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      基于細(xì)菌表面展示技術(shù)的豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病二聯(lián)亞單位疫苗的小鼠保護(hù)效果評價

      2020-06-05 04:34:22徐盛奎王春來
      關(guān)鍵詞:活苗二聯(lián)菌體

      趙 謙,龔 俊,欒 天,徐盛奎,李 剛,王春來

      (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150069)

      豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病分別是由豬鏈球菌(Streptococcus suis, SS)和副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)引起的豬呼吸道細(xì)菌性傳染病,臨床上多發(fā)生混合感染,也是仔豬常見的細(xì)菌性傳染病[1-2]。疫苗預(yù)防是無抗養(yǎng)殖中防控這兩種細(xì)菌病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。但兩種細(xì)菌血清型眾多,滅活苗大多只對同源菌株有保護(hù)效果[4]。因此,拓展新的疫苗研究策略顯得尤為重要。

      Fe3+ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體底物結(jié)合蛋白(AfuA)[5]、寡肽結(jié)合蛋白A(OppA)、寡肽結(jié)合蛋白A2(OppA2)[6]與細(xì)菌的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),這些轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白具有良好的免疫原性。革蘭氏陰性致病菌中的CdtB 是細(xì)胞致死膨脹毒素(CDT)全毒素的催化亞基。本實驗室前期將HPS 的這4 種蛋白進(jìn)行原核表達(dá)純化后免疫小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗,進(jìn)一步確定rAfuA、rCdtB、rOppA、rOppA2 對HPS 均具有良好的保護(hù)效果,是HPS 亞單位疫苗候選抗原蛋白[7-9]。溶菌酶釋放蛋白(MRP)存在于豬鏈球菌菌體表面[10],溶血素(SLY)分泌于上清中[11],二者均是SS 重要的保護(hù)性抗原,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,使免疫動物達(dá)到完全的保護(hù)。

      INP 展示系統(tǒng)能將分子量較大的蛋白展示于菌體表面,而菌體自身的佐劑效應(yīng)能誘發(fā)表面暴露的異源性抗原所引起的特異性免疫反應(yīng),使細(xì)菌表面展示的抗原蛋白能更好地被免疫系統(tǒng)識別[12-13]。因此,本研究利用含INP 的表面展示質(zhì)粒,將AfuAOppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY 分別展示于E. coil BL21(DE3)的菌體表面,制備了豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病二聯(lián)亞單位疫苗,并以小鼠為模型進(jìn)行了初步的免疫保護(hù)效力評價。

      1 材料與方法

      1.1 菌株、載體及實驗動物 E. coli DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自Tiangen Biotech(Beijing)公司;HPS 血清5 型分離株HN10、血清13 型分離株ZD12 及SS 血清2 型分離株M126、血清9 型分離株GZ2 均由本實驗室臨床分離并保存;pET28a-AfuA、pET28a-OppA、pET28a-OppA2、pET22b-CdtB、pET28a-MRP、pET28a-SLY 及表面展示質(zhì)粒pMD-28a-INPHis 均由本實驗室構(gòu)建并保存;rAfuA、rCdtB、rOppA、rOppA2、rMRP、rSLY 重組蛋白均由本實驗室前期制備并保存;4 周齡SPF 級KM 小鼠購自遼寧長生生物科技有限公司。

      1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 ISA 201 佐劑購自Seppic公司;PrimerSTAR Max DNA Polymerase、ExTaq DNA Polymerase、DNA 和 蛋 白Marker 購 自TaKaRa 公 司;One Step Cloning Kit 購自Vazyme 公司;DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、鼠抗His 抗體、山羊抗鼠IgG-HRP 購 自O(shè)MEGA 公 司;Dylight 680 標(biāo) 記 的 山 羊抗鼠IgG 購自KPL 公司;增強(qiáng)型DAB 底物顯色試劑盒購自Tiangen Biotech(Beijing)公司;細(xì)胞因子IL-2、IL-4 和IFN-γ檢測試劑盒均購自CLOUD-CLONE 公司。免疫電鏡委托哈爾濱獸醫(yī)研究所電鏡室完成。引物合成和測序工作均由吉林庫美生物公司進(jìn)行。Linker 序列由通用生物公司合成并克隆至pUC57質(zhì)粒。

      1.3 表面展示載體的構(gòu)建及表面展示結(jié)果的鑒定

      1.3.1 引物設(shè)計 接頭Linker 是將兩個蛋白序列隔開的GGGGS 的3 次重復(fù)的序列,其兩端接頭需要與蛋白兩端的堿基序列互補(bǔ)。用于克隆的線性化載體要以pMD-28a-INP-His 質(zhì)粒為基礎(chǔ)反向擴(kuò)增使其線性化,兩端序列也需要與兩側(cè)所連接蛋白的末端堿基序列互補(bǔ)。根據(jù)GenBank 中HPS 基因序列(NC_011852.1)和SS 的基因序列(LS483418.1),設(shè)計用于構(gòu)建pMD-INP-CdtB-OppA、pMD-INP-AfuA-OppA2、pMD-INP-MRP、pMD-INP-SLY 所需的引物序列(表1)。引物由吉林庫美生物公司合成。

      表1 引物列表Table 1 Primers in this study

      1.3.2 4 個表面展示載體的構(gòu)建及測序鑒定 分別以本實驗室前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-AfuA、pET28a-OppA、 pET28a-OppA2、 pET22b-CdtB、 pET28a-MRP、pET28a-SLY、pUC57-Linker 質(zhì)粒為模板,分別利用表1 中1 至14 引物PCR 擴(kuò)增目的基因afuA、cdtB、oppA、oppA2、mrp、sly 及l(fā)inker for afuA-oppA2、linker for cdtB-oppA,切膠回收后以afuA、cdtB、oppA、oppA2、linker 為模板進(jìn)行融合PCR,分別構(gòu)建afuA-oppA2、cdtBr-oppA融合片段。再以pMD-28a-INP-His為模板按照表1 中14 至24 引物分別反向擴(kuò)增afuA-oppA2、cdtB-oppA、mrp、sly 線性化載體序列,并利用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。參照DNA 聚合酶Primer-STAR Max DNA Polymerase 的說明書,本實驗中所有PCR 反應(yīng)條件均為:95 ℃10 s,55 ℃10 s,72 ℃30 s。隨后采用一步連接試劑盒將afuA-oppA2、cdtB-oppA、mrp、sly 分別與各自載體連接,并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,再將其涂布于LB平板(含100 μg/mL氨芐青霉素),進(jìn)行抗性篩選。次日挑取單克隆接種到含氨芐的LB 液體中37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h 后提取質(zhì)粒,由吉林庫美生物公司測序,將測序驗證正確的4 個重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,利用氨芐抗性篩選陽性克隆保種。

      1.3.3 4 個重組蛋白表面展示效果的檢測 挑取陽性重組菌pMD-INP-AfuA-OppA2/BL21(DE3)、pMDINP-CdtB-OppA/BL21(DE3)、pMD-INP-MRP/BL21(DE3)、pMD-INP-SLY/BL21(DE3)單菌落于肉湯LB(含100 μg/mL 氨芐青霉素)中震蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 于37 ℃誘導(dǎo)4 h,收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE,以鼠抗His 抗體(1∶2 000)為一抗,Dylight 680 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶15 000)為二抗,western blot 鑒定重組蛋白的表達(dá)。并將菌體送樣,以鼠抗His 抗體(1∶2 000)為一抗,山羊抗鼠IgG(10 nm colloidal gold)為二抗,經(jīng)免疫電鏡觀察重組蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY 在細(xì)菌細(xì)胞膜的定位情況。

      1.4 表面展示亞單位疫苗的制備 分別挑取重組菌pMD-INP-AfuA-OppA2/BL21(DE3)、pMD-INPCdtB-OppA/BL21(DE3)、pMD-INP-MRP/BL21(DE3)、pMD-INP-SLY/BL21(DE3)的單菌落接種至肉湯LB(含100 μg/mL 氨芐青霉素)的液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6 時開始計時,加入誘導(dǎo)劑IPTG 誘導(dǎo)4 h 后收集菌體,加入終濃度為1.5‰的甲醛滅活。由于表面展示的rAfuA-OppA2、rCdtB-OppA、rMRP、rSLY 均融合表達(dá)His 標(biāo)簽,取本實驗室前期純化的已知濃度的帶有His 標(biāo)簽的蛋白rOppA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,以鼠抗His 抗體(1∶2 000)為一抗,Dylight 680 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶15 000)為 二抗,對標(biāo)準(zhǔn)品和4 種菌懸液進(jìn)行western blot 鑒定,用ImageJ 軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析,間接得出表面展示的rAfuA-OppA2、rCdtB-OppA、rMRP、rSLY 這4 種蛋白的濃度。最后將菌液與ISA 201VG 按照等質(zhì)量比混合并乳化后制備表面展示二聯(lián)亞單位疫苗。

      1.5 小鼠免疫實驗 選用SPF 級KM 小鼠160 只,隨機(jī)分為4 組,每組40 只。按照表2 的免疫方案免疫小鼠。第一次免疫后間隔14 d 二次免疫,免疫途徑和劑量與第一次免疫相同。在二次免疫14 d 后對小鼠經(jīng)斷尾采血,分離血清。

      1.6 小鼠血清中抗體效價檢測 將本實驗室前期純化的重組蛋白rAfuA、rCdtB、rOppA、rOppA2、rMRP 和rSLY 分別用包被緩沖液(0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3,PH 9.6)稀釋至2 μg/mL 后包被ELISA 板,200 μL/孔,4 ℃過夜包被。按照本實驗室建立的間接ELISA 方法,以上述二免14 d 后分離獲得的4 組小鼠血清為一抗,山羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)為二抗,分別檢測小鼠血清中AfuA、CdtB、OppA、OppA2、MRP 和SLY 的抗體滴度。

      表2 免疫方案Table 2 Immunization program

      1.7 小鼠血清中細(xì)胞因子水平檢測 采用細(xì)胞因子ELISA 試劑盒分別檢測二免14 d 后分離獲得的4 組小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ 的水平,測定其OD450nm,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中各因子含量。

      1.8 小鼠攻毒實驗 將包含對照組在內(nèi)的4 個免疫組中每組40 只小鼠隨機(jī)再分為4 組,每組10 只,分別用新鮮培養(yǎng)的HPS 血清5 型分離株HN10 和血清13 型分離株ZD12、SS 血清2 型分離株M126 和血清9型分離株GZ2 經(jīng)腹腔注射攻毒。根據(jù)本實驗室前期動物試驗結(jié)果,HN10、ZD12、M126、GZ2 菌株的小鼠攻毒劑量分別為2.5×109cfu/只、5.0×108cfu/只、1.5×108cfu/只和5.0×107cfu/只。觀察一周內(nèi)小鼠的死亡情況。

      2 結(jié) 果

      2.1 表面展示載體的構(gòu)建及表達(dá)情況檢測 對pMDINP-AfuA-OppA2、 pMD-INP-CdtB-OppA、 pMD-INPMRP、pMD-INP-SLY 4 個重組表面展示載體質(zhì)粒進(jìn)行序列測定,測序結(jié)果與各基因序列的符合率為100%,表明目的基因AfuA-OppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY 已克隆到表面展示載體中。Western blot結(jié)果顯示空載體的表達(dá)菌BL21(DE3)無His 標(biāo)記,4種含有重組表面展示載體的表達(dá)菌BL21(DE3)均帶有His 標(biāo)記(圖1)。由于重組蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY 在3'末 端 均 連 接 有His 標(biāo)簽,結(jié)果表明AfuA-OppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY能在BL21(DE3)中表達(dá)。

      圖1 重組菌株自誘導(dǎo)后的western blot 檢測Fig.1 The western blot detection of self-induced recombinant strain

      2.2 重組蛋白在細(xì)胞膜的定位檢測 免疫電鏡實驗結(jié)果顯示,空載體的BL21(DE3)菌體表面未出現(xiàn)膠體金顆粒,4 種含有重組表面展示載體的E. coli BL21(DE3)菌體表面均出現(xiàn)膠體金顆粒(圖2)。但免疫電鏡結(jié)果并不能確定蛋白在膜上的表達(dá)豐度,只能直觀得出本實驗構(gòu)建的重組表面展示載體能將外源蛋白AfuA-OppA2、CdtB-OppA、MRP、SLY 展示至菌體表面。

      2.3 抗體滴度檢測 分離二免14 d 的小鼠血清,利用間接ELISA 檢測血清中AfuA、CdtB、OppA、OppA2、MRP 和SLY 的抗體滴度。結(jié)果顯示,表面展示二聯(lián)亞單位疫苗刺激小鼠產(chǎn)生的6 種抗體水平均稍低于或與純化蛋白亞單位疫苗無顯著差異,HPS-SS 滅活苗刺激小鼠產(chǎn)生的6 種抗體水平顯著低于表面展示二聯(lián)亞單位疫苗和純化蛋白亞單位疫苗(p<0.05)(圖3)。表明表面展示二聯(lián)亞單位疫苗能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體。

      圖2 免疫電鏡觀察重組蛋白在菌體外膜的定位情況Fig.2 Location of recombined proteins outer membrace

      圖3 免疫小鼠不同蛋白的ELISA 抗體滴度檢測(**:p<0.05)Fig.3 ELISA antibody titers test of different proteins(**:p<0.05)

      2.4 細(xì)胞因子水平檢測 應(yīng)用細(xì)胞因子檢測試劑盒檢測各個免疫組小鼠血清中細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示,表面展示二聯(lián)亞單位疫苗免疫組、純化蛋白亞單位疫苗免疫組和滅活苗免疫組的小鼠血清中均含有IL-2、IL-4 和IFN-γ,滅活苗組小鼠血清中IL-4 含量顯著高于其余兩組,而3 個實驗組血清中IL-2、IFN-γ的含量無顯著差異(P>0.05),表面展示二聯(lián)亞單位疫苗產(chǎn)生的IL-4 和IFN-γ稍高于純化蛋白疫苗(圖4)。表明表面展示二聯(lián)亞單位疫苗在刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子能力方面與純化蛋白亞單位疫苗相當(dāng)。

      2.5 攻毒實驗結(jié)果 用致死劑量的HPS 血清5 型分離株HN10 和血清13 型分離株ZD12、SS 血清2 型分離株M126 和血清9 型分離株GZ2 攻毒后,結(jié)果顯示,PBS 對照組小鼠分別在攻毒后2 d、3 d、1 d、4 d 內(nèi)全部死亡,表面展示二聯(lián)亞單位疫苗對小鼠保護(hù)率分別為80%、80%、50%、80%,純化蛋白亞單位疫苗對小鼠保護(hù)率分別為90%、60%、100%、80%,滅活苗對小鼠保護(hù)率分別為80%、60%、50%、60%(圖5)。表面展示二聯(lián)亞單位疫苗對HN10、ZD12、GZ2攻毒的小鼠保護(hù)率與純化蛋白亞單位疫苗的保護(hù)率相當(dāng),且均優(yōu)于滅活苗組。表面展示二聯(lián)亞單位疫苗對SS 分離株M126 的保護(hù)效果一般,低于純化蛋白亞單位疫苗,但與滅活苗保護(hù)效果相當(dāng)。表明表面展示二聯(lián)亞單位疫苗免疫保護(hù)力較好,但對不同分離株免疫保護(hù)力有所不同。

      圖4 各試驗組細(xì)胞因子水平檢測(**:p<0.05)Fig.4 Detection of cytokine levels in each group(**:p<0.05)

      圖5 攻毒試驗結(jié)果Fig.5 Results of immune protection test

      3 討 論

      SS 和HPS 血清型眾多,型間交叉保護(hù)效果差,目前SS 和HPS 二聯(lián)疫苗更傾向于亞單位疫苗的研發(fā)。但是目前市場上并沒有商品化的基于細(xì)菌表面展示的針對豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病的商品化的亞單位疫苗。蛋白亞單位疫苗所含抗原的免疫原性強(qiáng),但刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)弱于滅活苗,在實際使用中通常需要進(jìn)行多次免疫以達(dá)到或維持相應(yīng)的免疫水平?;诒砻嬲故镜膩唵挝灰呙鐚⒌鞍渍故居诰w表面,作為展示平臺的大腸桿菌菌體也可以作為強(qiáng)烈的免疫刺激分子,使抗原蛋白能更好地被機(jī)體識別,促進(jìn)所展示的抗原蛋白被免疫細(xì)胞識別。

      本研究評價了表面展示二聯(lián)亞單位疫苗對HPS和SS 分別攻毒的小鼠的保護(hù)效果,同時設(shè)立了相關(guān)蛋白的純化蛋白亞單位疫苗組、HPS-SS 滅活苗組和對照組。從結(jié)果來看,表面展示二聯(lián)亞單位疫苗刺激小鼠產(chǎn)生的AfuA、CdtB、OppA、OppA2 的抗體滴度基本與純化蛋白亞單位疫苗持平,均優(yōu)于滅活苗。表面展示二聯(lián)亞單位疫苗刺激小鼠產(chǎn)生的IL-4水平稍高于純化蛋白亞單位疫苗,這是由于除了展示于菌體表面的外源蛋白外,作為展示平臺的E. coli BL21(DE3)的菌體也能激發(fā)小鼠的體液免疫。由于HPS-SS 滅活苗中含有大量的菌體抗原,該組小鼠體內(nèi)IFN-γ水平高于其它兩組。表面展示二聯(lián)亞單位疫苗由于除所展示的蛋白外,還含有滅活的菌體,因此相比于純化蛋白免疫組也能刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的IFN-γ。從免疫攻毒實驗結(jié)果來看,表面展示二聯(lián)亞單位疫苗對SS 2 型和副HPS 5 型菌株攻毒小鼠的保護(hù)效果稍弱于傳統(tǒng)的純化蛋白亞單位疫苗。但是相對于傳統(tǒng)的純化蛋白亞單位疫苗來說,基于細(xì)菌表面展示的亞單位疫苗制備過程簡單,只需將菌體滅活即可,省去了蛋白純化的步驟,簡化了生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)成本,有著巨大的商品化潛力。

      以上結(jié)果表明,基于表面展示的豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病二聯(lián)亞單位疫苗能激發(fā)小鼠的強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),表明本研究中制備的表面展示二聯(lián)亞單位疫苗對HPS 和SS 具有良好的保護(hù)效果。本研究為豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病新型亞單位疫苗的研發(fā)提供了新思路。

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