孫思萌，侯美佳，馮啟崢，石 博，劉嘉利，師東方

（東北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

感染性腹瀉是引起幼畜死亡的主要疾病，由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）引起的仔豬黃痢和仔豬白痢、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）引起的豬水腫病和斷奶仔豬腹瀉嚴重影響仔豬健康[1-2]。ETEC 和STEC 通過菌毛（也稱為黏附素）黏附在宿主小腸絨毛上皮細胞，增殖并產(chǎn)生腸毒素（ST、LT）和志賀毒素變異體（Shiga toxin variantsⅡ，Stx2e），引發(fā)腹瀉、腸毒血癥，水腫和神經(jīng)癥狀[3-4]。菌毛能夠與宿主腸黏膜中的特異性受體結(jié)合使細菌能夠抵御腸道蠕動引發(fā)的沖刷作用，這是ETEC 致病的先決條件[5-6]。流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，大腸桿菌（E.coli）攜帶的黏附素基因與毒素基因呈正相關(guān)性，60%帶有毒素基因的E.coli 菌株均表達黏附素基因[7]。除黏附作用外，菌毛還具有其它生物學功能。研究表明，F(xiàn)4 菌毛蛋白可誘導Th17 相關(guān)基因的表達上調(diào)和B 細胞類別轉(zhuǎn)換，其主要亞基faeG 參與細菌生物膜的形成和細胞間的信號傳導——群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）[8-9]。因此，對幼畜腹瀉物中分離的E.coli 鑒定時，除檢測腸毒素基因外，同時也要對分離菌的菌毛基因進行檢測，有助于較全面地了解致病菌的生物學特性和流行病學溯源，對其致病機制和免疫機制研究也具有重要意義。

目前檢測E.coli 菌毛的方法有電子顯微鏡檢查法、D-甘露糖抵抗血凝與血凝抑制試驗、棉籽糖發(fā)酵試驗、細胞黏附試驗和免疫血清學技術(shù)及核酸探針技術(shù)[10]。由于菌毛分型較多，同型菌毛中還存在不同亞型，因此難以進行快速鑒別[11]。上述方法均存在費時費力、特異性低等缺陷，而且需要進行菌毛化培養(yǎng)。多重PCR 能夠通過一個反應(yīng)同時檢測多種微生物或檢測一種微生物的多個基因片段，具有成本低、操作簡單、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用。張興民等建立的檢測致山羊腹瀉的4種病原菌的多重PCR 方法，孟相秋等建立的檢測ETEC 4 種腸毒素基因的多重PCR 方法[12-13]，顯著提高了對目的基因的檢測效率。

本研究建立了可同時檢測ETEC 常見的F 抗原（菌毛）F4（K88）、F5（K99）、F6（987P）、F41 和STEC 常見的F18 等5 種菌毛基因的多重PCR 方法，為ETEC 和STEC 菌毛的鑒定提供一種有效的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 大腸桿菌參考菌株C83903（O141∶K85，K88ab）、C83915（O9∶K103，987P）、C83920（O101∶K30，K99、F41）、C83684（O139，F(xiàn)18）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；E. coli DN48A（F17）、DN77C（F18ac）以及90 株E.coli 由東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院獸醫(yī)傳染病學教研室從犢牛糞便中分離鑒定并保存；參考菌株豬霍亂沙門氏菌CVCC503、豬丹毒桿菌CVCC124、巴氏桿菌CVCC430 由東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院藥理與毒理學教研室張秀英教授提供。Trans 2k Plus ⅡMolecularMarker、10×loading buffer、EasyTaqDNA 聚合酶（5 U/μL）、10×EasyTaq buffer（含Mg2+）、dNTPs（2.5 mmol/mL）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank 中E.coli 菌毛基因保守序列設(shè)計5 對分別擴增E. coli F4、F5、F6、F41、F18 菌毛保守基因的特異性引物，由哈爾濱新海工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1），各引物工作液濃度為20 μmol/L。

1.3 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用煮沸法提取1.1中所有細菌的DNA[13]，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎?5 μL反應(yīng)體系進行PCR 擴增，以E. coli 參考菌株C83903、C83915、C83920、C83684 的DNA 及其等比例混合物為模板，無菌去離子水為陰性對照，對影響PCR 的EasyTaq 聚合酶濃度、dNTPs 濃度、退火溫度以及延伸時間等因素進行優(yōu)化。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以電泳條帶特異、清晰，引物二聚體最少的反應(yīng)條件為優(yōu)化的反應(yīng)條件。

表1 多重PCR 引物序列與靶基因擴增長度Table 1 Multiplex PCR primer sequencesand the length of the target genes

1.4 特異性試驗 取參考菌株E. coli C83903、C83915、C83920、C83684 及其混合物、E. coli 分離菌株DN48A、豬霍亂沙門氏菌CVCC503、豬丹毒桿菌CVCC124 以及巴氏桿菌CVCC430 的DNA 作為模板進行多重PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，評估該多重PCR 的特異性。

1.5 敏感性試驗 取37 ℃振搖過夜的參考菌株E. coli C83903、C83915、C83920、C83684 分別用滅菌生理鹽水做10-1～10-8連續(xù)稀釋，然后取各參考菌株不同稀釋度的菌液100 μL 涂布于LB 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h 后進行菌落計數(shù)。同時取上述不同稀釋度的菌液各1 mL 制備DNA 模板，檢測多重PCR 的敏感性，并與常規(guī)PCR 敏感性相比較。常規(guī)PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：反應(yīng)體系為25 μL，其中10×EasyTaq buffer（含Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/mL dNTPs 2.0 μL、不同菌毛基因的上下游引物（20 μmol/L）各1 μL 共2 μL、5 U/μL EasyTaq DNA 聚合酶0.5 μL、DNA 模板各1 μL。用滅菌去離子水補足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s、30 個循環(huán)；72 ℃7 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以檢測出菌毛基因所需的最低活菌數(shù)即為多重PCR 的檢測限。

1.6 重復(fù)性試驗 分別用3 個批次的EasyTaq buffer（含Mg2+）、dNTPs、EasyTaq DNA 聚合酶和上下游引物對參考菌株E. coli C83903、C83915、C83920、C83684 DNA 混合物進行多重PCR 檢測，每個批次做3 個重復(fù)，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定多重PCR 方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.7 臨床樣品檢測 實驗室前期以犢牛腹瀉糞便為樣品，于麥康凱瓊脂平板劃線分離E.coli，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取10～15 個粉紅色、表面光滑的圓形可疑菌落在麥康凱平板劃線純培養(yǎng)后，再經(jīng)生化鑒定和E.coli 持家基因（phoA）PCR 檢測，最終分離獲得90株E.coli。取上述90株E.coli分離株分別接種LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h 后取1 mL 菌液用煮沸法制備DNA 作為模板，利用本試驗建立的多重PCR 檢測E.coli 菌毛基因，并用常規(guī)PCR 檢測驗證。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié) 果

2.1 優(yōu)化的多重PCR 反應(yīng)條件 經(jīng)優(yōu)化后的多重PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：反應(yīng)體系為25 μL，其中10×EasyTaq buffer（含Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/mL dNTPs 2.0 μL、5種菌毛基因的上下游引物（20 μmol/L）各1 μL 共10 μL、5 U/μL EasyTaq DNA 聚合酶1 μL、提取的4 株E.coli 參考菌株的DNA 模板各1 μL。用滅菌去離子水補足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、60 ℃35 s、72 ℃90 s、30 個循環(huán)；72 ℃7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物電泳條帶清晰，大小分別為770 bp（F4）、533 bp（F5）、422 bp（F6）、643 bp（F41）、1 140 bp（F18），與預(yù)期大小一致。表明優(yōu)化后的反應(yīng)條件可同時擴增出5 種菌毛的特異性基因片段。

2.2 特異性試驗 特異性試驗結(jié)果顯示，本實驗建立的多重PCR 僅從E. coli 參考菌株C83903、C83920、C83915、C83684、DN77C的DNA模板中擴增出770 bp、533 bp 和643 bp、422 bp、1 140 bp、1 140 bp 的目的條帶，大小與預(yù)期一致，而從E.coli DN48A、豬霍亂沙門氏菌CVCC503、豬丹毒桿菌CVCC124、巴氏桿菌CVCC430 的DNA 模板中未擴增到目的條帶（圖1）。表明該多重PCR 具有較強的特異性。

2.3 敏感性試驗 對參考菌株E.coli C83903（F4）、C83915（F6）、C83920（F5、F41）、C83684（F18）不同菌液不同稀釋度菌落數(shù)在30～300 之間的平板進行菌落計數(shù)，當C83903、C83915菌液稀釋度為10-5時結(jié)果為53 cfu、31 cfu，當C83920、C83684 菌液稀釋度為10-6時結(jié)果為37 cfu、69 cfu，由此計算，各菌液中的活菌數(shù)分別為C83903：5.3×107cfu/mL、C83915：3.1×107cfu/mL、C83920：3.7×108cfu/mL、C83684：6.9×108cfu/mL。敏感性試驗結(jié)果顯示，本實驗建立的多重PCR 在5 種菌毛基因同時存在時對F41 基因的最小檢出活菌數(shù)為3.7×107cfu/mL；對F4、F5、F6和F18 基因的最小檢出活菌數(shù)分別為5.3×105cfu/mL、3.7×106cfu/mL、3.1×105cfu/mL、6.9×105cfu/mL（圖2，表2）。

圖1 多重PCR 特異性試驗結(jié)果Fig.1 The result of specificity test for the multiplex PCR method

圖2 多重PCR 敏感性試驗結(jié)果Fig.2 The result of sensitivity test for the multiplex PCR method

表2 多重PCR 敏感性試驗分組及結(jié)果Table 2 The groupings and results of sensitivity test for multiplex PCR system

常規(guī)PCR對F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的最小檢出活菌數(shù)分別為5.3×102cfu/mL、3.7×103cfu/mL、3.1 × 103cfu/mL、 3.7 × 104cfu/mL 和6.9 × 104cfu/mL（圖3）。上述結(jié)果表明本實驗建立的多重PCR 方法同時檢出5 種菌毛基因所需的活菌數(shù)最小為3.7×107cfu/mL。

圖3 常規(guī)PCR 敏感性試驗結(jié)果Fig.3 The results of sensitivity test for conventional PCR system

2.4 重復(fù)性試驗 利用同一批次和不同批次的引物和試劑對4 種參考菌株DNA 混合物的多重PCR 檢測結(jié)果顯示，均能擴增出與預(yù)期相符的特異性條帶（圖4），表明該檢測方法有很好的批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性。

2.5 臨床樣本檢測 采用建立的多重PCR 方法對90 株E.coli 分離株進行檢測，結(jié)果顯示，其中F4 陽性率為3.33%（3/90），F(xiàn)5 陽性率為2.22%（2/90），未檢測到F6、F41 和F18 陽性菌株，其試驗結(jié)果與常規(guī)PCR 檢測結(jié)果一致，表明該方法可用于E.coli 分離株菌毛基因的檢測。

圖4 多重PCR 重復(fù)性試驗結(jié)果Fig.4 The results of reproducibility test for the multiplex PCR method

3 討 論

多重PCR 是在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種可同時檢測多個目基因的方法，與常規(guī)PCR 技術(shù)相比，多重PCR 具有一次檢出多個目的基因、節(jié)約時間及實驗成本的優(yōu)點，但其體系更加復(fù)雜，可能存在多對引物之間形成引物二聚體；引物與非目的基因序列的結(jié)合產(chǎn)生非特異性擴增；延伸時間不足導致目的片段得不到充分的擴增；多重PCR 反應(yīng)產(chǎn)物在低濃度凝膠中電泳難以分離等問題[14]。本實驗通過BLAST 和GenBank 序列數(shù)據(jù)庫確定每條引物（共10 條）的特異性，通過梯度PCR 確定最適退火溫度使不同的目的基因片段均能被較好的擴增，同時延長延伸時間并增加體系內(nèi)DNA 聚合酶的量以確保充分擴增目的基因。F4 菌毛的引物在50 ℃～60 ℃時均能擴增出特異性條帶，而F5、F6、F41、F18 的引物在55 ℃～65 ℃能產(chǎn)生特異且單一的條帶，因此將多重PCR 退火溫度設(shè)定于60 ℃，與Casey 等檢測9種大腸桿菌毒力因子時所用延伸時間相同，退火時間略短，退火溫度高于其選擇的55 ℃以保證所有基因的特異性擴增[15]。段新華等建立的4 重PCR 方法，擴增的菌毛基因片段大小僅相差66 bp[16]，結(jié)果不易分辨，本實驗中各目的片段大小相差均超過100 bp，易于通過電泳分離。此外，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，組成K88 菌毛的faeG 基因1 bp～86 bp 的序列與F41 基因58 bp～146 bp 的序列相似性可達85%，段新華等設(shè)計的F41 上游引物即處于這段區(qū)域，本實驗設(shè)計引物時避開了這段序列，避免在多個模板同時存在時對引物產(chǎn)生干擾，發(fā)生非特異性擴增[16]。本實驗建立的多重PCR 方法檢測F41 菌毛基因的最小活菌數(shù)為3.7×107cfu/mL，敏感性明顯低于常規(guī)PCR，然而，經(jīng)37 ℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h 的E.coli菌液濃度即可達108cfu/mL，完全能夠滿足多重PCR的檢測要求。本實驗建立的E.coli 菌毛基因5 重PCR檢測方法的敏感性與華榮虹等建立的E.coli 菌毛基因4 重PCR 檢測方法的敏感性基本一致[17]。初步應(yīng)用本實驗建立的多重PCR 檢測方法對本實驗室前期從犢牛腹瀉糞便樣品中分離的90 株E.coli 分離株的菌毛基因進行了檢測，僅檢測到3 株E.coli 攜帶F4基因，2 株E.coli 攜帶F5 基因，沒有檢測到F6、F41和F18 基因。引起犢牛腹瀉的病因較多，僅病原微生物就有病毒、細菌和寄生蟲，從檢測結(jié)果分析，雖然E.coli 分離株均來自犢牛腹瀉糞便，但引起腹瀉的主要病原可能是病毒或寄生蟲。另外，攜帶F6基因的ETEC 主要引起仔豬腹瀉，攜帶F18 基因的STEC 主要引起仔豬水腫病和斷奶仔豬腹瀉，在犢牛腹瀉糞便中常檢測不到。

E.coli 菌毛種類繁多，某些菌毛又包含不同的亞型，因此用血清學方法鑒別較為困難。F18 菌毛由FedA、FedB、FedC、FedE、FedF 亞單位組成，該菌毛有兩種亞型，分別為F18ab 和F18ac。對F18ab 和F18ac 菌株fedE、fedF 基因的多樣性分析顯示，fedE 基因的序列具有高度保守性，fedF 基因在289 bp～518 bp 堿基序列之間具有高度保守性[18-19]，因此本研究根據(jù)fedE 和fedF 基因保守序列設(shè)計了引物，試驗證明所設(shè)計的引物對F18ab 和F18ac 型菌毛基因均能檢出。F4 菌毛由FaeA、FaeB、FaeC、FaeD、FaeE、FaeF、FaeG、FaeH、FaeI、FaeJ 共10 個亞單位組成，其可分為3 種亞型：F4ab、F4ac、F4ad。faeG 基因是F4 菌毛的主要結(jié)構(gòu)蛋白亞單位基因，直接參與和易感宿主腸上皮細胞大分子受體的特異性結(jié)合，任士飛等人對faeG 基因克隆分析后發(fā)現(xiàn)F4ab、F4ac 和F4ad 的faeG 序列存在2 處主要堿基序列差異，第1 處在304 bp～306 bp 堿基序列中，第2處在491 bp～499 bp 堿基序列之間[20]。本實驗在設(shè)計引物時避開了這兩處序列，而在faeG 基因兩端最保守的部分設(shè)計特異性引物，并利用Primer5 軟件和BLAST 比對GenBank 數(shù)據(jù)庫中大量菌毛基因的參考序列，證實了引物區(qū)的序列保守性以確保該引物能檢測F4 菌毛所有亞型的基因。

本實驗建立的多重PCR 方法能特異性擴增目的基因，并產(chǎn)生彼此差異超過100 bp 的擴增產(chǎn)物，可通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離，所有的陰性對照均未擴增出任何條帶，同時也表現(xiàn)出很好的敏感性和重復(fù)性。對90 株從犢牛糞便中分離的E.coli 的檢測表明該多重PCR 的檢測結(jié)果與常規(guī)PCR 的檢測結(jié)果完全相同，且該方法明顯提高了檢測效率，可以用于臨床檢測。該多重PCR 方法具有較好的特異性和敏感性，希望能在E.coli 快速分離鑒定、流行病學調(diào)查和疾病診斷中發(fā)揮作用。