霍 娜，金忠元，衛(wèi)巧林，王文彬，牟素菁，李永山，陳鴻軍，蕭 颯*

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一種高致病性禽類(lèi)病毒性疾病，主要引起呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的烈性傳染病之一[1]。根據(jù)NDV 全基因組的遺傳進(jìn)化分析，可以將NDV 分為ClassⅠ和Class Ⅱ兩個(gè)不同類(lèi)別[2]。近年來(lái)，Class Ⅱ的基因Ⅶ型病毒在歐洲、非洲、中東、南美和亞洲等地區(qū)引起了新城疫暴發(fā)，成為了主要流行的基因型[3]。

病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）具有3 種功能：受體結(jié)合、神經(jīng)氨酸酶（NA）及參與融合蛋白（F）的促膜融合活性，在病毒侵入宿主細(xì)胞及其致病力中均起著關(guān)鍵作用[4]。此外，HN 蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是重要的宿主保護(hù)性抗原[5]。早期研究顯示HN 蛋白分子表面有7 個(gè)連續(xù)重疊的抗原位點(diǎn)，即位點(diǎn)1（aa345）、位點(diǎn)2（aa513、aa514、aa521、aa569）、位 點(diǎn)3（aa263、aa287、aa321）、位 點(diǎn)4（aa332、aa333、aa356）、位點(diǎn)12（aa494、aa516）、位點(diǎn)14（aa347、 aa350、 aa353）和 位 點(diǎn)23（aa193、aa194、aa201）[6]。其中，針對(duì)位點(diǎn)2、12、23 的單克隆抗體（MAb）可以抑制病毒的NA 活性，以上3 個(gè)位點(diǎn)及針對(duì)位點(diǎn)1 和14 的MAb 可以抑制病毒的HA活性，并且對(duì)病毒具有中和活性[7]。除此，位點(diǎn)14為線性表位，其余均為構(gòu)象表位[6]。

本研究以基因Ⅶ型NDV JS/17 病毒株的HN 重組蛋白和活病毒分別免疫BALB/c 小鼠，制備了3 株針對(duì)HN 蛋白的特異性MAb，并對(duì)其免疫學(xué)特性及抗原表位進(jìn)行了鑒定，為HN 蛋白的功能研究提供了重要工具。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 NDV 基因Ⅶ型病毒株chicken/Jiangsu/17/2006（簡(jiǎn)稱(chēng)：JS/17）分離于2006 年江蘇省的發(fā)病雞群。Class Ⅱ類(lèi)NDV 基因Ⅱ型La Sota 株、基因Ⅵ型SX10 株和基因Ⅸ型F48E9 株及ClassⅠ類(lèi)NDV QH-1 株由本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA3-NP、pcDNA3-P、pcDNA3-M、pcDNA3-F、pcDNA3-HN 和pcDNA3-L質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；pET30a（+）載體、小鼠骨髓瘤SP2/0 細(xì)胞系、雞成纖維細(xì)胞系DF-1 由本實(shí)驗(yàn)保存；HT、HAT 培養(yǎng)基添加劑及PEG4000 融合劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG 購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司；JS/17 株雞多抗血清由本實(shí)驗(yàn)制備；AlexaFluor?594 標(biāo)記的羊抗鼠IgG、FITC 標(biāo)記的兔抗雞IgY 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；His 標(biāo)簽純化樹(shù)脂和親和層析柱購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；MAb 亞類(lèi)鑒定試劑盒購(gòu)自Southern biotech 公司；6 周齡BALB/c 小鼠（20±2 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 HN蛋白的原核表達(dá)及純化 根據(jù)JS/17病毒株的HN 蛋白結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增其胞外區(qū)（aa48～aa571）基因片段的引物，序列為F：5'-CGCGGATCC GGGGCCAGTACGCCGCACGACC-3'/R：5'-GCCCTCGA GAACTCTATCATCCTTGAGG-3'。利用TRIzol 試劑提取JS/17 病毒基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后作為模板，利用上述特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。膠回收目的片段克隆至pET30a（+）載體，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-HN。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定正確后由蘇州金唯智公司測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)HN 重組蛋白的表達(dá)情況。利用His 標(biāo)簽純化HN 重組蛋白并檢測(cè)純化效果。

1.3 MAb 的制備及鑒定 以重組蛋白HN（50 μg/只）和JS/17 株活病毒（107TCID50/只）分別免疫BALB/c小鼠。免疫方案為：抗原與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化后，腹腔注射；7 d 后二免，免疫途徑同一免，佐劑用不完全弗氏佐劑；14 d 后三免，不加佐劑，腹腔注射。19 d 后經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采血，采用ELISA 法[8]測(cè)定多抗血清效價(jià)。對(duì)抗體滴度高的小鼠加強(qiáng)免疫1 次，3 d 后取陽(yáng)性小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合。以JS/17 病毒株為檢測(cè)抗原，分別采用ELISA、間接免疫熒光（IFA）和westen blot（WB）篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。這3 種方法的一抗均為待檢雜交瘤細(xì)胞上清，其中，ELISA 和WB 的二抗為羊抗鼠HRP-IgG（1∶5 000），IFA 的二抗為Alexa Fluor?594標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1 000），同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（小鼠多抗血清）和陰性對(duì)照（SP2/0 細(xì)胞上清）。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆純化，直至篩選出穩(wěn)定分泌高抗體水平的單克隆細(xì)胞株，并制備小鼠腹水。具體步驟參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。為明確獲得的MAb 結(jié)合的NDV 蛋白，將各病毒蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，即pcDNA3-NP、pcDNA3-P、pcDNA3-M、pcDNA3-F、pcDNA3-HN 和pcDNA3-L 按 照Turbofect 說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染至BHK-21 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染30 h 后，甲醇固定細(xì)胞，以MAb（1∶2 000）為一抗，Alexa Fluor?594 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1 000）為二抗，IFA 檢測(cè)MAb 與各病毒蛋白的反應(yīng)性。

1.4 MAb 的生物學(xué)特性分析 分別以10 倍倍比稀釋?zhuān)?02～107）的MAb 作為一抗，測(cè)定MAb 的ELISA、IFA、WB 和HI 效價(jià)，方法同1.3。并采用病毒中和試驗(yàn)（VN）測(cè)定MAb 的中和活性，步驟如下：將MAb 10 倍倍比稀釋后，再按2 倍倍比稀釋?zhuān)謩e與MOI 0.1的JS/17株震蕩混勻，于37 ℃孵育2 h，接種至DF-1 細(xì)胞。感染24 h 后，甲醇固定細(xì)胞，以JS/17雞多抗血清（1∶1 000）為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的兔抗雞IgY（1∶1 000）為二抗，IFA 方法檢測(cè)病毒感染情況。采用軟件Image 進(jìn)行熒光強(qiáng)度的定量分析，以50%抑制病毒感染的MAb 稀釋度為中和活性測(cè)定值。此外，采用MAb 亞類(lèi)鑒定試劑盒對(duì)獲得的MAb進(jìn)行亞型鑒定，具體步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5 MAb 與不同NDV 分離株的交叉反應(yīng)性檢測(cè)分別以La Sota、SX10、JS/17、F48E9 和QH-1 株病毒感染DF-1 細(xì)胞后，以MAb（1∶2 000）作為一抗，Alexa Fluor?594 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1 000）為二抗，采用IFA 方法檢測(cè)MAb 與不同株NDV 的交叉反應(yīng)性。

1.6 MAb 識(shí)別抗原表位的鑒定 根據(jù)HN 蛋白的結(jié)構(gòu)，將其N(xiāo) 或C 端截短，即HN 蛋白的N 端（aa48 起）不變，從C 端系列截短；或保持HN 蛋白的C 端不變，從N 端系列截短。合成相應(yīng)引物（表1），擴(kuò)增各截短的基因片段并克隆至pET30a（+）載體。以原核表達(dá)的重組截短蛋白為檢測(cè)抗原，MAb（1∶2 000）為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，WB 檢測(cè)MAb 可能識(shí)別的表位序列。

表1 擴(kuò)增HN蛋白各截短片段的引物序列Table 1 Primer sequences of each truncated fragment of HN protein

2 結(jié) 果

2.1 HN 蛋白胞外區(qū)的原核表達(dá)及純化 PCR 鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示，HN 基因已經(jīng)被正確插入到表達(dá)載體pET30a中，且方向正確閱讀框完整，無(wú)堿基突變，表明已正確構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a-HN。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)HN 重組蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在70 ku處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期一致（圖1）。該重組蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)His 純化，其純度約為70%，濃度為0.64 mg/mL。表明獲得了重組HN 蛋白。

圖1 重組HN 蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of recombinant protein pET30a-HN expression

2.2 MAb 的制備與鑒定結(jié)果 以原核表達(dá)的重組HN 蛋白為免疫原，經(jīng)ELISA、IFA 和WB 篩選獲得1株特異性MAb，命名為2G8。以JS/17株活病毒為免疫原，經(jīng)ELISA、IFA 和WB 篩選獲得2 株特異性MAb，分別命名為1D4 和4D9。1D4 和4D9 與轉(zhuǎn)染NDV 的各病毒蛋白質(zhì)粒pcDNA3-NP、pcDNA3-P、pcDNA3-M、pcDNA3-F、pcDNA3-HN 和pcDNA3-L 的BHK-21 細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示：2G8、1D4和4D9均能與pcDNA3-HN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞反應(yīng)，胞漿和細(xì)胞膜呈現(xiàn)紅色熒光，而與其它質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無(wú)反應(yīng)（圖2），表明MAb 2G8、1D4 和4D9 均特異性結(jié)合HN 蛋白。

2.3 MAb 的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果 采用ELISA、IFA、HI、WB 和VN 方法測(cè)定MAb 2G8、1D4 和4D9的效價(jià)。結(jié)果顯示，2G8 的ELISA 和IFA 效價(jià)均可達(dá)104，WB 效價(jià)可達(dá)1∶2 000，無(wú)HI 效價(jià)也無(wú)中和活性；1D4 和4D9 的IFA 效價(jià)可達(dá)105，HI 效價(jià)可達(dá)214，無(wú)WB 和ELISA 效價(jià)，二者均能夠中和JS/17 株病毒，中和效價(jià)為1280。表明MAb 2G8 能識(shí)別HN蛋白的線性抗原表位，無(wú)病毒中和活性，而MAb 1D4 和4D9 識(shí)別抗原的構(gòu)象表位并具有血凝抑制及病毒中和活性。MAb 亞類(lèi)鑒定試劑盒結(jié)果顯示2G8 的重鏈為IgG1 亞類(lèi)，輕鏈為kappa 鏈。由于MAb 1D4和4D9 無(wú)法用于ELISA 和WB 檢測(cè)，所以未得到亞類(lèi)鑒定結(jié)果。

2.4 MAb 與不同病毒的交叉反應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果 采用IFA 方法檢測(cè)該3 株MAb 與不同NDV 的反應(yīng)性。結(jié)果顯示：2G8 與所有受試病毒株均反應(yīng)，而1D4和4D9 與Class II 類(lèi)的La Sota、SX10、F48E9 病毒株發(fā)生特異性反應(yīng)，與ClassⅠ類(lèi)HQ-1 株不反應(yīng)（圖3）。表明MAb 2G8 可識(shí)別ClassⅠ和ClassⅡNDV，MAb 1D4 和4D9 僅識(shí)別ClassⅡNDV，而不能識(shí)別ClassⅠNDV。

圖2 MAb 的IFA 檢測(cè)結(jié)果（200×）Fig.2 Identification of MAb by IFA(200×)

圖3 MAb 與不同NDV 交叉反應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果（100×）Fig.3 Results of cross-reactivity of the MAb among different NDV strains(100×)

2.5 MAb 2G8 識(shí)別HN 抗原表位的鑒定結(jié)果 為了明確MAb 2G8 識(shí)別HN 的具體線性表位位點(diǎn)，本研究利用原核表達(dá)HN 蛋白的不同截短體及WB 方法對(duì)其抗原表位進(jìn)行鑒定。首先，從HN 蛋白C 端截短，經(jīng)原核表達(dá)的4 個(gè)截短蛋白均能夠與MAb 2G8反應(yīng)（圖4A、4D）。表明2G8 識(shí)別的抗原區(qū)域位于aa48～aa228；再?gòu)腍N 蛋白的N 端截短，WB 結(jié)果顯示，2G8 僅與aa123～aa571 截短體蛋白特異性結(jié)合（圖4B、4E）。表明MAb 2G8 識(shí)別的抗原區(qū)域位于aa123～aa165。繼續(xù)截短該區(qū)域，經(jīng)WB 結(jié)果顯示，MAb 2G8 僅與aa131～aa571 截短蛋白特異性結(jié)合（圖4C、4F）。結(jié)果表明：MAb 2G8識(shí)別HN蛋白的aa131～aa139，其序列為131DYIGGIGKE139。比對(duì)分析Gen-Bank 登錄的353 株不同病毒的HN 蛋白氨基酸序列，顯示表位131DYIGGIGKE139在不同的病毒株中均高度保守，僅有極個(gè)別病毒株存在氨基酸差異（表2）。表明，MAb 2G8 識(shí)別HN 蛋白高度保守的線性抗原表位131DYIGGIGKE139。

圖4 HN 截短體原核表達(dá)（A、B、C）和MAb 2G8 抗原表位鑒定結(jié)果（D、E、F）Fig.4 Prokaryotic expression of different HN truncated proteins(A,B,C)and epitope identification of MAb 2G8(D,E,F)

表2 MAb 2G8 識(shí)別的抗原表位在部分NDV 病毒株間的序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Comparison of the epitope recognized by the MAb 2G8 among the different strains of NDV

3 討 論

原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低、產(chǎn)量高的特點(diǎn)。所以，本研究利用該系統(tǒng)表達(dá)HN 蛋白作為免疫原進(jìn)行MAb 的制備。由于HN 蛋白是糖基化囊膜蛋白，原核表達(dá)的蛋白缺乏翻譯后修飾，影響蛋白的生物學(xué)活性。因此，本研究同時(shí)采用JS/17 株活病毒為免疫原進(jìn)行MAb 制備，該方法可以保留HN 蛋白的天然結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，以獲得更具功能性的HN MAb。

目前，已經(jīng)鑒定出NDV HN 蛋白的7 個(gè)重疊抗原位點(diǎn)中僅存在一個(gè)線性表位，即位點(diǎn)14（aa345～aa353），針對(duì)該位點(diǎn)的MAb 可以抑制病毒的NA 和HA 活性，其余抗原表位均為構(gòu)象表位[6-7]。此外，Li等使用酵母表面展示系統(tǒng)將NDV HN 蛋白劃分為4 個(gè)線性抗原區(qū)域：P1（aa2～aa52）、P2（aa5～aa192）、P3（aa193～aa303）和P4（aa304～aa571）。利用構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-P1、pVAX-P2、pVAX-P3 和pVAXP4 免疫雞攻毒后，僅pVAX-P2 免疫組有60%的SPF雞存活，其余3 個(gè)免疫組的SPF 雞均死亡。表明P2是HN 蛋白的保護(hù)性抗原區(qū)[10]。但是，中和位點(diǎn)14位于P4 抗原區(qū)域內(nèi)，而pVAX-P4 未對(duì)SPF 雞表現(xiàn)出保護(hù)性，具體原因有待進(jìn)一步探究。本研究獲得的MAb 2G8 識(shí)別線性表位為131DYIGGIGKE139，其在各NDV 病毒株中均高度保守。該表位位于P2 抗原區(qū)域內(nèi)，但無(wú)HI 及病毒中和活性。

有研究表明完全中和NDV 需要HN 蛋白中4 個(gè)不同中和位點(diǎn)的MAb 協(xié)同作用，才可使其中和水平與多抗血清相當(dāng)[11]。本研究結(jié)果顯示：以JS/17 株全病毒為免疫原獲得的MAb 1D4和4D9具有較好的中和活性，但無(wú)法完全中和病毒的感染，推測(cè)HN 蛋白存在不止一個(gè)抗原中和位點(diǎn)。其次，MAb 1D4 和4D9同時(shí)具有較好的血凝抑制作用，有研究顯示HN 蛋白的受體識(shí)別位點(diǎn)與抗原位點(diǎn)存在部分重疊[12]，由此推測(cè)HN 蛋白的中和活性與HA 活性緊密相關(guān)，即MAb 與HN 蛋白結(jié)合，阻礙了HN 結(jié)合細(xì)胞表面的唾液酸受體，抑制了病毒對(duì)細(xì)胞的感染。此外，有研究報(bào)道通過(guò)IFA 方法鑒定的HN MAb 2H7 能夠識(shí)別基因Ⅵ、Ⅶ及Ⅸ型病毒株，但不與基因I、Ⅱ型及Class I 病毒株反應(yīng)[13]。針對(duì)ClassⅠ病毒株的HNMAb3H7 和3H9 僅識(shí)別ClassⅠ病毒株，而不與ClassⅡ病毒株反應(yīng)[14]。本研究獲得的MAb 1D4 和4D9 與Class Ⅱ的基因Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型病毒株均可以發(fā)生特異性結(jié)合，但不識(shí)別ClassⅠ病毒株，表明該兩株MAb 具有鑒別ClassⅠ和ClassⅡNDV 的潛力，未來(lái)需增加病毒株尤其是ClassⅠ病毒株的數(shù)量以驗(yàn)證該兩株單MAb 的鑒別能力是否具有廣泛適用性。本研究制備的3 株MAb 為進(jìn)一步研究HN 蛋白的功能及對(duì)NDV 的鑒定提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。