胡曉磐，李世昌*，孫 朋

（1.華東師范大學(xué)“青少年健康評價與運動干預(yù)”教育部重點實驗室，上海 200241；2.華東師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院，上海 200241）

隨著系統(tǒng)生物學(xué)、骨分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的發(fā)展，骨形成或骨吸收不僅受激素、代謝和機械應(yīng)力的影響，還可能與表觀遺傳（epigenetic）有關(guān)（Amjadi-Moheb et al.，2019）。表觀遺傳在不改變核酸序列的情況下，使基因表達發(fā)生可遺傳變化，以DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白修飾（histone modifications）和非編碼 RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）3種方式為主（Letarouilly et al.，2019）（表1）。而與基因突變有所不同的是，表觀遺傳的改變具有可逆性（張嚴焱等，2018）。有研究發(fā)現(xiàn)，身體活動通過影響相關(guān)基因的表觀遺傳修飾，從而起到預(yù)防和改善病癥的效用（Zimmer et al.，2016）（圖1），這意味著運動作為外源性刺激，可充當環(huán)境表觀遺傳調(diào)制器，在不影響DNA編碼的前提下，通過直接或間接作用于骨組織細胞，發(fā)揮提升骨量、骨密度，改善骨強度等骨骼機械性能的功能。這可能是引起基因組一致的同卵雙生子在不同環(huán)境下呈現(xiàn)出身高及骨健康狀況差異的原因，也是解釋了運動影響骨質(zhì)變化的潛在機制?；诖?，本文綜述國內(nèi)外運動對骨質(zhì)影響的表觀遺傳學(xué)研究進展，并系統(tǒng)闡述其中表觀遺傳的可能機制。

1 表觀遺傳與骨質(zhì)變化

1.1 DNA甲基化與骨質(zhì)

骨質(zhì)的強健與遺傳及環(huán)境因素密切相關(guān)，主要候選基因涉及鈣磷代謝調(diào)節(jié)激素、性激素、細胞因子及其相應(yīng)的受體基因和I型膠原蛋白基因（張奎等，2017；Qi et al.，2003）；不益于骨健康的高危環(huán)境因素則包括營養(yǎng)失衡、鈣攝入不足、缺乏運動和不良的生活習(xí)慣等（Bloomfield，2003）。DNA甲基化正是在遺傳-環(huán)境-骨質(zhì)變化范疇內(nèi)，由基因和外界環(huán)境的相互作用，引起生命周期內(nèi)骨質(zhì)改變的表觀遺傳調(diào)控方式之一。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期婦女缺失維生素D將導(dǎo)致CYP2R1和CYP24A1等基因位點高甲基化，使子代基因沉默，造成后代整體表觀遺傳程序功能障礙（Michou，2018；Pike et al.，2015；Von et al.，2018）（圖2），由此可解釋孕期維生素D不足與胎兒骨發(fā)育遲緩和兒童期骨量減損的聯(lián)系。Wang等（2018）發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）患者骨組織內(nèi)促破骨細胞分化的核因子kB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL）呈基因啟動子低甲基化，而抑制破骨細胞生成的骨保護素（osteoprotegerin，OPG）表現(xiàn)為啟動子高甲基化，使得RANKL高表達而OPG不足。這與正常骨組織中RANKL/OPG通路狀態(tài)相反，反映出原發(fā)性骨質(zhì)疏松所表現(xiàn)的RANKL/OPG通路紊亂，可能是由于DNA甲基化狀態(tài)改變所致。

1.2 組蛋白修飾與骨質(zhì)

組蛋白乙?；?種核心組蛋白中均可發(fā)生，是表觀遺傳組蛋白修飾的研究熱點（王維 等，2012；Grunstein，1997）。催化組蛋白乙?；揎椀拿赴杉せ钷D(zhuǎn)錄的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone/lysine acetyltransferases，HATs/KATs）（Lutter et al.，1992）和功能相反的組蛋白去乙?；福╤istone/lysine deacetylases，HDACs/KDACs）（Taunton et al.，1996）。染色質(zhì)免疫沉淀顯示，成骨細胞基因啟動子區(qū)域存在p300和CREB結(jié)合蛋白（CREB binding protein，CBP）2種HATs大分子（Gordon et al.，2011），可誘導(dǎo)25-羥維生素D3-24-羥基化酶（25-hydroxyvitamin D3-24-hydroxylase，Cyp24）基因的啟動子發(fā)生組蛋白H4乙酰化，激活成骨基因轉(zhuǎn)錄（Kim et al.，2005）。p300/CBP同樣有助于維持巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）和細胞核因子C1（nuclear factor of activated T cells C1，NFATc1）的高乙酰化狀態(tài)，促破骨細胞生成（Asagiri et al.，2005；Weilbaecher et al.，2001）。Cantley等（2017）使用組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACI）探究高度乙?；瘜Τ晒羌毎推乒羌毎只盎虮磉_的影響，發(fā)現(xiàn)HDACI有助于成骨細胞（osteoblast，OB）成熟及基質(zhì)礦化（Schroeder et al.，2007），但也會介導(dǎo)OB內(nèi)核因子kB受體活化因子配體（RANKL）啟動子區(qū)域乙?；?，繼而激活破骨細胞（osteoclast，OC），使受試者骨密度降低，骨折風(fēng)險增高（McGee-Lawrence et al.，2011）。以上研究表明，乙?；揎椏伸`活地影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能，在成骨和破骨生成過程中均發(fā)揮重要作用。同時，作為骨相關(guān)基因表觀遺傳的直接或共調(diào)控方式，具備相當?shù)膭討B(tài)性和復(fù)雜性。

1.3 非編碼RNA與骨質(zhì)

在非編碼RNA中，長度約19～24個核苷酸的microRNA（miRNA）在機體生命活動過程中的效應(yīng)范圍十分廣泛，可作用于約30%的人類基因組，同時具有較高穩(wěn)定性，因而其表達水平可成為監(jiān)測和診斷骨代謝疾病的最佳生物標志物。目前已檢測出多達80余種與骨密度（bone mineral density，BMD）、骨折和骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān) 的 特 異 性 miRNA（Cheng et al.，2018；Scimeca et al.，2017）（表2），如過表達miR-338-3p會通過靶向Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）和成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2），抑制Osterix等骨形成轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致骨質(zhì)疏松（Liu et al.，2014）。但有些miRNA分子的作用功能尚未得到統(tǒng)一定論（Meng et al.，2015；Wei et al.，2017），如 Panach等（2015）發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松性骨折患者血清中miR-21-5p與I型膠原羧基末端肽CTX（骨吸收標志物）水平存在很強相關(guān)性；Yavropoulou等（2017）的研究指出，健康對照組人群的miR-21-5p水平高于骨質(zhì)疏松患者。樣本量大小、研究對象等因素會影響最終的研究結(jié)論，同時miRNA在不同骨組織細胞乃至各發(fā)育分化階段的功能是否存在差異，以及骨折等改變骨穩(wěn)態(tài)的因素是否會干擾miRNA的作用方式等問題有待研究證明。此外，循環(huán)血液中動態(tài)變化的miRNA在運動應(yīng)激及逐漸適應(yīng)過程中同樣呈現(xiàn)差異性表達，如有氧耐力顯著上調(diào)miR-15a和miR-199a水平，急性力竭運動使血液中miR-146a和miR-222顯著升高，因此也可將這些血液中的miRNA作為反映訓(xùn)練效果的分子標志物（Ostanek et al.，2018）。

2 運動改善骨質(zhì)的表觀遺傳學(xué)機制

對運動改善骨質(zhì)代謝原因的探究長期集中在機械負荷刺激對骨量、骨細胞和骨內(nèi)環(huán)境作用的細胞分子機制上（Andreoli et al.，2012；Ehlert et al.，2013），并逐步明確運動通過調(diào)節(jié)骨相關(guān)激素、細胞因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用途徑。但運動強度、時長、頻率、項目種類以及實驗對象不一致所帶來的異質(zhì)性，使得現(xiàn)有的研究成果偏重于從運動改善骨生長代謝相關(guān)生化指標的角度闡釋運動對骨質(zhì)的積極影響，這在一定程度上限制了對運動健骨潛在機制的思考模式。隨著表觀遺傳概念滲入骨代謝研究領(lǐng)域，Rubin等（1990）運用表觀遺傳概念說明了力學(xué)環(huán)境影響骨骼形態(tài)方式。盡管研究中并沒有對具體的表觀遺傳修飾途徑作詳細敘述，但指出在器官水平上，功能性身體活動（functional activity）所產(chǎn)生的機械應(yīng)力可以被看作為一個有效的表觀遺傳參數(shù)，經(jīng)由組織水平轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的骨力學(xué)參數(shù)后，在細胞水平上再轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的生化信號，繼而調(diào)節(jié)骨骼形態(tài)以適應(yīng)先前的功能性機械應(yīng)力。Tumer（1992）從表觀遺傳憑借轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）對骨骼系統(tǒng)產(chǎn)生正反饋和促分化調(diào)控的角度，認為表觀遺傳模式與Wolff定律所持有的骨力學(xué)適應(yīng)性負反饋調(diào)控理念互為補充。了解運動對骨質(zhì)影響的表觀遺傳調(diào)控機制，有利于豐富和完善運動健骨理論，同時對認識骨代謝調(diào)控、骨相關(guān)疾病的預(yù)防和診斷具有一定的學(xué)術(shù)價值。

2.1 運動通過調(diào)控DNA去甲基化促成骨生成

缺乏身體鍛煉或久坐不動的生活方式會增加人體罹患骨代謝性疾病的風(fēng)險，體育運動益于骨骼強健，這一點在長期接受沖擊性機械刺激訓(xùn)練的運動員的骨密度含量顯著高于常人中得以驗證（Valente et al.，2018）。即使無法達到高水平的骨密度值，運動也會從表觀遺傳層面對不同性別、年齡段群體各組織的DNA甲基化程度產(chǎn)生顯著效應(yīng)，尤以40歲以上人群最為明顯（Nakajima et al.，2010；R?nn et al.，2013）。盡管與運動相關(guān)的DNA甲基化變化數(shù)量巨大（Reimand et al.，2016），也有研究論證了運動引起的基因啟動子甲基化改變，對血細胞（White et al.，2013）、骨骼?。℉e et al.，2018；Kanzleiter et al.，2015）、腦組 織（Rodrigues et al.，2015）、脂 肪 組 織（R?nn et al.，2013）、腫瘤（Bryan et al.，2013）以及配子（Denham et al.，2015）產(chǎn)生影響。但未見有運動影響骨組織DNA甲基化的直接研究文獻。但通過對245名10～13歲芬蘭女青少年的雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）基因PvuII多態(tài)性和骨質(zhì)量、骨形態(tài)進行分析后發(fā)現(xiàn)，每周體育活動時間超過3 h，對于雜合子基因型（Pp）個體的骨質(zhì)量、骨密度及皮質(zhì)骨厚度均有顯著提升效果；而純合子基因型（PP和pp）的上述骨指標不會因運動量的增加出現(xiàn)明顯變化。這說明骨質(zhì)狀況是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，而運動可借助ERα基因PvuII多態(tài)性在一定程度上彌補雜合子基因型個體“先天不足”的骨質(zhì)狀態(tài)（Suuriniemi et al.，2004）。

實際上，兩性達到峰值骨量都需要雌激素（estrogen）的參與，也需要由ERα介導(dǎo)完成；ERα在結(jié)合雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）后激活靶基因轉(zhuǎn)錄，影響骨的成熟和礦化。在成骨細胞中，ERα基因的表達主要與遠端F區(qū)啟動子CpG島甲基化相關(guān)，并會因雌激素增多而降低甲基化程度（Penolazzi et al.，2004；Tübel et al.，2016）；此外，運動可通過提升絕經(jīng)期女性雌激素水平來改善骨質(zhì)（Gavin et al.，2018；Stanton et al.，2018）?；诔晒羌毎鸈Rα基因在雌激素作用下發(fā)生的啟動子甲基化狀態(tài)改變，以及適量運動負荷與機體雌激素水平對骨質(zhì)的保護作用，推測出運動可能通過直接或間接地改變ERα基因甲基化水平促成骨細胞正向生成。

2.2 運動通過調(diào)控組蛋白修飾維持骨穩(wěn)態(tài)

表觀遺傳修飾中，組蛋白去乙?；癄顟B(tài)改變同樣影響骨重塑過程。以III類組蛋白去乙?；福℉DAC-III）家族中的長壽蛋白Sirtuins（SIRTs）為例，人體7種Sirtuin蛋白（Sirt1-7）可依靠輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）調(diào)節(jié)多種蛋白的乙?；揎椈駻DP核糖基修飾。體育活動可通過提高SIRTs活性，預(yù)防因衰老而產(chǎn)生的代謝性疾?。↙anza et al.，2008）。其中，Sirt1是細胞衰老、能量代謝和骨骼重塑3個環(huán)節(jié)的交匯點（楊宜锜等，2019），可去乙?；{(diào)節(jié)維持細胞干性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOX2（sex determining region Y-box 2），進而加快終末分化細胞重編效率，獲得與骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）同等的多向分化潛力（Mu et al.，2015）；當Sirt1表達受抑時，會誘導(dǎo)BMSCs中的SOX2發(fā)生乙?；头核鼗?，將其向核外輸出后降解，嚴重阻遏BMSCs的增殖和向成骨分化的能力（Yoon et al.，2014）。此外，Sirt1還可直接與Runx2結(jié)合，促 BMSCs成骨并抑制其向脂肪分化（B?ckesj? et al.，2006；Tseng et al.，2011）；激活單磷酸腺苷活化蛋白激酶［adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］限制核因子κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB），下調(diào)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性抑制骨吸收（Katto et al.，2013；Shakibaei et al.，2011）；使骨硬化蛋白基因（sclerostin，SOST）啟動子組蛋白H3第9位賴氨酸殘基去乙酰化，阻遏SOST負向調(diào)控成骨細胞的功能（Cohenkfir et al.，2011）。在運動能否通過上調(diào)Sirt1促進骨質(zhì)代謝的研究中指出，長期規(guī)律性體育活動可上調(diào)Sirt1活性，如8周的跑臺運動激活Sirt1和叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a（forkhead box O3a），形成 Sirt1/FOXO3a活性復(fù)合物，恢復(fù)生長阻滯與DNA損傷基因（growth arrest and DNA damage，GADDA45a）、錳超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase，MnSOD）和細胞周期蛋白 D2（Cyclin D2）的含量，抑制細胞凋亡并容許DNA修復(fù)，以延緩衰老進程（Ferrara et al.，2008）。

耐力運動可上調(diào)骨骼肌Sirt1表達量（Suwa et al.，2008），同時去乙?；せ钸^氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（αsubunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator-1，PGC-1α），改善衰老引發(fā)的線粒體生物發(fā)生和氧化能力減退（Koltai et al.，2012）。值得注意的是，PGC-1α可結(jié)合雌激素相關(guān)受體α（estrogen-related receptorα，ERRα），增強核受體轉(zhuǎn)錄激活，參與雌激素調(diào)節(jié)的骨代謝；急性和有氧運動均可改善女性性激素水平（Stanton et al.，2018）?；谶\動提高Sirt1及雌激素水平的特點，結(jié)合體力活動提高NAD+信號分子水平，激活代謝傳感器AMP依賴的蛋白激酶［Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］及Sirt1，引起靶蛋白磷酸化和去乙?；谋碛^遺傳改變，促進組織氧化重塑的作用（J?ger et al.，2007）。推測運動可通過作用于Sirt1上游因子，借助NAD+/AMPK/Sirt1/PGC-1α/雌激素相關(guān)受體α通路，調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾，刺激骨代謝靶基因的生物合成，改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)（圖3）。

2.3 運動通過調(diào)控非編碼RNA影響骨代謝

有研究表明，力學(xué)刺激變化可通過調(diào)控miRNA改變骨吸收、骨形成方向，這主要是依靠對機械敏感型因子miR-103a的激活或抑制實現(xiàn)。在失去力學(xué)刺激的狀態(tài)下，miR-103a的過表達將嚴重降低成骨分化主要轉(zhuǎn)錄因子Runx2含量；而恢復(fù)力學(xué)刺激，可抑制miR-103a水平并上調(diào)Runx2蛋白表達（Bin et al.，2015；Yuan et al.，2017）。Sun等（2015）發(fā)現(xiàn)，微重力狀態(tài)下miR-103表達的上調(diào)會通過抑制L型電壓門控鈣通道（L-type Ca2+channel，LTCC）Cav1.2的表達，阻礙成骨細胞增殖。miR-154-5p可抑制調(diào)控成骨分化的Rho/Rho激酶（Rho-associated kinase，ROCK）通路，并靶向Wnt11以阻礙脂肪來源間充質(zhì)干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）向成骨分化；通過增加機械應(yīng)力下調(diào)miR-154-5p，激活Wnt/平面細胞極性（planar cell polarity，PCP）通路促進ADSCs成骨（Li et al.，2015）。動物實驗結(jié)果顯示，跑臺運動在提高皮質(zhì)骨密度的同時（曹鵬，2009），可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脛骨內(nèi)37種miRNA表達差異，其中，miR-let-7a/d/f/i-5p在運動組中表達下調(diào)；2周的重力負荷使小鼠脛骨中miR-20a和miR-92a表達量高出安靜組1.3和2.1倍（Zhou et al.，2014）。當關(guān)鍵miRNA缺失時，骨組織細胞對機械應(yīng)激刺激的反應(yīng)不再敏感。Mohan等（2015）在破壞成骨細胞內(nèi)miR-17-92簇后，發(fā)現(xiàn)骨對機械應(yīng)變的反應(yīng)明顯減弱，同時EIk3、Runx2和骨膜基因表達減少。因此，運動可能通過調(diào)控miRNA防治廢用性骨丟失（Domanska et al.，2019；Li et al.，2015）。盡管miRNA并非機械刺激下唯一調(diào)節(jié)骨代謝的因子，但其在機械應(yīng)力下會發(fā)生明顯改變，并可通過調(diào)節(jié)成骨因子或骨吸收因子表達，來加強機械負荷對骨形成的積極作用。然而，訓(xùn)練方案設(shè)計的項目強度和總持續(xù)時長可能是決定miRNA變化的關(guān)鍵要素（馬濤等，2011）。Farsani等（2019）使用4種運動方案（中、高強度耐力和中、高強度抗阻訓(xùn)練）對23月齡Wistar大鼠進行為期8周的干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，miR-133a、miR-103a與miR-204水平在中、高強度抗阻訓(xùn)練中有所下降，但這3種直接靶向Runx2的成骨分化負調(diào)控因子的表達并沒有因運動介入而受到明顯抑制。

由此，建議老年群體采用中、高強度抗阻訓(xùn)練方案以激活骨重建，并表示8周的干預(yù)時長還不足以引起miRNA變化，應(yīng)堅持長期（≥6個月）規(guī)律性體育鍛煉才有可能從中獲益。事實上，龐大而復(fù)雜的非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其全部信息和功能并不是獨立或單向的，如已證實lncRNA和miRNA同樣參與到對DNA甲基化酶和組蛋白修飾的調(diào)控過程中，引起DNA甲基化及染色質(zhì)重塑改變，從而決定細胞骨髓間充質(zhì)干細胞分化方向（圖4）。解析骨組織內(nèi)整體或特定的非編碼RNA分子功能信息，以及其在運動過程中的變化情況，將有助于更加全面詳實地闡明運動調(diào)控骨質(zhì)代謝的表觀遺傳變化機制，并為骨代謝性疾病的發(fā)生提供全新的表觀遺傳調(diào)控視角。

圖4 調(diào)節(jié)人體骨髓間充質(zhì)干細胞分化的表觀遺傳機制（Letarouilly et al.，2019）Figure 4.Epigenetic Mechanisms in Regulating Preferential Human BMSCs Differentiation

3 結(jié)論與展望

一直以來，相關(guān)研究都在從力學(xué)刺激下的骨相關(guān)因子、激素、信號通路變化等方面論證適量運動有益于維持骨穩(wěn)態(tài)，并大力推廣運動科學(xué)健骨的理念，而表觀遺傳正為運動這一外源性刺激引起的骨相關(guān)基因響應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化，并呈現(xiàn)出時間和空間上的表達調(diào)控改變，提供了最新探究角度。近年來，相關(guān)研究為骨健康和運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域積累了一定的表觀遺傳學(xué)資料，通過影響基因的表觀遺傳修飾，影響骨相關(guān)基因的表達，可能是運動改善骨質(zhì)的良性機制之一。盡管將表觀遺傳修飾、運動和骨質(zhì)代謝直接聯(lián)系起來的研究并不多見，但通過對文獻的整理可以看出，運動能顯著改變DNA甲基化水平、組蛋白修飾狀態(tài)及非編碼RNA的表達，當中的部分表觀遺傳修飾變化與骨質(zhì)代謝標志物、信號通路和關(guān)鍵基因的表達密切相關(guān)。然而，關(guān)于表觀遺傳的諸多疑問仍未解決，如機體表型與代謝性疾病的發(fā)生由基因遺傳和表觀遺傳共同決定，應(yīng)如何區(qū)分和量化兩者影響程度的多寡；不同運動項目、時長、強度和頻次與骨相關(guān)表觀遺傳修飾變化之間的關(guān)聯(lián)等有待長期實驗進行驗證。同時，運動對干細胞表觀遺傳修飾的影響或?qū)⒊蔀檫\動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新興課題。未來還可將慢性骨代謝疾病與生活環(huán)境、生活方式等表觀遺傳修飾的決定因素相聯(lián)系，從誘因入手以減少骨疾病發(fā)生的可能。