經(jīng)肺泡灌洗液高通量測序診斷嬰兒肺孢子菌肺炎1 例并文獻復(fù)習(xí)

朱其國 袁 林 周峻荔 康小俊 白定珍 王立波

1.廈門市兒童醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院廈門分院呼吸科（福建廈門 361006）；2.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院呼吸科（上海 201100）

肺孢子菌肺炎（pneumocysitis pneumonia，PCP），過去稱之為卡氏肺孢子（囊）蟲肺炎，是一種發(fā)生于免疫功能低下患者的嚴重肺部機會性感染。PCP常見于人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者，曾被視為艾滋?。╝cquired immune deficiency syndrome，AIDS）的“標志病”[1]。自發(fā)達國家對 HIV 感染者施行PCP 預(yù)防措施和高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療，以及惡性腫瘤放化療患者、器官移植者、長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的自身免疫性疾病等免疫低下人群的擴大，非HIV感染者的PCP發(fā)病率逐漸增多[2-5]。對于非HIV感染的免疫功能低下患兒，PCP發(fā)病急，進展快，易誤診[6]，易并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），甚至多臟器功能障礙[7]。PCP的及時診斷和治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵，但PCP 臨床表現(xiàn)缺乏特異性，早期診斷有一定困難?，F(xiàn)回顧總結(jié)1例PCP患兒的臨床經(jīng)過。

1 臨床資料

患兒，男，2 個月20 天，因反復(fù)咳嗽2 月余入院。患兒系G2P2，39周順產(chǎn)，出生體質(zhì)量2 900 g，無宮內(nèi)窘迫，無窒息搶救史?；純河诔錾?6天時因接觸感冒家屬出現(xiàn)咳嗽，經(jīng)口服頭孢克肟及布地奈德、沙丁胺醇、異丙托溴胺霧化治療無好轉(zhuǎn)，咳嗽逐漸呈陣發(fā)性痙攣性咳嗽；血常規(guī)提示白細胞明顯升高，淋巴細胞為主，C 反應(yīng)蛋白無異常；胸片提示支氣管炎。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷肺炎、類百日咳綜合征，住院治療25 天。期間患兒白細胞計數(shù)最高達54.6×109/L，淋巴細胞68.9%，未查到明確的病原體；經(jīng)抗感染、人免疫球蛋白支持、甲基潑尼松龍抗炎、霧化對癥治療后，患兒咳嗽好轉(zhuǎn)；出院前血常規(guī)白細胞降至20.4×109/L，淋巴細胞67.6%，出院后繼續(xù)口服阿奇霉素治療3 個療程（用3 天停4 天為一療程），期間仍有少許間斷咳嗽，血常規(guī)白細胞最低降至17.13×109/L。入院前5天患兒咳嗽漸加重，血常規(guī)白細胞20.26×109/L，淋巴細胞44.94%；當(dāng)?shù)蒯t(yī)院給予紅霉素抗感染治療后仍有咳嗽，并出現(xiàn)煩躁、精神欠佳，遂轉(zhuǎn)入廈門市兒童醫(yī)院住院治療。

入院體格檢查：神清，精神反應(yīng)欠佳，呼吸急促，輕度三凹征，無紫紺，皮膚無異常，心率141次/min，心、腹無異常，神經(jīng)系統(tǒng)無異常。實驗室檢查：血常規(guī)白細胞22.45×109/L，中性粒細胞79.3%，C反應(yīng)蛋白無異常；血氣分析動脈氧分壓56.2 mmHg；余生化常規(guī)、體液免疫、淋巴細胞亞群、凝血功能等均無異常。胸片示雙肺彌漫浸潤影。心臟彩超無異常。肺部CT提示：雙肺彌漫浸潤影（圖1）。血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)、鼻咽吸取物呼吸道病毒抗原及PCR檢測均未明確病原體。

入院后給予鼻導(dǎo)管吸氧、抗感染、甲基潑尼松龍抗炎、霧化等常規(guī)治療，患兒咳嗽氣促無好轉(zhuǎn)，復(fù)查肺部影像提示雙肺彌漫浸潤加重。經(jīng)家長知情同意后，予支氣管鏡檢查。支氣管鏡下見兩側(cè)支氣管黏膜均明顯蒼白；取肺泡灌洗液，經(jīng)宏基因組高通量測序檢測明確病原體。結(jié)果顯示：肺孢子菌屬序列數(shù)1012，其中耶氏肺孢子菌檢出序列數(shù)為1007。結(jié)合患兒臨床情況，肺孢子菌肺炎診斷成立。換用甲氧芐胺嘧啶-磺胺甲噁唑合劑（TMP-SMZ），15～20/75～100 mg/(kg·d)，分2次口服。治療5天后，患兒咳嗽氣促精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，可以脫氧；血常規(guī)白細胞降至19.09×109/L，中性粒細胞68.2%；肺部影像雙肺浸潤好轉(zhuǎn)。出院后，按上述劑量繼續(xù)口服TMP-SMZ，療程共21 天。出院1 周后患兒偶有間斷咳嗽，無氣促；血常規(guī)白細胞降至11.57×109/L，淋巴細胞72.9%，肝腎功能無異常。出院后5 個月再隨訪，患兒無咳嗽，精神佳；肺部CT提示肺部浸潤基本吸收（圖1）。

圖1 患兒肺部CT 表現(xiàn)

患兒住院期間曾行血全外顯子基因檢測，未檢出與患兒臨床表型相關(guān)的致病/疑似致病變異；檢出與裸淋巴細胞綜合征2型相關(guān)的CIITA基因變異類別為雜合，目前沒有該變異致病性的相關(guān)報道，故被認為意義未明的變異。

2 討論

20 世紀初Chagas 和Cariniit 首次從豚鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)病原，1912 年Delanogs 夫婦從大鼠肺中檢出，進一步證實其為一種新的病原體，并將其命名為卡氏肺孢子蟲（Pneumocystis carinii，Pc）[8]。因Pc具有原蟲的典型形態(tài)特征，故一直被認為是原蟲。1952年Vanek 和Jirovec 首次從人類肺炎患者組織中分離到該病原體，并命名卡氏肺孢子蟲肺炎（PCP）。1976年Frenkel 等報道人與鼠的肺孢子蟲在形態(tài)學(xué)、免疫原性等方面均有不同，可與鼠感染的肺孢子相區(qū)分，F(xiàn)renkel 提議感染人的肺孢子蟲命名為伊氏肺孢子蟲（Pneumocysitis jiroveci，PJ）以紀念Jirovec 首次確認人體感染肺孢子蟲，但未被廣泛認可。1988年Stringer分析其16 SrRNA 序列，證實Pc 不是原蟲而是一種真菌。2001年在美國召開的關(guān)于機會性原生生物國際研討會上，與會者一致同意將感染人的肺孢子蟲命名為PJ，感染大鼠的肺孢子蟲定義為Pc。同時肺孢子蟲肺炎的英文縮寫仍為PCP（pneumocysitis pneumonia）。現(xiàn)其分類地位已明確，故感染人肺孢子蟲稱人肺孢子菌（PJ），其所致肺炎稱肺孢子菌肺炎（PCP）[9-11]。

PCP 主要見于免疫功能低下人群的機會性感染，主要見于：①早產(chǎn)新生兒和嬰兒；②先天免疫功能缺陷者；③惡性腫瘤繼發(fā)性免疫缺陷病，如白血病、淋巴瘤患者；④器官移植后接受免疫抑制劑治療者；⑤HIV患者等[12-13]。在一些PCP臨床研究中均提到肺部疾病是PCP 的基礎(chǔ)疾病，包括結(jié)核、巨細胞病毒肺炎等重癥肺部感染，慢性阻塞性肺疾患，囊性纖維化，支氣管擴張，支氣管哮喘，間質(zhì)性肺炎，以及長期機械通氣等[14-15]。先前肺部疾病已成為非HIV感染PCP的一項新的危險因素。國內(nèi)曾報道10 例非HIV 感染的PCP 患兒中有3 例基礎(chǔ)疾病為重癥肺炎，如麻疹病毒肺炎、腺病毒肺炎[7]。本例患兒僅3月齡，入院前在外院診斷“肺炎，類百日咳綜合征”住院治療1 月余，住院期間短期使用靜脈激素治療，但住院期間及出院后長期使用抗生素及激素霧化治療。由于患兒在外院治療時并未明確查出肺炎病原體，因此不能完全確定患兒是從新生兒期開始就患上肺孢子菌感染，還是因大量長期應(yīng)用抗生素后繼發(fā)肺孢子菌感染。患兒在新生兒期時的咳嗽表現(xiàn)為陣發(fā)性痙攣性咳嗽，血常規(guī)提示白細胞及淋巴細胞比例均很高，經(jīng)過治療患兒癥狀有緩解，且血常規(guī)亦提示白細胞下降，后出現(xiàn)咳嗽反復(fù)伴煩躁，白細胞再次升高且以中性粒細胞比例增高為主，綜合以上病情發(fā)展，考慮患兒在“肺炎、類百日咳綜合征”且長期使用抗生素基礎(chǔ)上，繼發(fā)感染肺孢子菌。入院后經(jīng)相關(guān)檢查，排除患兒有先天性免疫缺陷等基礎(chǔ)疾病，血全外顯子基因未檢測出與患兒臨床表型相關(guān)的致病/疑似致病變異，檢出的與裸淋巴細胞綜合征2 型相關(guān)的CIITA基因變異類別為雜合，目前沒有該變異致病性的相關(guān)報道，故被認為意義未明的變異。

PCP的臨床表現(xiàn)傳統(tǒng)分為流行型（經(jīng)典型或嬰兒型）和散發(fā)型（免疫功能抑制型）。流行型主要為早產(chǎn)兒、營養(yǎng)不良和虛弱兒童，年齡多在2～6月齡間，起病緩慢，主要癥狀為納差、煩躁不安、咳嗽、氣促及發(fā)紺，而發(fā)熱不顯著；肺部體征少，與呼吸窘迫癥狀嚴重程度不成比例為PCP流行型的特點之一。散發(fā)型PCP好發(fā)于免疫缺陷的兒童和成人，此類型中的HIV感染和非HIV感染者的免疫抑制宿主并發(fā)PCP的臨床表現(xiàn)、病程進展及預(yù)后有所不同。HIV 感染并發(fā)PCP 時，潛伏期4周，起病較平緩，多為低熱，低氧血癥相對較輕，肺內(nèi)菌負荷量低，TMP-SMZ治療反應(yīng)慢，不良反應(yīng)多，病死率相對低；而非HIV 感染的免疫抑制患者并發(fā)PCP時，潛伏期2周，起病較急，短期內(nèi)迅速出現(xiàn)呼吸衰竭，嚴重低氧血癥，肺內(nèi)菌負荷量高，TMP-SMZ治療反應(yīng)佳，病死率相對高[16]。

PCP的影像學(xué)表現(xiàn)主要為彌漫性肺間質(zhì)浸潤，典型X線胸片改變?yōu)殡p側(cè)彌漫性顆粒狀陰影，自肺門向周圍伸展，呈毛玻璃樣，伴支氣管充氣像，之后變成致密索條狀，索條間有不規(guī)則片塊狀影。肺部高分辨CT可見廣泛毛玻璃狀改變和囊泡狀損害[17]。

本例患兒主要突出的臨床表現(xiàn)為咳嗽、氣促、煩躁、低氧血癥，但無發(fā)熱。結(jié)合患兒年齡及未檢測到有意義的免疫功能低下，更符合流行型（經(jīng)典型或嬰兒型）。X線胸片提示彌漫性肺間質(zhì)浸潤，肺部高分辨CT 則提示彌漫性的毛玻璃樣改變，與文獻報道基本相符。

由于PCP臨床表現(xiàn)缺乏特異性，所以診斷主要依賴病原學(xué)檢測。目前檢測的標本主要是痰液、支氣管肺泡灌洗液和各種肺活檢標本，其中支氣管肺泡灌洗液是多數(shù)患者的首選[18]。傳統(tǒng)檢測方法是借助特殊染色（姬姆薩、哥氏銀染、甲苯胺藍等），對標本進行鏡檢尋找病原體，但因敏感性、特異性較低導(dǎo)致檢出率較低。PCR檢測方法較常規(guī)的特殊染色后鏡檢敏感性高，報告時間短，但假陽性問題較為突出，常常不能區(qū)分是否為定植或活動性感染，且目前商用試劑盒主要以檢測病毒及支原體為主。高通量測序技術(shù)發(fā)展，為臨床感染性疾病診斷帶來了突破性變革。針對臨床病原微生物主要采用宏基因組高通量技術(shù)（metagenomic next-generation sequencing，mNGS），可同時檢測細菌、病毒、支原體、真菌等所有臨床已知及未知的病原微生物[19]。mNGS在真菌高通量檢測方面的靈敏度和特異度都顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，且檢測結(jié)果不易受抗生素的影響[20]。但因部分病原尤其真菌細胞壁不易被打破，核酸提取困難，故對于胞內(nèi)菌或罕見病原體診斷尚存在一定欠缺，且成本較高，無統(tǒng)一的參數(shù)設(shè)置和質(zhì)量控制[21]，無公認的判讀標準[22]，臨床上對結(jié)果的解讀一定要結(jié)合臨床資料。本例患兒在入院后先后經(jīng)歷常規(guī)的痰液標本的鏡檢及培養(yǎng)、免疫熒光法檢測病毒抗原、PCR 方法檢測病毒支原體細菌，均未明確感染的病原體；常規(guī)抗感染及其他治療無效；支氣管肺泡灌洗液進行mNGS 檢測發(fā)現(xiàn)肺孢子菌屬序列數(shù)1 012，其中耶氏肺孢子菌檢出序列數(shù)為1 007；從而確立了PCP的診斷。

PCP 病原治療首選TMP-SMZ[23]，其作用機制為TMP和SMZ分別作用于肺孢子菌的二氫葉酸還原酶和合成酶，阻斷葉酸合成，從而干擾蛋白質(zhì)的合成，起到殺菌作用。TMP-SMZ用藥劑量為15～20/75～100 mg/(kg·d)，根據(jù)病情輕重可選擇口服或靜脈滴注，療程為2～3 周。本例患兒在確診后按上述劑量給與TMPSMZ口服治療5天后臨床癥狀即緩解，胸部X線吸收好轉(zhuǎn)，治療21 天后停藥；后續(xù)隨訪至出院后5 個月肺部CT肺部滲出已經(jīng)基本吸收。

綜上所述，PCP 可見于免疫功能無異常、有肺部基礎(chǔ)疾病的嬰兒。臨床上對于反復(fù)咳嗽、氣促、低氧血癥，影像學(xué)提示雙肺彌漫性浸潤影的患兒需考慮到PCP可能。肺泡灌洗液mNGS檢測對PCP有較高的診斷價值。確診PCP后需盡量尋找基礎(chǔ)疾病和可能的病因，首選治療藥物是TMP-SMZ。