-wide scan for seed composition provides insights into soybean quality improvement and the impacts of domestication and breeding., 2018, 11(3): 460-472.

[28] Vaughn J N, Nelson R L, Song Q J, Cregan P B, Li Z L. The genetic architecture of seed composition in soybean is refined by genome-wide association scans across multiple populations.s, 2014, 4(11): 2283-2294.

[29] Zhang D, Kan G Z, Hu Z B, Cheng H, Zhang Y, Wang Q, Wang H, Yang Y M, Li H Y, Hao D R, Yu D Y. Use of single nucleotide polymorphisms and haplotypes to identify genomic regions associated with protein content and water-soluble protein content in soybean., 2014, 127(9): 1905-1915.

[30] Lee S, Van K, Sung M, Nelson R, Lamantia J, Mchale L K, Mian M A R. Genome-wide association study of seed protein, oil and amino acid contents in soybean from maturity groups I to IV., 2019, 132(6): 1639-1659.

[31] 蓋鈞鎰. 植物數(shù)量性狀遺傳體系的分離分析方法研究. 遺傳, 2005, 27(1): 130-136.

GAI J Y. Segregation analysis of genetic system of quantitative traits in plants., 2005, 27(1): 130-136. (in Chinese)

[32] Tajuddin T, Watanabe S, Yamanaka N, Harada K. Analysis of quantitative trait loci for protein and lipid contents in soybean seeds using recombinant inbred lines., 2003, 53(2): 133-140.

[33] Pathan S M, Vuong T, Clark K, Lee J D, Shannon J G, Roberts C A, Ellersieck M R, Burton J W, Cregan P B, Hyten D L, Nguyen H T, Sleper D A. Genetic mapping and confirmation of quantitative trait loci for seed protein and oil contents and seed weight in soybean., 2013, 53(3): 765-774.

[34] Eskandari M, Cober E R, Rajcan I. Genetic control of soybean seed oil: II. QTL and genes that increase oil concentration without decreasing protein or with increased seed yield., 2013, 126(6): 1677-1687.

[35] Mansur l M, Orf j H, Chase k, Jarvik t, Cregan p B, Lark k G. Genetic mapping of agronomic traits using recombinant inbred lines of soybean., 1996, 36(5): 1327-1336.

[36] Mao T T, Jiang Z F, Han Y P, Teng W L, Zhao X, Li W B. Identification of quantitative trait loci underlying seed protein and oil contents of soybean across multi-genetic backgrounds and environments., 2013, 132(6): 630-641.

[37] Lu W G, Wen Z X, Li H C, Yuan D H, Li J Y, Zhang H, Huang Z W, Cui S Y, Du W J. Identification of the quantitative trait loci (QTL) underlying water soluble protein content in soybean., 2013, 126(2): 425-433.

[38] Kabelka E A, Diers B W, Fehr W R, Leroy A R, Baianu I C, You T, Neece D J, Nelson R L. Putative alleles for increased yield from soybean plant introductions., 2004, 44(3): 784-791.

[39] Reinprecht Y, Poysa V W, Yu K, Rajcan I, Ablett G R, Pauls K P. Seed and agronomic QTL in low linolenic acid, lipoxygenase-free soybean ((L.) Merrill) germplasm., 2006, 49(12): 1510-1527.

[40] Liang H Z, Yu Y L, Wang S F, Lian Y, Wang T F, Wei Y L, Gong P T, Liu X Y, Fang X J, Zhang M C. QTL mapping of isoflavone, oil and protein contents in soybean (L. Merr.)., 2010, 9(8): 1108-1116.

[41] Diers B W, Keim P, Fehr W R, Shoemaker R C. RFLP analysis of soybean seed protein and oil content., 1992, 83(5): 608-612.

[42] Lee S H, Bailey M A, Mian M A, Jr Carter T, Shipe E R, Ashley D A, Parrott W A, Hussey R S, Boerma H R. RFLP loci associated with soybean seed protein and oil content across populations and locations., 1996, 93(5): 649-657.

[43] Akond M, Liu S m, Boney M, Kantartzi S K, Meksem K, Bellaloui N, Lightfoot D A, Kassem M A. Identification of quantitative trait loci (QTL) underlying protein, oil, and five major fatty acids’ contents in soybean., 2014, 5(1): 158-167.

[44] Zhang Y H, Liu M F, He J B, Wang Y F, Xing G N, Li Y, Yang S P, Zhao T J, Gai J Y. Marker-assisted breeding for transgressive seed protein content in soybean [(L.) Merr.]., 2015, 128(6): 1061-1072.

Genetic dissection of protein content in a nested association mapping population of soybean

LI ShuGuang1,2, CAO YongCe1, HE JianBo1, WANG WuBin1, XING GuangNan1, YANG JiaYin2, ZHAO TuanJie1, GAI JunYi1

(1Soybean Research Institute, Nanjing Agricultural University/National Center for Soybean Improvement/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministry of Agriculture/State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210095;2Huaiyin Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai Region in Jiangsu, Huai’an 223001, Jiangsu)

【】Soybean is an important cash crop, a major source of plant protein and oil for human diet. As a major objective of soybean breeding, protein content is a complex trait controlled by multiple genes with varying genetic effects interacting with environment. A genome-wide association study (GWAS) was conducted to dissect the genetic architecture of protein content in a soybean nested association mapping (NAM) population, and the detected genetic constitution can be further used for molecular design in soybean breeding for high protein content. 【】Four soybean recombinant inbred line (RIL) populations (Linhe×M8206, Zhengyang×M8206, M8206×Tongshan and M8206×WSB) with a common parent (M8206) as a NAM population were constructed, genotyped with RAD-seq (restriction-site-associated DNA sequencing) and tested under multiple locations in 2012 - 2014. Protein content was measured at full maturity (R8) stage. The restricted two-stage multi-locus GWAS (RTM-GWAS) procedure was used to dissect the genetic architecture of seed protein content of the population. 【】The protein content varied widely in the population with trait heritability estimated as high as 85.00%. The analysis of variance for protein content showed significant differences across genotypes, environments and genotype-by-environment interactions. A total of 90 QTLs were detected to be associated with protein content, with 20 loci being novel ones. The phenotypic variation explained by each QTL ranged from 0.06% to 3.99%, with a sum of 45.60%. The number of alleles at each locus ranged from 2 to 5, and the allele effects ranged from -2.434% to 2.845%, while most of them were between -1.000% and 1.000%. From the detected QTLs, 73 candidate genes were annotated. Among these candidate genes,involved in cysteine biosynthetic process, andinvolved in glycine and aromatic amino acid family metabolic process. The two genes may be selected for further functional study. Based on the QTL-allele matrix of protein content, the predicted transgressive potential of cross progeny was as high as 56.5%. 【】A total of 90 QTLs for protein content were detected with 20 loci being novel, from which 73 candidate genes were annotated, indicating that protein content is a complex trait conferred by multiple genes or a gene network.

soybean [(L.) Merr.]; nested association mapping population (NAM); protein content; restricted two-stage multi-locus genome-wide association analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.09.005

2019-08-26；

2019-11-30

國家自然科學基金（31701447，31571695）、國家作物育種重點研發(fā)計劃（2017YFD0101500，2017YFD0102002）、長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（PCSIRT_17R55）、教育部111項目（B08025）、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費項目（KYT201801）、農(nóng)業(yè)部國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系CARS-04、江蘇省優(yōu)勢學科建設(shè)工程專項、江蘇省JCIC-MCP項目、淮安市科技計劃（HAB201846）、淮安市農(nóng)業(yè)科學研究院院長科研基金（HNY201703）、作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室開放課題基金（ZW201713）、江蘇省自然科學基金（BK20151285）

李曙光，E-mail：dawn0524@126.com。通信作者賀建波，E-mail：hjbxyz@gmail.com。通信作者蓋鈞鎰，E-mail：sri@njau.edu.cn

（責任編輯 李莉）