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      鄰苯二甲酸二丁酯降解菌對煙草青枯病的抑制作用

      2020-06-06 08:41:38楊小瓊李春黎王昌軍孫敬國陳守文
      煙草科技 2020年4期
      關(guān)鍵詞:枯菌青枯病丁酯

      楊小瓊,余 君,周 文,李 程,李春黎,王昌軍,孫敬國,陳守文,楊 勇*

      1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢市武昌區(qū)友誼大道368 號 430062

      2.湖北省煙草科學(xué)研究院,武漢市硚口區(qū)解放大道618 號 430000

      3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長城雪茄煙廠,四川省什邡市鎣華山路南段128 號 618400

      煙草青枯病是煙葉生產(chǎn)中的主要病害之一[1-4]。目前對煙草青枯病的防治主要包括化學(xué)防治、生物防治和農(nóng)業(yè)防治等[3,5-10],長期施用化學(xué)農(nóng)藥不僅導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性等[11],而且抗病品種選育成功率低仍是農(nóng)業(yè)防治中關(guān)鍵性難題[12-13]。生物防治方法因其安全、無公害和長效等特點(diǎn)已成為煙草青枯病防治的研究熱點(diǎn)[3,14]。目前施用生物菌劑防治煙草青枯病已有較多研究報道[15-18],但煙草生產(chǎn)上青枯病并沒有得到有效的控制[19-20]。趙文宗等[21]研究表明,2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異辛酯等芳香族化合物添加后會顯著提高青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù);劉艷霞等[22]證實煙草根系分泌物中的苯甲酸、3-苯丙酸等酚酸類物質(zhì)有利于青枯菌在煙株根際定殖;李石力等[23]研究發(fā)現(xiàn),煙草根系分泌的有機(jī)酸通過增強(qiáng)青枯菌成膜基因的表達(dá),可促進(jìn)煙草青枯病的發(fā)生。可見,煙草根系分泌物中的芳香族或有機(jī)酸具有促進(jìn)青枯病發(fā)生的作用。另外,煙草根系分泌的阿魏酸、肉桂酸、苯甲酸、香草酸、對羥基苯甲酸等自毒物質(zhì)是煙草連作的障礙因子[24-28],而且連作土壤中阿魏酸及肉桂酸等化感自毒物質(zhì)含量高于輪作土壤[29-30]。因此,化感自毒物質(zhì)的積累是誘導(dǎo)青枯病發(fā)生的重要因素之一。

      已報道鄰苯二甲酸酯具有類激素作用,長期接觸會對人體和其他生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生較大影響[31],而且鄰苯二甲酸二丁酯為鄰苯二甲酸酯的衍生物,是一類重要的化感自毒物質(zhì)[21]。雖然已有報道指出芳香族化合物如苯甲酸等對青枯菌具有趨化性,但鄰苯二甲酸二丁酯促進(jìn)青枯病的發(fā)生機(jī)制尚不明確。為此,以鄰苯二甲酸二丁酯為靶標(biāo)物質(zhì),分析了鄰苯二甲酸二丁酯對青枯菌的趨化誘導(dǎo)作用,并通過篩選高效降解菌降解土壤中的鄰苯二甲酸二丁酯,旨在為煙草青枯病綠色防控提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料、試劑和儀器

      土壤樣品取自于湖北大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院排污口、沙湖及垃圾堆,將所得土壤置于250 mL 滅菌的三角瓶中,4 ℃保存。供試煙草品種為云煙87。病原菌來源:青枯菌病原菌HF1-1 由湖北省煙草科學(xué)研究院提供。

      試驗所用試劑均購自國藥集團(tuán)有限公司。儀器:高效液相色譜儀(HPLC,美國安捷倫科技有限公司);電子分析天平ME204E(感量0.000 1 g,上海梅特勒-托勒多儀器有限公司);pH 計(梅特勒-托勒多儀器有限公司);722 型分光光度計(梅特勒-托勒多儀器有限公司);恒溫培養(yǎng)箱LRH-70(上海索普儀器有限公司);SIMCABLE8 超純水儀(美國Thermo 公司);HQL300B 恒溫大幅度振蕩搖床(武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司);低溫離心機(jī)(美國Scjlogex 公司)。

      TTC 培養(yǎng)基(病原菌培養(yǎng)基)、基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[32-33]配制。

      1.2 方法

      1.2.1 鄰苯二甲酸二丁酯處理后青枯菌生物量和趨化效應(yīng)分析

      配制鄰苯二甲酸二丁酯含量分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 和4.5 mg/L 的NA 液體培養(yǎng)基,然后接種1 mL 青枯菌液(1.0×109CFU/mL),30 ℃培養(yǎng)24 h 后取菌懸液稀釋10 倍,在波長600 nm 下測定青枯菌的菌液濃度(CFU/mL)。

      采用NA 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)青枯菌至OD600為1.0,將菌液離心后用等體積磷酸緩沖液(100 mmol/L,pH 7.0)重懸,靜置于無菌培養(yǎng)皿中。選用內(nèi)徑為1 mm 的滅菌毛細(xì)管,在管中吸入濃度為100 μmol/L 的鄰苯二甲酸二丁酯溶液,并垂直浸于青枯菌培養(yǎng)液培養(yǎng)皿內(nèi),靜置40 min,用注射器將毛細(xì)管內(nèi)的液體移出,稀釋為1×10-5后涂布于含有TTC 的NA 固體平板上,30 ℃培養(yǎng)18 h 后計數(shù)。每處理3 次重復(fù),以PBS 緩沖液為對照。

      1.2.2 鄰苯二甲酸二丁酯降解菌篩選和培養(yǎng)條件優(yōu)化

      1.2.2.1 降解菌篩選

      將收集的土壤分別取10 g,放于90 mL 滅菌去離子水中,180 r/min 振蕩過夜獲得菌懸液。吸取菌懸液10 mL 分別接種到鄰苯二甲酸二丁酯濃度為800 mg/L 的LB 培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 后再吸取菌懸液100 μL 進(jìn)行第二次馴化,如此循環(huán)7 次,參考文獻(xiàn)[34]進(jìn)行馴化。從終濃度的各培養(yǎng)基中吸取100 μL 的菌懸液涂布于含有600 mg/L 鄰苯二甲酸二丁酯的固體培養(yǎng)基中,反復(fù)純化多次分離,挑選形態(tài)鮮明、菌落清晰的不同單菌落。在LB 培養(yǎng)液中富集培養(yǎng)。以鄰苯二甲酸二丁酯為唯一碳源,將挑選的各個菌置于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液中,30 ℃230 r/min 培養(yǎng)18 h,觀察菌液濁度,最終篩出可降解鄰苯二甲酸二丁酯的降解菌。

      1.2.2.2 鄰苯二甲酸二丁酯降解效率檢測

      降解菌經(jīng)LB 培養(yǎng)液富集培養(yǎng),在鄰苯二甲酸二丁酯終濃度為300 mg/L 的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中,接種降解菌1 mL(1.0×109CFU/mL),30 ℃230 r/min 培養(yǎng)48 h。利用乙酸乙酯萃取培養(yǎng)液中殘余的鄰苯二甲酸二丁酯后,離心沉淀菌體,取上清液,用0.22 μm 的濾膜過濾,收集濾液待測。

      采用高效液相色譜法(HPLC)測定鄰苯二甲酸二丁酯含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。液相條件為:流動相比例為甲醇∶水為95∶5,流速1 mL/min,波長245 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18)為5 μm,4.6mm×250 mm。

      1.2.2.3 菌種鑒定

      參照文獻(xiàn)[35]進(jìn)行細(xì)菌生理生化指標(biāo)鑒定。

      分子生物學(xué)鑒定:通過DNA 提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)得到目標(biāo)菌株(編號Ed2)的基因組,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:DNA模板5 μL,正反向引物各1 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,10xExtaq buffer 5 μL,Extaq 1 μL,加ddH2O補(bǔ)足體系至50 μL。引物序列:27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3';擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min,61 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min;30 個循環(huán),72 ℃延伸5 min,4 ℃保存30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物的大小為1 450 bp 左右。同時由武漢擎科生物公司測序該產(chǎn)物大小為1 401 bp,并與GenBank中的16S rRNA序列進(jìn)行比對。

      1.2.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

      在LB 固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行降解菌的活化,并轉(zhuǎn)移到LB 液體培養(yǎng)基中作為種子液,檢測單因素條件下Ed2 菌的生長狀況。

      (1)接種1 mL 青枯菌液(1.0×109CFU/mL)至LB 培養(yǎng)液中,在溫度分別為18、30、37 和45 ℃,230 r/min 條件下培養(yǎng),每隔4 h 取樣,測定OD600時青枯菌液濃度,每組設(shè)置3 次重復(fù);(2)接種1 mL青枯菌液至LB 培養(yǎng)液中,在pH 分別為4、5、6、7、8、9,230 r/min 條件下振蕩培養(yǎng),每隔4 h 取樣,測OD600時青枯菌液濃度,每組設(shè)置3 次重復(fù);(3)接種1 mL 青枯菌液至LB 培養(yǎng)液中,鄰苯二甲酸二丁酯的初始濃度分別為100、200、300、400、500 和600 mg/L,230 r/min 條件下振蕩培養(yǎng),每隔4 h 取樣,測定OD600值,每處理設(shè)置3 次重復(fù)。(4)青枯菌液接種量按培養(yǎng)液體積的0.6%、1.2%、1.8%、2.4%接種至LB 培養(yǎng)液中,30 ℃230 r/min 條件下振蕩培養(yǎng),每隔4 h 取樣,測定OD600值,每處理設(shè)置3 次重復(fù)。

      1.2.2.5 鄰苯二甲酸二丁酯解降特性分析

      在優(yōu)化條件下,按照1.2.2.2 節(jié)描述的方法測定鄰苯二甲酸二丁酯降解率。

      1.2.3 盆栽試驗

      選擇生長健壯一致的5 片真葉期煙苗移栽至直徑12 cm、高16 cm 的盆缽中,每盆1 株,按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。試驗共設(shè)置3 個處理。對照(CK):基質(zhì)土壤中添加青枯菌(1.00×1010CFU/mL);處理1(T1):青枯菌+鄰苯二甲酸二丁酯;處理2(T2):青枯菌+鄰苯二甲酸二丁酯+Ed2 菌。各處理中青枯菌菌懸液土壤接種量為10 mL(1.00×1010CFU/mL),鄰苯二甲酸二丁酯添加量為10 mL(600 mg/L),Ed2 菌接種量為10 mL(1.00×1010CFU/mL)。

      煙苗移栽15 d 后,參考文獻(xiàn)[36]的方法,每7 d調(diào)查青枯病的發(fā)病情況并計算青枯病發(fā)病率。

      發(fā)病率=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%

      每個處理煙苗10 株,重復(fù)5 次,共計150 株。參照文獻(xiàn)[37]的方法,隨機(jī)抽取煙株3株,收集根際土壤各10 g。所取土樣分為兩份,一份加入無菌水90 mL 振蕩3 h,然后取懸濁液100 μL,涂布含TTC的NA 平板,30 ℃培養(yǎng)18 h 后統(tǒng)計青枯菌數(shù)量。另一份測定鄰苯二甲酸二丁酯含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

      鄰苯二甲酸二丁酯含量測定:利用乙酸乙酯萃取第二份收集的土壤中鄰苯二甲酸二丁酯,然后利用HPLC 法測定土壤鄰苯二甲酸二丁酯含量動態(tài)變化,HPLC 法測定條件參照1.2.2.2 節(jié)。

      1.2.4 數(shù)據(jù)處理

      采用SPSS19.0 軟件和Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)的描述統(tǒng)計分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 鄰苯二甲酸二丁酯對青枯病的影響

      2.1.1 鄰苯二甲酸二丁酯對青枯菌的生長和趨化效應(yīng)分析

      圖1 顯示,隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度增加,青枯菌的菌液濃度先增加后減少,在鄰苯二甲酸二丁酯濃度為3.5 mg/L 時菌液濃度OD600為9.17±0.19(圖1 a),表明低濃度的鄰苯二甲酸二丁酯可以促進(jìn)青枯菌生長,而高濃度則抑制青枯菌生長,與于妍華等[38]研究結(jié)果基本一致,說明鄰苯二甲酸二丁酯是青枯菌生長的營養(yǎng)物質(zhì);在毛細(xì)管中添加鄰苯二甲酸二丁酯,青枯菌的平均數(shù)量為(2.03±0.842)×107CFU/mL,明顯高于對照[CK,(3.63±1.67)×106CFU/Ml)(圖1 b),與李石力[23]和張克勤等[27]的試驗結(jié)果基本一致,說明鄰苯二甲酸二丁酯對青枯菌具有趨化誘導(dǎo)作用,也解釋了連作條件下隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的增高,青枯病發(fā)病率也顯著升高的內(nèi)在原因[28,30]。

      圖1 鄰苯二甲酸二丁酯對青枯菌的生物量影響(a)和趨化誘導(dǎo)(b)Fig.1 Influences of dibutyl phthalate on biomass(a)of R.solanacearum and the chemotaxis-inducing effects(b)

      2.2 降解菌篩選鑒定與培養(yǎng)條件優(yōu)化

      2.2.1 菌株篩選

      以鄰苯二甲酸二丁酯為唯一碳源,從土壤中篩選獲得鄰苯二甲酸二丁酯降解菌4 株,HPLC 檢測結(jié)果顯示,鄰苯二甲酸二丁酯液相出峰時間為3.8 min 左右,根據(jù)HPLC 峰面積百分比確定1 號菌為高效降解菌(表1),該菌株在48 h 內(nèi)降解效率為89%(圖2 a),該菌株編號為Ed2。

      表1 鄰苯二甲酸二丁酯降解效率Tab.1 Degradation rate of dibutyl phthalate

      圖2 鄰苯二甲酸二丁酯降解率的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms on degradation of dibutyl phthalate

      2.2.2 菌株的生理生化鑒定

      Ed2 菌在LB 培養(yǎng)基平板上菌落呈現(xiàn)乳白色,顯微鏡下觀察呈球桿狀,革蘭氏染色呈陰性,能夠利用葡萄糖、木糖、乳糖等,見表2。

      表2 菌株的生理生化特性①Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of Ed2 strain

      將菌株Ed2 的16SrRNA 基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,序列登錄號為MK729019.1,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析結(jié)果顯示:菌株Ed2與不動桿菌Acinetobacter nosocomialis strain RUH2376 在同一個分支上,序列相似性為80%,根據(jù)結(jié)果可以得知菌株Ed2 歸于不動桿菌屬(圖3),并命名為Acinetobacter sp.Ed2。

      圖3 Ed2 菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic analysis of Acinetobacter sp.Ed2

      2.2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

      經(jīng)過培養(yǎng)及條件優(yōu)化,鄰苯二甲酸二丁酯的初始濃度為300 mg/L 時,Acinetobacter sp.Ed2 生長狀況最好(圖4 a);其能耐受的pH 范圍為5.0~9.0。當(dāng)培養(yǎng)基pH 為7.0 時,Acinetobacter sp.Ed2 生長狀況最好(圖4 b);在30 ℃條件下培養(yǎng)生長狀況最好(圖4 c);在接種量為2.4%時生長狀況最好(圖4 d)。

      圖4 不同培養(yǎng)條件下Acinetobacter sp.Ed2 生物量變化Fig.4 Biomass changes of Acinetobacter sp.Ed2 under different culture conditions

      2.2.4 Acinetobacter sp.Ed2 降解鄰苯二甲酸二丁酯的特性

      Acinetobacter sp.Ed2 經(jīng)培養(yǎng)48 h 后通過HPLC檢測,發(fā)現(xiàn)溫度在30 ℃、接種量2.4%和pH7 時分別表現(xiàn)出較高的降解效果,其降解率分別為81.97%±8.1%、89%±4.15%和66.23%±6.4%,見圖5。

      圖5 不同條件下Acinetobacter sp.Ed2 對鄰苯二甲酸二丁酯的降解特性Fig.5 Acinetobacter sp.Ed2's degradation characteristics to dibutyl phthalate under different conditions

      2.3 降解菌處理后青枯病發(fā)病率及病原菌豐度的動態(tài)變化

      2.3.1 土壤中鄰苯二甲酸二丁酯降解分析

      土壤中T1 處理鄰苯二甲酸二丁酯殘留率為36.68%±2.31%,T2 處理鄰苯二甲酸二丁酯殘留率為17.90%±1.99%,Acinetobacter sp.Ed2 對鄰苯二甲酸二丁酯的降解率為51.17%(圖6 c),說明Acinetobacter sp.Ed2 能在土壤中發(fā)揮降解作用。

      圖6 土壤中鄰苯二甲酸二丁酯的降解效果Fig.6 Degradation efficiency analysis of dibutyl phthalate in soil by HPLC

      2.3.2 青枯菌病原菌豐度動態(tài)變化

      圖7 表明,CK 青枯菌菌落數(shù)量為(3.84±0.12)×108CFU/mL,T1 處理青枯菌菌落數(shù)量為(6.14±0.74)×108CFU/mL,T2 處理青枯菌菌落數(shù)量為(5.9±1.65)×107CFU/mL。T1 處理青枯菌數(shù)量顯著高于CK(P=0.03),提高59.89%;T2 處理青枯菌數(shù)量顯著低于CK(P<0.01)和T1 處理(P=0.04),分別降低84.63%和90.38%。說明降低土壤中鄰苯二甲酸二丁酯可以有效降低青枯病病原菌的數(shù)量。

      圖7 不同處理土壤中青枯菌豐度及青枯病發(fā)病率的變化Fig.7 Changes of pathogen abundances of R.solanacearum in soil and incidences of bacterial wilt under different treatments

      2.3.3 煙草青枯菌發(fā)病率動態(tài)變化

      青枯病發(fā)病率分析結(jié)果表明,CK 青枯病發(fā)病率為44.68%±6.5%;T1處理青枯病發(fā)病為69.39%±10.9%;T2 處理青枯病發(fā)病率為29.35%±9.2%。T1 處理青枯病發(fā)病率顯著高于CK(P<0.01),提高55.30%;T2 處理青枯病發(fā)病率顯著低于CK(P=0.02)和T1 處理(P<0.01),分別降低52.23%和136.42%。這與劉艷霞等[22]和李石力[23]的研究結(jié)果基本一致,說明根系分泌的化感自毒物質(zhì)積累是導(dǎo)致土壤病原微生物數(shù)量增加的重要原因,切斷青枯菌的趨化效應(yīng)物質(zhì)可以達(dá)到防治青枯病的目的。

      3 結(jié)論

      盆栽試驗結(jié)果表明,鄰苯二甲酸二丁酯是青枯菌生長的重要營養(yǎng)物質(zhì),低濃度條件促進(jìn)青枯菌生長,高濃度則抑制青枯菌生長;鄰苯二甲酸二丁酯對青枯菌具有誘導(dǎo)趨化作用,是誘導(dǎo)和促進(jìn)青枯菌煙草根際定殖的重要因素;利用鄰苯二甲酸二丁酯高效降解菌降解土壤中的鄰苯二甲酸二丁酯,可以顯著降低土壤中青枯菌豐度和煙草青枯病的發(fā)病率。

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