侯靜靜，何智宏，司二靜，姚立蓉，汪軍成，馬占軍，李葆春，4，楊 軻，孟亞雄，馬小樂(lè)，王化俊

（1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070；3.甘肅省林業(yè)科技推廣總站，蘭州 730046；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

大麥（Hordeum vulgare L.）是禾本科大麥屬1a生草本植物，啤酒大麥?zhǔn)歉拭C省優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)［1］。大麥條紋病（Barley leaf stripe）是大麥的主要病害之一，在大麥種植區(qū)普遍發(fā)生［2-3］。國(guó)際范圍內(nèi)在地中海和北歐地區(qū)發(fā)病較為嚴(yán)重［4-5］。中國(guó)長(zhǎng)江流域的滬、贛、浙、湘等地發(fā)病較重，病株死亡率高達(dá)30%～40%［6］。甘肅啤酒大麥和青稞的種植地同樣發(fā)生該病害，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)能造成10%～30%的減產(chǎn)［7］。由于耕作制度的變化以及多年的連茬種植，該病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，對(duì)于該病原菌抗性研究顯得尤為重要。現(xiàn)已得知，該病是由種子帶菌引起的系統(tǒng)侵染性真菌病害，其病原菌的無(wú)性階段為禾內(nèi)臍蠕孢（Drechslera graminea（Rabenh &Schlecht）Schoemaker）［8］，有性階段為麥類(lèi)核菌（Pyrenophora graminea）［9］。

運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)研究該病原菌的遺傳差異性，可以對(duì)大麥條紋病防治與抗性育種方面提供理論依據(jù)。分子標(biāo)記技術(shù)包括許多類(lèi)型，如IRAP、RAPD、RFLP、AFLP、SSR 等［10］。其 中RAPD（random amplified polymorphic DNA）技術(shù)是通過(guò)PCR（Polymerase Chain Reaction）擴(kuò)增產(chǎn)物片段的多態(tài)性來(lái)揭示待測(cè)基因組DNA 的遺傳多態(tài)性［11］。該技術(shù)的引物為隨機(jī)多態(tài)單引物，且與模板配對(duì)穩(wěn)定，其操作方便快捷，退火溫度低等特點(diǎn)極大地提高了分析效率［12］。Jawhar等［13］對(duì)敘利亞地區(qū)不同地理來(lái)源的麥類(lèi)核菌（P.graminea）進(jìn)行RAPD 遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果得出不同地理來(lái)源菌株之間有明顯差異性，表明RAPD可快捷準(zhǔn)確地檢測(cè)病原菌遺傳多樣性。Zein等［14］運(yùn)用IRAP和ITS-RFLP 2種標(biāo)記方法分析麥類(lèi)核菌（P.graminea）的遺傳多樣性，得出2種標(biāo)記方式均能很好地揭示多樣性。Bayraktar等［15］研究表明，運(yùn)用ISSR 分析可將供試的麥類(lèi)核菌（P.graminea）菌株劃分為4 個(gè)簇，用ITSRFLP分析結(jié)果顯示菌株間無(wú)差異。在大麥條紋病抗性評(píng)價(jià)研究方面，Mueller等［16］在德國(guó)薩克森聯(lián)邦州對(duì)620份大麥品種進(jìn)行大麥條紋病的抗性鑒定，結(jié)果得出，超過(guò)186份品種在田間表現(xiàn)為抗性。

甘肅省的大麥種植區(qū)域廣泛，河西走廊地區(qū)的生態(tài)環(huán)境多樣，大麥條紋病原菌在該地區(qū)的遺傳多樣性及大麥親本對(duì)該病菌的抗性尚未明確。因此本研究以河西地區(qū)的麥類(lèi)核菌（P.gra-minea）為研究對(duì)象，運(yùn)用RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，采用“夾心法”鑒定大麥親本材料對(duì)其抗性［17］，以期為大麥條紋病病害的防控和抗性育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 20 個(gè)供試菌株于2009 和2012年采自河西走廊啤酒大麥種植區(qū)域，均采集于大麥條紋病發(fā)病植株的葉片部位，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類(lèi)課題組保存并進(jìn)行致病機(jī)理的研究。供試菌株信息如表1所示。

1.1.2 供試大麥品種 抗性評(píng)價(jià)的30份大麥品種由甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同大麥產(chǎn)區(qū)。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制 使用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡 萄 糖 瓊 脂 培 養(yǎng) 基（Potato Dextrose Agar，PDA），將新鮮馬鈴薯削皮去芽眼切成1cm2的小方塊，稱(chēng)取重量200g，加1L蒸餾水煮沸20min，過(guò)濾去殘?jiān)?，在濾液中加入20g葡萄糖和17g瓊脂，玻璃棒攪拌混勻，加蒸餾水定容至1L，高壓蒸汽滅菌。

表1 供試菌株信息Table 1 Information of Pyrenophora graminea

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株遺傳多樣性的RAPD 分析 參照真菌基因組DNA 提取方法來(lái)提取20 個(gè)供試麥類(lèi)核菌（P.graminea）菌株基因組DNA［18］。用超微量分光光度計(jì)測(cè)定其OD230／OD260值，OD260／OD280值和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，最終置于-20 ℃冰箱保存，備用。由華大基因公司（BGI）合成隨機(jī)多態(tài)單引物［13，19］。

RAPD 擴(kuò)增體系優(yōu)化試驗(yàn)的引物為OPK3（序列：5′-CCAGCTTAGG-3′），DNA 模板為菌株SD，將 DNA 模 板 濃 度、2 × MasterMix（BIOTEKE，PR1701）添加量和循環(huán)數(shù)分別設(shè)置兩個(gè)水平，30ng／μL和60ng／μL，5μL 和7μL，40和45（表2），PCR 反應(yīng)程序如表3所示。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)GoldView Ⅱ（GV Ⅱ）染色，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外光凝膠成像系統(tǒng)顯像，拍照。

表2 RAPD優(yōu)化設(shè)置Table 2 Optimal setting of RAPD

表3 擴(kuò)增程序Table 3 PCR program

運(yùn)用篩選出的多態(tài)單引物和優(yōu)化后的擴(kuò)增體系對(duì)20 個(gè)供試菌株基因組DNA 進(jìn)行RAPDPCR 擴(kuò)增和DNA 指紋圖譜分析，將電泳結(jié)果DNA 圖譜中的無(wú)條帶DNA 記為0，有條帶記為1，建立0，1型二元矩陣。各菌株間遺傳相似性系數(shù)（Genetic Similarity，GS）的計(jì)算采用軟件NTSYSpc 2.10e 完 成［20］，聚 類(lèi) 分 析 圖 的 構(gòu) 建 采 用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）法［21］。

1.2.2 大麥親本抗性評(píng)價(jià) 采用“夾心法”，以實(shí)驗(yàn)室前期鑒定出的大麥條紋病強(qiáng)致病性菌株QWC來(lái)接種侵染30 份供試大麥親本材料［22］。首先進(jìn)行大麥種子預(yù)處理，將種子置于200 mL錐形瓶，加入φ=70%酒精震蕩30s，移除上清，加入無(wú)菌水，震蕩后吸除，重復(fù)3次，再加入φ=5%次氯酸鈉震蕩5min，除上清，加入無(wú)菌水，震蕩去上清，重復(fù)3次，然后將種子置于無(wú)菌濾紙上吸干水分，接著將處理后的種子放置于PDA 菌絲平板上，最后，在種子上層覆蓋一層同樣的PDA 菌絲平板，菌絲面接觸種子。

試驗(yàn)以大麥種子置于空白PDA 平板培養(yǎng)基間作為對(duì)照，每個(gè)大麥品種設(shè)置30粒種子。4 ℃黑暗生化培養(yǎng)箱中侵染生長(zhǎng)20d，然后移栽至花盆中。培養(yǎng)條件為12h（光照）／12h（黑暗），溫度為20℃（光照）／12℃（黑暗），濕度為40%的環(huán)境中生長(zhǎng)。觀察大麥發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)感病率。參考Pecchioni等［23］方法進(jìn)行大麥條紋病抗性等級(jí)評(píng)價(jià)：高感（HS）：感病率＞40%；感?。⊿）：感病率15%～40%；抗?。≧）：感病率5%～15%；高抗（HR）：感病率＜5%；免疫（I）：感病率=0%。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD 擴(kuò)增體系優(yōu)化

如圖1所示，在10μL的反應(yīng)體系中，當(dāng)變量?jī)H為DNA 模板濃度時(shí)，30ng／μL和60ng／μL兩個(gè)水平的擴(kuò)增結(jié)果無(wú)顯著差異，如1和2，3和4，5和6，7和8號(hào)泳道兩兩對(duì)比所得；當(dāng)變量為擴(kuò)增循環(huán)數(shù)時(shí)，40和45的擴(kuò)增結(jié)果同樣差異不明顯，如1和5，2和6，3和7，4和8號(hào)泳道兩兩對(duì)比所示；但是5μL 和7μL 的2×MasterMix對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有較大差異，泳道1和3，2和4，5和7，6和8號(hào)兩兩對(duì)比可以看出，5μL較7μL的擴(kuò)增條帶清晰，且在1 000bp到2 000bp間多出兩條條帶。鑒于此，本試驗(yàn)的RAPD-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：1μL 引物（10μmol／L），1μL DNA 模板（30ng／μL），5μL的2×MasterMix（BIOTEKE，PR1701），加ddH2O 至10μL。PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如表3 所示。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)GoldView Ⅱ（GVⅡ）染色，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，拍照。

圖1 PCR 體系優(yōu)化的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of optimized PCR system

2.2 RAPD圖譜和聚類(lèi)分析

篩選出30對(duì)具有多態(tài)性且條帶清晰的隨機(jī)單引物（表4）進(jìn)行RAPD-PCR 試驗(yàn)，共獲得63條多態(tài)性條帶，總條帶數(shù)為138條，多態(tài)性條帶數(shù)占總條帶數(shù)的45.65%。其中引物S2082，S61，S9，S6和S1的多態(tài)性比率均為100%，引物S82的多態(tài)性比率最小，為12.50%。

表4 RAPD分析引物序列和多態(tài)性條帶Table 4 Sequence of primers and number of polymorphic fragments obtained by RAPD analysis

采用UPGMA 法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示（圖2）：菌株HZ 和QWC、菌株QQ 和SW之間的遺傳相似系數(shù)（GS）均為0.936 5，為20個(gè)供試菌株間遺傳相似性最高，且它們地理位置各不相同，分別在武威市、蘭州市、張掖市和金昌市，其次是來(lái)自金昌市的菌株SSB和CJZ間的GS為0.921 6。菌株YC 的遺傳相似性系數(shù)（GS）為0.624 1，采自金昌市永昌縣，在供試菌株間最小，與其余19個(gè)菌株間的遺傳差異較大，次之是武威市黃羊河鎮(zhèn)的菌株HYH，遺傳相似性系數(shù)（GS）為0.674 1。供試的20 個(gè)不同地區(qū)麥類(lèi)核菌（P.graminea）間的遺傳相似系數(shù)（GS）范圍為0.624 1～0.936 5，在遺傳相似系數(shù)為0.716 6時(shí)可將20個(gè)菌株劃分為4類(lèi)，菌株XTB和JT 為一類(lèi)，且這兩個(gè)菌株的地理位置相隔較遠(yuǎn)，前者在張掖市，后者在白銀市，GS最小的菌株YC 單獨(dú)為一類(lèi)，次小的菌株HYH 獨(dú)自為一類(lèi)，剩余16個(gè)菌株聚為一類(lèi)，其中，菌株TB 與其他15個(gè)菌株差異較大，GS 為0.748 1 時(shí)菌株SS、CH、SD、GL、DQ、QZ和SSS聚在一起，剩余8個(gè)菌株聚在一起。綜上可得不同地理來(lái)源的麥類(lèi)核菌（P.graminea）菌株間存有一定的遺傳差異性。

如圖3所示，試驗(yàn)中20個(gè)菌株間遺傳距離為0.052 3～0.819 1，圖中數(shù)值與對(duì)角相應(yīng)的方格顏色相一致?？梢钥闯?，菌株TB 和YC 間的遺傳距離最大，對(duì)應(yīng)方格顏色為深藍(lán)色，說(shuō)明這兩個(gè)不同地理位置菌株之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，分別采自武威市頭壩村和金昌市永昌縣。菌株QQ 和菌株SW 的遺傳距離最小，對(duì)應(yīng)方格顏色為深紅色，說(shuō)明兩菌株親緣關(guān)系最近，遺傳差異較小，采自張掖市清泉鎮(zhèn)和金昌市雙灣鎮(zhèn)。在供試的20個(gè)不同地區(qū)菌株中，菌株SW 和QWC，菌株HZZ 和SW，菌株SSB 和HZ 之間的地理位置均相隔較遠(yuǎn)，但遺傳距離均較小，僅有0.069 9、0.065 3和0.088 0。菌株JT 和SSS，菌株YC 和XSB 的地理位置較接近，但遺傳距離較大，分別為0.438 3和0.633 0。同時(shí)也存在地理位置接近遺傳距離小和地理位置遠(yuǎn)遺傳距離大的菌株，例如菌株CJZ和SW，菌株XTB 和YC，遺傳距離分別為0.078 0和0.607 9，得出地理位置間的遠(yuǎn)近差異與菌株遺傳距離的大小無(wú)顯著相關(guān)性。

圖2 基于RAPD分析的20個(gè)菌株間遺傳相似系數(shù)的UPGMA法聚類(lèi)圖Fig.2 Phylogenetic tree constructed by UPGMA of similarity index matrix among 20tested isolates based on RAPD analysis

圖3 基于RAPD分析的20個(gè)菌株之間的遺傳距離Fig.3 Ggenetic distance of 20strains based on RAPD markers

2.3 大麥親本抗性評(píng)價(jià)

用甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院麥類(lèi)實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的強(qiáng)致病性麥類(lèi)核菌（P.graminea）菌株QWC對(duì)30個(gè)大麥材料進(jìn)行苗期抗大麥條紋病鑒定（表5）［22］。試驗(yàn)未篩選出免疫（I）及高抗品種（HR），篩選得到抗病品種（R）為5 個(gè)，分別為‘J04970’‘Z200V038V’‘Z1450008W’‘Z1’和‘甘啤6 號(hào)’，均具有一定的抗病能力，感病率為5%～15%，在30份供試品種中占到16.67%；品種 ‘P002-3’‘2039040Q’‘TRADITION’‘Z040P111Q’‘Isotta’和‘Z02751407’的感病率均＞40%，屬于高感品種（HS），占供試品種數(shù)的20%；其余19個(gè)感病品種（S）的感病率不盡相同，抗大麥條紋病能力存在一定差異性，感病率介于15%～40%。在供試的30份大麥親本材料中，抗病性結(jié)果表現(xiàn)出較大差異，品種‘甘啤6號(hào)’感病率為10.84%，對(duì)菌株QWC 的抗性最好，品種 ‘Isotta’的抗病能力最差，感病率達(dá)到73.53%。

表5 大麥親本抗性鑒定Table 5 Resistant identification of barley varieties

3 討論與結(jié)論

3.1 不同地理位置菌株遺傳多樣性分析

Jawhar等［13］和 鄭 果［24］采 用RAPD 分 子 標(biāo)記技術(shù)研究麥類(lèi)核菌（P.graminea）菌株的遺傳多樣性時(shí)，篩選到的RAPD 多態(tài)性引物分別只有2條和9 條，本試驗(yàn)篩選出30 對(duì)多態(tài)性引物，RAPD 引物篩選的越多，不同地理位置麥類(lèi)核菌的遺傳差異性表現(xiàn)越明顯。在Bakonyi等［25］的相關(guān)研究中，遺傳相似系數(shù)（GS）為0.868 0～0.976 0，本試驗(yàn)中GS為0.624 1～0.936 5，與之相比范圍更廣，更好地揭示了麥類(lèi)核菌（P.graminea）菌株間遺傳差異性。

通過(guò)優(yōu)化后的RAPD 擴(kuò)增體系進(jìn)行試驗(yàn)，共獲得63條多態(tài)性條帶。在遺傳相似系數(shù)（GS）為0.716 6時(shí)將供試的20個(gè)菌株劃分為4類(lèi)，其中菌株HZ和QWC、菌株QQ 和SW 之間的遺傳相似系數(shù)（GS）均為0.936 5，20個(gè)供試菌株間遺傳相似性最高，且它們地理位置各不相同，但共同聚為一類(lèi)。菌株SW 和QWC，菌株HZZ和SW，菌株SSB和HZ之間的地理位置均相隔較遠(yuǎn)，但遺傳距離均較小，僅有0.069 9、0.065 3和0.088 0。同時(shí)也存在地理位置接近遺傳距離小和地理位置遠(yuǎn)遺傳距離大的菌株，例如菌株CJZ和SW，菌株XTB和YC。因此得出不同地區(qū)所分離的麥類(lèi)核菌菌株間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與地理差異無(wú)明顯相關(guān)性，與司二靜等［22］運(yùn)用ISSR 方法分析結(jié)果相一致。李登輝等利用8 對(duì)AFLP 選擇性引物組合對(duì)19份麥類(lèi)核菌進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，試驗(yàn)菌株劃分為4個(gè)類(lèi)群，相似系數(shù)（GS）為0.83，同樣得出菌株間遺傳距離的遠(yuǎn)近與其地理分布無(wú)明顯規(guī)律［26］。

綜合RAPD 分析結(jié)果得出甘肅河西地區(qū)麥類(lèi)核菌菌株間有較大遺傳差異，但菌株遺傳特性與地理分布區(qū)域無(wú)明顯相關(guān)性。菌株間之所以存在較大遺傳差異，推測(cè)可能與河西不同地區(qū)的海拔、光照、溫度、濕度等環(huán)境因素造成的遺傳變異有關(guān)。條紋病菌株遺傳特性與地理位置無(wú)明顯相關(guān)性，可能與大麥條紋病的是種傳病害的特性有關(guān)，其病原菌-麥類(lèi)核菌（P.graminea）的菌絲不存在胚中，它在果皮薄壁細(xì)胞之間的種子中存活，在果殼和種皮中生長(zhǎng)［27-28］，不同地理位置所分離的麥類(lèi)核菌聚為一類(lèi)的原因可能是種子帶菌傳播所致。

3.2 大麥親本抗性評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)采用強(qiáng)致病性菌株QWC 鑒定30 個(gè)大麥品種的苗期抗病性，結(jié)果表明，同一麥類(lèi)核菌（P.graminea）菌株侵染不同大麥親本材料，大麥條紋病抗性差異較大，與Bayraktar等［15］的相關(guān)研究結(jié)果相似。本研究中，鑒定篩選出6份高感品種、19份感病品種和5 份抗病品種，抗大麥條紋病品種分別為‘1J04970’‘甘啤6 號(hào)’‘Z200V038V’‘Z1450008W’和‘Z1’。所有供試材料中，‘甘啤6 號(hào)’感病率為10.84%，對(duì)菌株QWC 的抗性最好，‘Isotta’的抗病能力最差，感病率達(dá)到73.53%，共同組成大麥條紋病的抗感組合。Mueller等［16］采用自然侵染和“夾心法”侵染兩種方式鑒定610份大麥材料的大麥條紋病抗性，發(fā) 現(xiàn) 品 種‘HOR 333’‘HOR 11475’‘OU J362’和‘BGRC 5592’在兩種方式中都顯示出抗性。吳寬然［29］鑒定115份大麥品種的抗性，得到抗性品種31 份、中抗24 份、中感54 份、高感7份，其中二棱品種的平均感病率較六棱品種高。張萬(wàn)霞等［30］鑒定191份大麥材料，抗條紋病品種89份，其中‘單2’‘單6’和‘Harrington’農(nóng)藝性狀優(yōu)良，具有較好的利用前景。孫立軍等［31］篩選優(yōu)異大麥種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)‘豫大麥1號(hào)’‘東陽(yáng)三月黃’‘烏米大麥’等品種，國(guó)外‘Konal’‘ZF2262’‘崗12’等品種對(duì)大麥條紋病都具有良好抗性。本試驗(yàn)未篩選到免疫及高抗品種，可能由于試驗(yàn)品種數(shù)量較少，菌株類(lèi)型單一，后期將選擇較多大麥品種材料和強(qiáng)致病性菌株進(jìn)行抗性鑒定，篩選出更加優(yōu)良的大麥條紋病抗感品種組合，為大麥條紋病病害的防控，抗性育種及病原菌研究奠定基礎(chǔ)。